（遗传学专业论文）f0f1atp合酶的纯化和应用研究.pdf

摘要 a t p 合酶( f o f l a t p a s e ) 广泛分布于生物体内，是能量代谢的关键酶。它是一 个多亚基复合体，按照极性a t p 合酶( f o f l a t p a s e ) 可分为在膜外亲水部分和结合 于细胞膜上的疏水部分，这一特性也使得其纯化比较复杂。本文分别通过两种方 法对这一蛋白进行纯化：一种是通过突变的方法对带有a t p 合酶全酶基因的质粒 进行改造，在c 亚基上引入组氨酸标签。随后通过n i - n t a 柱利用亲合层析的方 式纯化蛋白，以其中带有h i s 标签的亚基为结合对象而纯化出整个酶：另外一种 是针对野生型嗜热菌( t h e r m o m i c r o b i u mr o s e u m ) 设计的方法。先在较高温度下 进行筛选并继续培养该菌株，收集足够菌体后进行破碎和离心处理，得到中间产 物载色体。除满足随后试验需要外，还可继续利用该中间产物经过离心、离子交 换柱等步骤对其中所含的a t p 合酶进行纯化。 依据其催化机理与结构，a t p ( f o f l a t p a s e ) 合酶可分为“定子 ( a b 26q3b3 ) 和“转子( y c n ) 两部分。研究表明在其中的1 3 亚基上连接 不同负载时，可以不同程度影响其a t p 合成活性。因此在得到具有生物学活性的 较纯f o f l a t p a s e 酶的基础上，结合免疫学和生物化学的方法，构建的i r b 可以 通过“b 亚基抗体一生物素一亲和素一生物素- c l 抗体( t f i b a n t i b o d y b i o t i n s t r e p t a v i d i n b i o t i n c la n t i b o d y ) ”探测相特异原。利用a t p 合酶 在a t p 合成过程中的质子转运特性检测荧光探针信号变化来反映，因此极大提高 了检测灵敏度。 利用对p h ( 酸性) 敏感的荧光染料q d s 的光学性质标记该探测器，并在对 其进行简单光学编码的工作上做了初步研究。这为进一步将旋转分子马达应用到 复杂的实际情况下，作为病毒探测工具做出了一些有益尝试，并获得了一些有价 值的研究结果。 关键词：f o f i a t p a s e 结构纯化编码 1 1 i a b s t r a c t a t ps y n t h a s e ，o rf o fi a t p a s ei sak e ye n z y m ei nc e l l u l a re n e r g ym e t a b o l i z e i ti sa c o m p l e xw i t hs e v e r a ls u b u n i t sa n dw i d e l yd i s t r i b u t e di na l m o s ta l lk i n d so fo r g a n i s m s a c c o r d i n gt o i t sp o l a r i t y , i tc a nb ed i v i d e di n t ot w om a j o rs e c t i o n sw h i c ha l e h y d r o p h i l i es e c t i o no u t s i d et h em e m b r a n ea n dh y d r o p h o b i cs e c t i o no nt h em e m b r a n e ， r e s p e c t i v e l y t h i sc h a r a c t e r i s t i cm a k e si t sp u r i f i c a t i o nb e c o m ec o m p l i c a t e d 嬲w e l l i n t h i st h e s i s ，w em a n a g e dt op u f f yt h ee n z y m ei nt w od i f f e r e n tw a y s ：i nt h ef i r s t m e t h o d ，ap l a s m i dw h i c hc o n t a i nt h ec o m p l e t es e q u e n c eo fa t ps y n t h a s ec o m p l e xi s c o n s t r u c t e d ，i nw h i c hah i st a gi sa d d e di n t ot h es u b u n i tcb yt h em u t a t i o n t h e n ， p u r i f yt h et a g g e dp r o t e i nb yn i 2 + - n t aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h es e c o n di st o d e s i g nas p e c i a lm e t h o df o raw i l dt y p et h e r m o p h i l i cc a l l e dt h e r m o m i c r o b i u m r o s e u m a f t e rt h es e l e c t i o na n dc u l t i v a t i o na tah i 【曲t e m p e r a t u r e ，w ec r u s ht h ec e l l m e m b r a n eb yu l t r a s o n i ca n dc o l l e c tt h ec h r o m o t a p h o r e s 部t h ei n t e r m e d i a t eb y c e n t r i f u g a t i o n t h ec h r o m o t a p h o r e sc a nb eu s e de i t h e rt op u r i f yt h ep r o t e i no rt h ei b r c o n s t r u c t i o n a c c o r d i n gt oi t s s t r u c t u r ea n dc a t a l y t i cm e c h a n i s m ，a t ps y n t h a s ec a na l s ob e r e c o g n i z e d 硒ac o m b i n a t i o no ft w os e c t i o n s t h es t a t o r ( a b 2 s a 3 f h ) a n dt h er o t o r ( t e e n ) f u n c t i o n i n gt o g e t h e r r e s e a r c hs h o w e dt h a td i f f e r e n tl o a dc o m b i n e dt ot h e1 3s u b u n i t c a nc a u s ed i f f e r e n tr e s u l td u r i n gt h ea t ps y n t h e s i z e w h e ng e r i n gt h ep u r ep r o t e i n w i t hb i o l o g i c a la c t i v i t y , w ec o n s t r u c t e da ni m m u n o r o t a r yb i o s e n s o r ( i r b ) b a s e do n f o f l - a t p a s ew i t hi m m u n o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e c h n i q u e s t h ec o n s t r u c t i o n ， t fl1 3a n t i b o d y - - b i o t i n - s t r e p t a v i d i n b i o t i n - c la n t i b o d yc a l lb eu s e dt ob i n d i n gt h e s p e c i f i ca n t i g e n b yd e t e c t i n gt h es i g n a lo ff l u o r e s c e n c ep r o b ew h i c hi sa f f e c t e db y t h e 矿i nm e p r o c e s so f a t ps y n t h e s i z e ，t h ed e t e c t i o nb e c o m em o r es e n s i t i v e w ea l s ot r yt ou s et h eq d sw i t hd i f f e r e n tw a v e l e n g t ht oe n c o d ei nas i m p l ew a y w h i c hi sab e n e f i c i a la t t e m p ti np r a c t i c a la p p l i c a t i o na n do b t a i ns o m ev a l u a b l er e s u l t s k e yw o r d s ： f o fi - a t p a s es t r u c t u r e p u r i f y e n c o d e i v 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文f o f l - a t p 合酶的纯化和应用研究，是在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的 个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ：甚专 2 0 0 9 c 月, - fh 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后适用本授权书) 论文作者( 签名) ：鸯与 2 0 0 9 白争日 c ：爱峰 2 0 0 9 年月碰日 。 i i 兀寻 、j 纩 g天咱 jr 名皿r鹕臼 i 、 - “年 诊 9确 d i y币 2 教导酱 第一章绪论 1 1 f o f l - a t p a s e f l j f j 结构和性质【l j a t p 合酶或h + a t p 酶、f o f i a t p 酶( a t ps y n t h a s e ) ，广泛存在于线粒体、1 绿体、原核藻、异养菌和光合细菌中，是生物体能量代谢的关键酶。该酶分别住 于类囊体膜、质膜或线粒体内膜上，参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应，在跨脑 质子动力势的推动下催化生物体能源物质a t p 的合成。而a t p 是细胞进行各种 生命活动( 神经传导、肌肉收缩、物质运送等) 所必需的能源物质。如果说a t p 的重要性相当于生物体内的“货币”那么a t ps y n t h a s e 就是“印钞机 了。 据估计，人体每天进行正常活动所需的a t p 量约等于他的体重，如体重为7 5 k g ，则每天即需合成7 5 k g 的a t p ，当然合成的a t p 会被立刻消耗掉，用于人的运 动、呼吸等能量需求。在高等动物体内，线粒体在重要组织( 如肝脏、心脏、肾 脏、肌肉、脑等) 的细胞内都有分稚，每个肝细胞平均约含1 0 0 0 个线粒体，而每 个线粒体又有为数众多的a t p 合酶，因此a t p 合酶的总数是惊人的。它既能利用 跨膜h + 梯度合成a t p ，又能水解a t p 而反向转运h + 。a t p 合成的直接能量来源是 通过线粒体内膜、植物叶绿体类囊体膜和细菌质膜上电子传递链产生的电化学质 子梯度( ap ) ，而在某些微生物体中，n a + 离子梯度代替了一梯度。 r 1 1 1 1 1f o f l a t p a s e 的组成和结构1 a t p 合酶包括a 型、f 型和v 型，它们的结构非常相似，都包括一个暴露在胞 质侧的功能域( a l 、f l 或v 1 ) ，以及一个与膜结合的功能域( 、f o 或v 。) 。本文 研究的对象是f 型a t p 合酶，且, j l f o f i a t p 酶。f o f i a t p 酶的种属同源性很高，不同 物种来源的a t p 合酶基本上含有相同的亚基组成和结构。以牛心线粒体a t p 合酶为 例，它的f i 含有a 。、1 3 。、y 、6 和e 共9 个亚基，f o 含a 、b 2 、c l o 共1 3 个亚基， f 。与f 。之间有o s c p 柄相连接，还有抑制蛋白。线粒体f o f l a t p 酶的总分子量约为 5 0 0k o 。对大肠杆菌a t p 合酶的研究较为详尽，它的f l 含5 种亚基q 、b 、y 、6 、 ，分子量分别是5 5 3 、5 0 3 、3 1 6 、1 9 3 和1 4 9 k d 。准量关系为q3 、1 33 、y 、 6 和。f l 的总分子量为3 8 2 k d 。f o 由a 、b 、c3 种亚基组成，分子量分别为3 0 3 、 1 72 和83 k d ，准量关系为a ，b 2 ，c * mf o 的总分子量约为1 6 4 k d ，因此，太肠杆 菌f fa t p 酶的总分子量共为5 4 6 k d 。叶绿体a t p 酶由c f l 和c f 。两部分组成，它 们的亚基的组成和分子量与上述两种a t p 台酶太体相似，但又有一定的差异。 还以大肠丰t 菌a t p 合酶的结构为例【2 i 通常只是将其根据极性简单的分为 两个大的部分：膜内的疏水亚基f 。( a b 2 c ) 部分和膜外的亲水亚基r ( o3b3y6 部分。但是根掘c a p a l d i 实验室的研究结果和一些其他实验室的得到比较新的实 验数据1 3 一，以及人们提出了当前最新的结构模型n 如图l 所示。这个结构模 型的主要特点是将f o f - a t p 台酶分为定子( s t a t o r ) 和转子( r o t o r ) 两部分，从结构的 方面强调了f o f l a t f 酶是一个旋转生物分子马达。定子由f i 的o 】b36 和f o 的a b ：组成，转子由f l 的ye 和f 。的c 1 1 组成。f 口f l - a t p 酶的催化核，t l , 是n 。t 3 ，y ， 其中的n3b3 是。亚基和b 亚基交替排列的六聚体，而y 亚基螺旋的一端伸 进六聚体内部。a t p 的合成与水解发生在b 亚基的三个催化位点上州而质子 流动则发生在f 。部分的a 亚基和c 亚基之间。当前的模型认为质予的流动是通 过c 亚基环相对与a 亚基的旋转实现，c 亚基的6 1 位天冬氨酸( a s p ) 和a 亚基的 2 1 0 位精氨酸( a r g ) 是这个过程中的关键氮基酸。 a t p a d p + p 鬻鬓 h 图1 太肠丰t 菌f o f 。一a t p 台酶的结构m f i g1s t r u c t u r eo f ec o i lf o f ) 一a t p a s e 1 1 2f 。f l - a t p 合酶催化原理和研究进展 f 对于a t p 合酶的催化原理，目前得到比较多人认同的是化学渗透假说。 说起a t p 合酶的发现不得不说说线粒体，众所周知线粒体是为细胞提供能量 的动力工厂。耗氧细胞的氧化作用主要在线粒体中进行。以葡萄糖为例，它在线 粒体中全部氧化形成c 0 2 与h 2 0 。值得指出的是，生物氧化是逐步进行的，在此过 程中所释放的能量及时转化为能源物质a t p 。这个过程被称为氧化磷酸化。主要 氧化过程是通过线粒体内膜电子传递链来进行的，磷酸化则是由位于内膜的a t p 合酶来催化完成。它是1 9 6 0 - 1 9 6 1 年g r e e n 和f e m a n d e z m o r a n 等人通过低温电镜 与负染技术在牛心、鼠肝线粒体中发现的。当时对这些直径约为8 0 l o o a 的圆心 或多面形颗粒的功能并不清楚。后来美国的r a c k e r 将其可溶性部分加以分离， 并发现具有氧化磷酸化偶联的功能，称之为f l 因子( t l p f l - a t p 酶) 。经过大量工作 才了解a t p 合酶的组成除f 。外，还有嵌在线粒体内膜的f o ，故其全名为f o f l a t p 酶，它是磷酸化的关键装置。关于氧化磷酸化的机理，从2 0 世纪6 0 年代开始在很 长一段时间始终是生物能力学研究的一个活跃领域。1 9 6 1 年，英国生物化学家 p e t e rm i t c h e l l 提出化学渗透假说( c h e m i o s m o t i ch y p o t h e s i s ) 【9 】，它的主要内容是通 过线粒体内膜上呼吸链组分间氢与电子的交替传递，使质子( 矿) 从内膜内侧向 外侧定向转移，由于膜对h + 的不通透性，从而形成跨膜的质子梯差，或称为质子 动力势。因此，氧化所释放的能量首先转换为跨膜质子梯差，后者再通过a t p 合 酶催化形成a t p 。 而m i t c h e l l 的化学渗透假说经过较长时间，以及反复地论证与众多实验的反 复地检验，目前已经为大多数从事生物能力学的学者所接受，他本人也由此获得 1 9 7 8 年诺贝尔化学奖。但是对于跨膜质子梯差如何通过a t p 合酶催化合成a t p 的机 理，m i t c h e l l 虽然也做了一定的研究，并曾经提出一些设想，但并未得出明确的 结果。 1 1 2 1 构象变化假说，结合变构机理，旋转催化假说 “构象变化假说”【1 0 】是由美国的b o y e r 对a t p 合酶合成a t p 的机理作出研究 后提出的。他的实验室经过大量的生物化学与物理化学的研究，认为氧化所释放 的能量可能通过a t p 合酶的催化亚基的构象变化才导致a t p 的合成。该酶的3 个b 催化亚基的构象，在任何时刻是互不相同的，一个0 亚基的构象与a d p 有较大的 亲和力，另一个b 亚基构象有利于使结合上去的a d p 和p i 合成a t p ，第3 个1 3 亚 基的构象则可促进a t p 的释放。这一“构象变化假说”后来也被称为“结合变 构机理( b i n d i n gc h a n g e m e c h a n i s m ) ”：第一步，随着酶的构象变化，在催化位点 上疏松结合的a d p 和p l 与酶的结合变得紧密；第二步，紧密结合的a d p 和p i 被转 化成a t p ；第三步就是a t p 的释放。这个模型描述了每个催化亚基完成整个循环 所需要经过的反应步骤其中整个循环的三步反应中的每一步都涉及到酶的构象 变化。由于构象改变是紧密相连的，在任何时间酶的3 个催化位点都处在不同 的构象状态，而每个催化位点要经过3 次构象改变才催化合成一个a t p 。( 如 图2 ) “结合变构机理( b i n d i n g c h a n g e m e c h a n i s m ) ”的要点主要是以下两个： a t p 合成所需要的能量主要用于与酶分子紧密结合的a t p 的释放：在a t p 合成 过程中a t p 合酶分子的各催化部位是高度协同工作的 h , 1 2 。 b o y e r 凭借着这个模型的提出而分享了1 9 9 7 年诺贝尔化学奖。 b i n d i n g d p + p b i n d i n gc h a n g em e c h w u s m t ”日 t 出 h i n g i n g帮咻 图2a t p 合酶合成a t p 的“结合变构机理”示意图口 f i g2s c h e m e so f p o s s i b l e m e c h a n i s m s f o r a t ps y n t h e s i sa n d h y d r o l y s i s a t p 台酶的f l 部分由o3 1 33y6 几个亚基组成，其中的b 亚基是催化亚单 位。在b o y e r 提出的这个模型中，每个b 亚基具有松弛状态( 1 0 0 s e ) 、紧密结合 状态( t i g h t ) 和无底物与之结合状态( o p e n ) 。在任一时刻，3 个b 亚基的构象总 是互不相同的。每一0 催化亚基经过几次伴随构象改变而发生的结合变化最后形 成1 个a t p 分子。这样的过程反复进行以不断合成a t p 。 下面需要解决的问题就是，驱动3 个b 亚基构象和核苷酸结合的变化所需的 能量是以何种形式束提供的呢? b o y e r 后柬也同意m i t c h e l l 提出的化学渗透假 说。换言之，驱动a t p 酶f 一的8 亚基构象变化所需能量是由跨膜质子梯差提供的。 除此之外，为了满足“结合变构机理”所提出的3 个8 亚摹不断交替呈现不同构 象的要求，在各种可能性中，设想f - 一a t p 酶某一不对称亚基与3 个b 亚基轮流接 触将是一个合适叉合理的选择。这样“结合变构机理”又增加了“旋转催化” ( r o t a t i n gc a t a l y s i s ) 的内容”。至于哪一或哪些亚基具体在起这样的作用丌始时并 不十分明确。其它科学家对盯p 合酶在催化过程中亚基的转动也进行不少研究并 提出一些设想，但都缺少直接的证据。看来，要验i e b o y e r 有关氧化磷酸化过程 中亚基的结合变化和旋转催化的假设，关键在于a t p 合酶的f t 的高分辨率结构的 解析以澄清在催化过程中3 个b 基构象有否差异以及酶分子亚基的旋转问题。 1 1 _ 22 支持旋转催化机理的证据 本次试验所构建的旋转免疫传感器就是基于这一机理，从本次宴验和其他成 功验证这一假说的相关实验情况来看，这一假既是比较符合实际情况的。 1 i 2 3 牛心线粒体f 。一a t p 酶晶体结构的解析 经过长期的摸索，英国w a l k e r 实验室于1 9 9 4 年成功地完成了牛心线粒体 f l a t p 酶的晶体结构分析，分辨率高达02 8i l m ，这在当时是高分辨率解出的最 大的、具有不对称结构的蛋白质( 图3 ) c 1 4 1 。w a l k e r 由于这个杰出工作3 亏b o y e r 共 同荣膺了1 9 9 7 年诺贝尔化学奖( 同时获奖的第三人是出于在n a + 、k + 一a t p 酶方 面作出贡献的丹麦科学家j e n ss k o u ) 。 侧视图 b 俯视图 图3 牛心线粒体f 1 a t p 酶晶体结构图 1 4 1 f i g3t h et l g e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f b o v i n ef i - a t p a s e 从解析结果可以清晰看到f i - a t p 酶外形像橘子样的扁圆球体，直径约1 0 n m ，d 和b 亚基象橘子瓣一样交叉分布组成六聚体。y 基呈n 螺旋结构位于六 聚体中央，其上段位于顶部处与ab 亚基仅有有限的接触，下段构成a t p 合酶连 接f - 与r 的柄部的一部分。从电子密度图看，6 和e 亚基也可能位于柄部，但尚 未能确定它们的位置。w a l k e r 工作最重要的一点在于清晰显示f l - a 开酶在a t p 水 解过程中3 个1 3 基的构象明显不同，一个是结合a t p 即将键裂的t l g h t 状态，一个 是a d p b p 将释放的l o o s e 状态，还有一个是无底物结合的o p e n 状态。这就有力地支 持长期以来尚待证明i 构b o y e r 的“结合变构机理”。与此同时，w a l k e r 对于牛 心线粒体f ，- a t p 酶的结构解析也为进一步验证b o y e r 旋转催化假说提供了结构 基础，即显示了y 亚基位于q ，1 3 冲心，为验证y 亚基与c lb 亚基可能存在着相 互转动提供了非常有用的信息。 1 12 4f i _ a t p 酶的y 旋转实验 w a l k e r 关于f l a t p 酶高分辨率的晶体结构分析有力推动了旋转催化机理假 设的验证，目前支持“旋转催化”模型的实验证据越来越多，其中有3 个实验室 的工作最为成功吲( 图4 ) 。 叼- ”“1 帮秘 ：薅。 图4 验i 正a t p a 舍酶在水解a t p 的过程中y 亚基旋转的3 个实验示意图【”1 f i g4e x p e r i m e n t sp r o v i n gt h er o t a t i o no f t - s u b u n i td u r i n ga t ph y d r o l y s i s ( 1 ) c r o s s 实验室通过基因工程技术在b 亚基和y 亚基上引入一些c y s ，并 进行化学交联实验【l q 。如图4 ( a ) 显示，y 亚基已经和其中的一个8 亚基形成二 硫键，交聩后f a t p 酶的水解活性即告消失。若将此二硫键还原叉可恢复酶活。 在酶水解a t p 的状态下，将这些二硫键还原和再生后y 亚基可以和另外一个1 3 亚 基形成二硫键，但如体系中不加入a t p 即酶处在非活性状态的情况下，则没有 形成新的二硫键。结果表明，在f l 或f o f i 水解a t p 的过程中，y 亚基不停地旋转 并与3 个b 亚基依次相互作用。这就有力支持了旋转催化的假说。 ( 2 ) j u n g e 实验室应用一种新的光选择技术一一光漂白偏振吸收回复 ( p o l a r i z e da b s o r p t i o nr e l a x a t i o na f t e rp h o t o b l e a c h i n g ，p a r a p ) 对c f l , 亚基相对o 【3 8 3 的旋转进行了实时观察( 图4 b ) t 】。他们将纯化的菠菜c f i 通过a 3 p 3 固定在离子 交换树脂上，光漂白染料曙红( e o s i n ) 与t 亚基近c 末端的c y s 残基共价相连，经 荧光漂白后跟踪荧光偏振吸收变化的弛豫过程，以监测e o s i n 标记的y 亚基对于 q 3 f 1 3 的慢转动。当酶水解a t p 时，产生畸形共振弛豫，表明丫亚基相对于p 3 作旋转运动。当把底物a t p 换成a m p p n p ( a t p 的竞争性底物，对f i a t p 酶具 有抑制作用) 时，这种弛豫现象消失。丫亚基旋转的弛豫时间约l o o m s ，与在同样 条件下酶的催化周转时间相差不多。这再次说明f i a t p 酶催化过程与y 亚基的 转动密切相关。 ( 3 ) 日本的y o s h i d a 和k i n o s i t a 实验室做了一个更精彩的实验，在显微镜下 直接观察到了y 亚基的旋转( 图1 5 c ) 【1 8 】。他们将嗜热菌的f 。- a t p 酶通过基因工 程技术在1 3 亚基的n 端尾部加上1 0 个组氨酸残基的尾部( h i s t i d i n et a g ) 。同时， 通过定点突变技术将y 亚基的1 0 7 位的丝氨酸换成半胱氨酸( y $ 1 0 7 c ) ；与此同 时将q 亚基中1 9 3 位半胱氨酸用丝氨酸取代( qc 1 9 3 s ) 。3 个亚基在e c o l i 中表 达后提纯重组，a 。1 3 。y 通过1 3 亚基上的h i s 尾固定在表面涂满n i - n t a 的玻璃 板上，同时将荧光标记的肌动蛋白单纤维丝通过y1 0 7 c y s 连接在y 亚基上，这 根纤维的长度约2 5um ，是f 。直径的2 0 0 倍，它的运动在倒置荧光显微镜连接 的摄像系统下可以直接观察到。实验结果表明，当加入2m m o l la t p 时在荧光 屏上显示了转动的亮点。此运动可以持续至少2 5 s ，转动的时间过程表明，运动 是单方向、逆时针的( 从膜方向看) 。这一实验结果直观呈现了在水解a t p 过 程中y 亚基是在q 。1 3 。形成的圆筒式结构中转动的，这是对b o y e r 提出的转动 催化假说最有力的支持。 此外，n o j i 应用单分子技术证明f 1 - a t p 酶y 亚基的旋转还有如下的重要意 义：酶作为生物催化剂其种类繁多，但f , - a t p 酶的特殊性在于，它是迄今发 现仅有的一种酶蛋白分子，它的催化作用已被直接证明是通过分子内部的亚基进 行旋转运动来完成的；生物体内的肌球蛋白( m y o s i n ) 、驱动蛋白( k i n e s i n ) 、 r n a 聚合酶( r n ap o l y m e r a s e ) 、动力蛋白( d y n e i n ) 等等都称分子马达，但他们都 是线形推进的，沿着一条线性轨道进行运动，因而又称线形分子马达。而蛋白质 7 分子旋转马达迄今只发现细苗鞭毛马达( 约由1 0 0 个蛋白质分子组成的复合体) 和a t p 合酶；a t p 合酶的f i 部分( f i - a t p 酶) 直径只有9 。1 0 肿l ，是迄今为止 最小的生物分子旋转马达。 以上实验证实，游离的f 水解a t p 是在o 。b ，的3 个催化位点上按照3 个步骤循 环催化进行并伴随着y 亚基的旋转。对于f 。f - 全酶，a t p 合成极有可能是y 亚 基反方向的旋转催化。 12 a t p 合酶分子马达的应用研究 a t p 合酶是一个很复杂的由多种亚基组合而成的复合体，能够通过含有的某 些亚基快速旋转而完成催化位点与质子转导机械之间的能量偶联，这让它成为了 能量代谢中的关键酶。偏振光的漂白恢复实验 ”1 中所观测查到的实验现象成为亚 基旋转的提示性证据。接着对证明这一旋转性质有着重要意义的工作是荧光显微 镜下的直接观察实验，确立了a t p 水解状态时的y 1 8 1 、e t 9 啪c 【”j j 2 1 亚基的旋 转，而且他们的旋转无论速度还是方向都是相同的，表明这三个亚基一起组成了 这个分子马达的中间旋转装置，也就是之前说到的转子( r o t o r ) 而且从膜方向( 从 f o 到f i 方向) 所观察到的旋转方向都是逆时针( 图5 ) 。 a圄 。赢藩，惹彳 _ h i st ”a g 怒。：篓一 c n 屯h 一 爨 图5a t p 合酶旋转示意图“”4 f i g 5s e t u po f c o n s t r u c t st os h o wt h er o t a t i o no f a t ps y n t h a s e ( a ) y 相对吣0 3 六聚体的旋转( b ) 相对妁乩六聚体的旋转：( c ) c t i 。相对于定子 部分的旋转 n o j i 通过实验进步证明了离体情况下f 1 a t p 酶水解a t p 时可以使y 亚基 旋转，这一实验结果不仅在生物能学研究领域内引起了极大的震动，而且还吸引 了众多生物化学、生物物理、生物工程、物理、化学、纳米科学等各方面专家来 参与这一分子旋转马达的研究。a t p 合酶的催化过程是可逆的，既可水解a t p ， 也能合成a t p 。a t p 合酶分子在生物细胞内的生理条件下，其主要功能是合成 a t p 。在线粒体中，氧化过程中所释放的能量可以转换为跨线粒体内膜的质子梯 度差，该梯度差再来驱动f o 的y 旋转使3 个b 亚基构象发生交替变化来合成a t p 。 c o x 等人在1 9 8 5 年时就已提出过a t p 合酶可能在能量转换过程中具有旋转马达 作用这一设想，但他们把研究的重点放在了质子顺浓度梯差进行跨膜运送与f 两 者之间的关系。在经过实验后所得出的结论中，他们提出在质子顺浓度梯差进行 跨膜运送过程中会驱动c 亚基相对a 、b 亚基进行转动。依据这种假设，线粒体氧 化磷酸化的机理就可简单概括为：通过内膜呼吸链的电子传递所释放的能量首先 转换为跨膜质子梯差，后者驱动a t p 合酶的f o 的c 亚基转动，并继而带动f 。的y 亚 基转动而使3 个b 亚基构象发生交替变化来合成a t p 。由于a t p 合酶在一定条件下 可以解离为f o 与f i 【2 3 l ，在f 1 a t p 酶被证明为旋转马达以后，分别对f l 和f o 以及整 体f o f l a t p 酶进行这方面的研究是很自然的。 自从n o j i 对耐热菌的研究过程中发现旺3 p 3 丫几个亚基在离体条件下进行a t p 水解的过程中能直接观察到y 的旋转以后，先后有不同的实验室从不同角度进行 了多方面的探索。除耐热菌以外，用大肠杆菌e ：c o l i 、光合细菌以及叶绿体a t p 合酶的1 1 3 1 3 3 丫作为实验材料进行丫的旋转试验也均已获得成功。如上所述，在观 察旋转的实验中，当y 亚基接上一个长度为1 岬的肌动蛋白微丝，在2m m o l l a t p 条件下能够测得其转速约为2 6r s 。如果以微小金粒( 直径4 0n m ) 替代肌 动蛋白，转速则可达到1 3 0r s 。这一速度与a t p 水解的最大速度( 3 0 0 s ) 相 当。依此估计，在生理条件下7 亚基的旋转速度可达1 3 4r s 。通过控制a t p 浓 度可以通过计算得出y 每转1 2 0 。需消耗一分子a t p 。换言之，y 旋转一圈需消耗 3 分子a t p 。y 旋转1 2 0 。所作的功约为8 0p n n m ，这与水解1 分子a t p 所释出 的自由能相当。即能量转换效率 9 0 ，有的文献甚至认为接近1 0 0 。因此f i a t p 酶是迄今所知体积最小、转速最快、能量转换效率最高的蛋白质分子旋转马达 2 4 2 5 1 。f 1 除q 、p 、7 亚基以外，尚含6 和两亚基。通过交联实验( c r o s s 1 i n k i n g ) ， 说明a 、d 、6 相当于马达的定子，而丫与则为转子。在将肌动蛋白微丝与 相连接，并提供与之前相似的条件时，a t p 水解状态下也能通过带动肌动蛋白 9 微丝旋转，形式与y 带动下的旋转相似，但转速较慢。a t p 合酶的f l 部分的酶 活性具有水解和合成a t p 的双重功能，在f l 与f o 分离情况下，它只具有水解 a t p 功能，但在f o f l a t p 酶整体情况下，跨膜h + 梯差能通过f o 驱动f l 合成 a t p 。有报道，在一定条件下，f l 通过水解a t p 所释放的能量也可以借助f o 以 驱动h + 的主动跨膜运送形成跨膜质子梯差。2 0 0 4 年日本学者i t o h 提出1 2 6 】在离体 条件下，将q3b3y 复合体的y 连结带有磁性的微珠，当施加一定外磁场的影 响时可使y 亚基按顺时针方向旋转( 与a t p 水解时y 亚基的逆时针旋转方向相 反) ，结果可测得a t p 的合成。这一实验结果的重要意义在于：通过f 1 a t p 酶的催化，生动地实现了机械能可以转换为化学能的过程；进一步支持a t p 合酶的旋转催化学说，并肯定a t p 合酶活性的双重性，既能水解也能合成。 综上所述，作为生物分子旋转马达，对f 1 a t p 酶来讲，虽然还有不少问题 需要进一步深入探索，但总的来看，这方面己积累了不少有意义的工作成果。相 对于f i ，对f o a t p 酶的研究还比较少，这与f o a t p 酶是嵌于疏水区的内在膜 蛋白有密切关系，对它的研究有相当的难度。现在比较能够被广泛接受的看法是， a t p 合酶通过跨膜质子梯度差完成能量偶联合成a t p 的过程中，首先驱动的是 f o - a t p 酶的c 亚基相对于a 、b 亚基进行旋转。为了验证这一理论，有些实验室 曾用研究f l y 亚基旋转的相似方法来研究c 亚基的转动。用荧光标记的肌动蛋白 微丝与c 亚基相连接，观察跨膜质子梯差能否驱动c 亚基的转动，但对实验方法 与所获结果存在着不同看法。2 0 0 4 年德国d i e z 等人【2 7 】通过单分子荧光共振能量 转移( s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 技术已经能够 证明组装于脂质体的大肠杆菌f o f l a t p 酶在跨膜质子梯差驱动下，y 亚基在a t p 的合成过程中发生转动。他们所采用的方法不同于以往的c 亚基旋转观察实验， 并不是直接观察y 亚基的转动，而是将两种不同的荧光探针分别标记于丫和b 亚 基，前者的荧光探针作为供体，后者的荧光探针则作为受体。当这两种探针处于 一定距离范围内会发生能量的共振转移，距离愈近，转移效率愈高。由于b 亚基 是固定的，因此如果y 亚基在f o f l a t p 酶催化过程中发生旋转，它所标记的荧 光探针分子与b 亚基标记的探针之间相对距离就会随之发生变化。实验结果表 明，跨脂酶体的质子梯差的确能使标记在f o f l a t p 酶y 亚基上的荧光探针与标 记在b 亚基的荧光探针间的能量转移效率发生循环变化，这显然是y 亚基由于 1 0 转动从而使之与b 亚基的距离不断发生变化所产生的结果。而且再次证明a t p 合酶水解与合成a t p 时，y 亚基的转动方向是相反的。这一实验也间接表明跨 膜质子梯差可通过影响f o 的c 亚基旋转继而导致f ly 亚基的转动。乐加昌等【2 8 1 将嗜盐菌菌紫质( b a c t e r i o r h o d o p s i n ，b r ) 与大肠肝菌e c o l i 的f o f l a t p 酶共组 装在同一脂质体中，并将后者的f l 亚基连接上标记了可用于荧光观察的肌动蛋 白微丝。结果在一定条件下，通过光照b r 通过膜上的质子泵将矿泵入脂质体微 囊，从而形成内高外低的跨膜质子梯差。后者继而驱动f 。f 1 a t p 酶中f l 的亚基 带动所连结的荧光标记过的肌动蛋白微丝进行旋转。 1 3 量子点及其应用 1 3 1 量子点及其性质 量子点( q u a n t u md o t ，q d ) 又可称为半导体纳米微晶体( s e m i c o n d u c t o r n a n o c r y s t a l ) ，是一种由i i - v i 族或i i i - v 族元素组成的纳米颗粒。目前研究较 多的主要是c d x ( x = s 、s e 、t e ) 。量子点由于粒径很小( 约1 、1 0 0n n l ) ，电子和空 穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一 些大分子( 例如：多环的芳香烃) 很相似，可以发射荧光【2 9 】。量子点的体积大小严 格控制着它的光吸收和发射特征。晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的 原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大， 其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即存在量子尺寸效应( q u a n t u ms i z e e f f e c t ) 2 9 , 3 0 ，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰位也相应蓝移。 单独的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低。但 是当以其为核心，用另一种半导体材料包覆，形成核一壳( c o r e s h e l l ) 结构后，就 可将量子产率提高到约5 0 ，甚至更高，并在消光系数上有数倍的增加，因而有 很强的荧光发射【3 1 i 。目前已合成了多种核一壳结构的纳米颗粒，如c d s h g s 、 c d s a 9 2 s 、c d s p b s 等以及具有多层结构的c d s h g s c d s 。 与有机荧光分子相比，以c d s e 为核心z n s 为外壳的纳米颗粒 ( c d s e ) z n s 具有许多特殊的光学特性。激发量子点的激发光波长范围很宽，因此，不同大小 的( c d s e ) z n s 量子点可以由同一波长的光激发，这使得量子点对较为复杂生物 材料的标记更具优势；而对于不同的有机荧光分子则很难做到这点，通常每种荧 光材料都要用特定波长的光来激发。其次，量子点具有较大的斯托克位移 ( s t o c k ss h i f t ) 和狭窄对称的荧光谱峰 半高峰宽( f u l lw i d t h sh a l f m a x ，f w h m ) 常 常只有4 0r i m 或更小 ，这意味着在同时使用不同光谱特征的量子点时，发射光 谱并不会出现交叠( o v e r l a p ) ，或者只有很少交叠，这种极少的交叠使生物分子 荧光谱的识别变得容易( 图6 ) 。 ，n m 图6 ：荧光素( a ) 与量子点( b ) 的激发( 虚线) 与发射光谱( 实线) 对比【4 j f i g 6e x c i t a t i o n ( d a s h e d ) a n df l u o r e s c e n c e ( s o l i d ) s p e c t r ao ff l u o r e s c e i n ( a ) a n da t y p i c a lw a t e r s o l u b l en a n o c r y s t a ls a m p l e ( b ) i np b s t h ef l u o r e s c e i