（遗传学专业论文）利用smart+cdnaaflp银染技术分离和克隆与花椰菜花色相关基因.pdf

南开大学硕士研究生毕业论文 致谢 本论文是在陈瑞阳教授和宋文芹教授的悉心指导f 完成的，对三年来导 师给予的辛勤培养与教诲，借论文首页表示由衷的感谢。 在实验过程中，李秀兰老师给 f, 了大力协作私无私的帮助，在比表不深 深的谢意。同时对本实验室的陈成彬、郭歌、江赐忠、梁思源、毛英伟、祁 仲夏、孙易、孙德岭、王晓梅、张峰和张荣信 ( 以姓氏拼音为序)各位同学 的帮助，在此一并表示真诚的感谢。 第 页 南开人学硕十研究生毕业论文 摘要 臼 于 花 的 研 “ ， 一 “ “ 是 遗 传 学 研 “ 的 一 个 热 点 花 色 、 要 由 两 类 色 素决定;一类是黄酮类色素，另一类是类胡萝 卜 素。了解花色基因的遗传机 理，分离和克隆花色基因是利用基因工程改变花色的基础。随着生物技术的 发展，利用基因工程改变花色己经成为可能。但目前，对花色的研究主要集 中在对黄酮类色素的研究上，对类胡萝 卜 素的研究相对较少，关于黄花品系 花卉的基因工程尚属空白。因此，研究黄花品系的花色的遗传规律，及花色 相关基因， 有重大意义 对进一步了解黄花品系花色形成的分子机理以及花色基因工程具 。卜 1l 用s m a rt c d n a - a f l p ( a m p l i f i e d f r a g m e n t le n g t h p o l y m o r p h i c ) 银染技术 对花椰菜黄花( a o - 3 ) 和白 花( a i - 3 ) 一对近等基因系的m r n a进行了 分析。 用 8 对选择性引物对这两个品系的 c d n a进行了扩增，每对引物提供的谱带 数在1 2 - 3 1 之间，片段大小在5 0 - 6 0 0 b p 之间。 其中2 对引物的3 条带在2 个 表达基因文库之间存在多态性，其中一条与白花品系共分离;另两条与黄花 品系共分离。将与白 花共分离的潜带w2 6 0 和与黄花共分离的谱带y 3 1 0 分 离、扩增、克隆，并用n o r t h e r n 点杂交初步证明了它们分别为白花品系和黄 花品系特有的。w2 6 0 经测序后，通过 g e n b a n k 进行同源性检测，发现它与 矮牵牛胞质雄性不育株系 3 6 8 8的f i - a t p a s e 的部分有 9 2 %的同源性进一 步的工作尚在进行。 关键词:s m a rt c d n a, a f l p ，花椰菜，花色 第4 页 南开 大学硕士研究生毕业论文 ab s t r a c t u s i n g s m a rt c d n a - a f l p s i l v e r s t a i n i n g m e t h o d , w e a n a ly s i z e d t h e m r n a f r o m a p a i r o f n e a r - i s o g e n i c c a u l i fl o w e r l i n e s . e i g h t p a i r o f s e l e c t i v e p r i m e r s a m p l i f i e d t h e c d n a o f t w o c a u l i fl o w e r l i n e s . o n a v e r a g e , a b o u t 2 0 b a n d s w a s p r o v i d e d b y e a c h p a i r o f p r i m e r s . v a r i e d f r o m 1 2 - 3 1 . t h e f r a g m e n t s i z e r a n g e d f r o m 5 0 t o 6 0 0 b p . t h r e e p o l y m o r p h i c a f l p p r o d u c t s b e t w e e n a p a i r o f n e a r - i s o g e n i c c a u l i fl o w e r l i n e s 认 er e c o s e g r e g 掀e c a u l i fl o we r wi t h t h e wh i t e fl o we r a m p l i f i e d b y t w o p a i r s o f p r i m e r s . o n e c a u l i fl o w e r , t h e o t h e r t w o c o s e g r e g a t e w i t h t h e w i t h y e l lo w fl o w e r . we c l o n e d t h e f r a g m e n t w2 6 0 t h m c o s e g r e g a t e w it h t h e w h it e fl o w e r c a u l i fl o w e r a n d t h e f r a g m e n t y 3 1 0 t h a t c o s e g r e g a t e w i t h t h e y e l l o w fl o w e r c a u l i fl o w e r . n o rt h e r n d o t b l o t t i n g a n a ly s i s o f t h e m p r o v e d t h a t w2 6 0 w a s t h e s p e c i f i c f r a g m e n t w h i c h c o s e g r e g a t e w i t h t h e w h it e fl o w e r c a u l i fl o w e r， a n d y 3 1 0 i s t h e y e l l o w fl o w e r c a u l i fl o w e r t h e s p e c i f ic f r a g m e n t w h i c h c o s e g r e g a t e w it h t h e f r a g m e n t w2 6 0 w a s s e q u e n c e d a n d t h e g e n b a n k d a t a b a s e r e v e a l s t h a t i t h a s 9 2 % h o m o l o g y w i t h p e t u n i a p a r o d i i s t r a i n 3 6 8 8 ( c m s ) .f i - a t p a s e k e y w o r d s : s m a r t c d n a , a f l p , c a u l i fl o w e r , fl o w e r c o l o r 第， 页 南开大学硕士研究生毕业论文 一月 叮 言 1 关于花色的研究现状及花色相关基因的应用 花是植物繁衍生命的重要器官，许多植物通过花的颜色吸引昆虫和鸟类 来授粉，因此花色对这类植物的有性繁殖及其重要。同时花色又是一个重要 的观赏性状，正是这多彩的花色将世界装点得如此绚丽因而在历史上一直 是许多科学家所喜爱研究的对象之一。早在十九世纪，孟德尔首先开始 了 对 花色的研究，经过对豌豆花色研究，得出了重要的孟德尔定律 ( l a w o f s e g r e g a t i o n a n d l a w o f i n d e p e n d e n t a s s o r t m e n t ) . m c c l i n t o c k 的转座子的发现 也是基于对花色的研究上。早期的研究是将基因位点与易于观察的色彩变异 联系起来进行的。在当代，对花色的研究依然是探索植物基因表达和调控机 理的最好系统之一。随着园艺事业的发展，改变花色，培育新品种也是园艺 学的一个重要方面。 1 . 1 关于花色的研究 花的颜色主要花色素决定。植物色素包括两大类化合物:一类是水溶性 的类黄酮 ( fl a v o n o i d ) ，存在于液泡中;另一类是脂溶性的类胡萝卜 素，存在 于 质体。 对类胡萝卜 素的 生物合成是以 厌 氧的 光合细菌r h o d o d a c t e r c a p s u l a t u s 为材料进行的;而对类黄酮的生物合成是以高等植物为材料的。 在过去的几十年中，对类黄酮色素在遗传，生化和分子生物学方面都作 了详细的研究，其合成途径已经基本搞清楚。类黄酮的生物合成途径见图 t o 其中花的颜色主要由两类类黄酮参与形成。 一 类是红色或紫色的花色素昔， 另一类是黄色的 噢侨 ( a u r o n e s )和苯基苯乙烯酮合成酶苯基苯乙烯酮 ( c h a l c o n e ) 。花色素普是花， 果实和种子中的主要色素。 它合成后主要积累在 花瓣表皮细胞的液泡中，其化学结构会受液泡内的生理状况影响而改变，从 而呈现出不同的颜色。目前的研究主要围绕花色素昔基因的突变进行的。 第6 页 南开大学硕士研究生毕业论文 ( (x 11: 丫 洲 川 c( x311 y o - s - c o a 1 叫 未0 万权西 定 i i ( 火 he : 、 亚 一 ， ifj , . :ir 工 ，飞 c 4 1 !一 r， 尸 占 。 ， 二 j一,)!f3 in 木质众 民类 香豆索 目类 ，厂上 川 -曰r 百 ) h 作订欣c u a 噢 刹黄色笨 荃 笨 乙 稀 傲眨 色) _心 o il 尸认沐。 黄 州 无色) 口 泣 硬 i 吹 旧软无色) / / / / ; 惬 ( 卜 】 右 l u l o 亡 6 份 勺 花 葵粼助仆 ( 专 红色) 图护 刁类黄旧生物合成途径简图 氮他脱氮醉: c 4 h:山佳故狡化西: 花卉 萦 衡朴 ( f色 c 田中显示了类黄旧的主姿种类和一些主要反应的催化脚) 。 c l : 一 香豆酸c . a连接陇: c h s p a l ; 苯丙 c hi 苯基 黄烷用 3 一 径化目;f 3 5 h f l s .黄用阵合成目 炎该用3 , s - 段化公.d f r :二氮鱿旧醉刁 - :u d p一 葡烤二负黄阳3 一 o一 而辘基转移醉. f3g铆 xt g ffi la 理塑缚, f 3 h , f r, 谏阴:a s . i p m . 农合成翻 南厅大学硕l 研究生钱业论文 本世纪 9 0年代初，对花色素营的代谢途径研究已经较为成熟。玉米，金 鱼草，矮牵牛等是研究花色素昔代谢途径和基因分离的重要物种。目前己有 影响花色素昔的代谢的结构基因和调节基因被分离和克隆。1 9 8 3年，首次用 鉴别筛选与杂交筛选相结合的方法从欧芹中分离出类黄酮的生物一合成基因; 1 9 8 4年，f e d e r o ff等以玉米为材料， 用 a 。转座子标签技术克隆了类黄酮合 成过程中结构基因 b z l , b z l是编码类黄酮- 3 - 0 - 葡糖基转移酶的位点:1 9 8 5 年， 以欧芹c h s基因为探针分离出了 矮牵牛的c h s 基因; 1 9 8 7 年，wi e n a n d 等通过转座子标签技术克隆了 玉米的苯基苯乙烯酮合成酶 ( c h s ) 基因: 1 9 8 7 年，从法国豌豆中分离出了 c h 工基因;随后又从矮牵牛中分离出了 c h i基 因; o r e i l l y ( 1 9 8 5 ) , r e d d y ( 1 9 8 7 ) , m a r t i n ( 1 9 8 5 ) 等 用转座子标签技术克隆了 玉米和金鱼草的二氢黄酮醇 - 4 一 还原 酶 ( d r f ) 的 编码位点a i 和p a l l i d a ; 1 9 8 9 年，b e l d等以金鱼草的二氢黄酮醇- 4 - z - 原酶 ( d r f )基因为探针，克隆了矮 牵牛的d f r基因;1 9 9 1 年后，f 3 h基因、a t m, f 3 5 h等基因也分别被分 离出来。调节基因的克隆主要采用转座子标签技术，自 1 9 8 8年首次分离出 r基因以来，又先后从玉米中分离出s , s n , l c ,b , c 1 ,p l 基因等，从矮牵牛中分 离出a n 2 , a n 4 基因，从金鱼草中分离出d e l 基因。并发现这些基因之间有高 度同源性，也就是说不同物种的花色素的生物合成由相似的因子介导。但是 还有许多重要基因如 a t t和 5 g t没有被分离。也还有些代谢过程没有完全 搞清楚，例如由二氢黄酮醇转变成花色素营的过程，需要几个酶的作用。虽 然一些过程己经被证明，但由于过程复杂和中间产物的不稳定，精确的过程 并不清楚;花色素合成酶催化从无色花色素到花色素的转变过程也还不清 楚。此外，花色素昔合成后还需要进行进一步的修饰，如甲基化，糖普化， 酞化等也尚在研究。对于另一类色素类胡萝 卜 素的研究较少。 1 . 2 花色相关基因的应用 二十 世纪以来，观赏植物产业不断发展，培育出许多新品种以满足人们 的需要。到目 前为止，大多数新品种是通过传统育种方法培育出来，但传统 育种方法的局限是显而易见的。在改变某一性状的目 标育种过程中，难免伴 第a 页 南开大学硕士研究生毕业论文 随其它性状的改变，从而使育种周期较长，效率较低。由于对花色素的研究 较为详细，许多花色素生物合成基因和调控基因以被克隆，这使得用基因 l 程的手段来改变植物花色成为可能。基因工程技术可以从以下几个方面改变 花色: a 直接导入外源结构基因以改变花色。常用于单基因控制的花色。第 一例用基因工程矮牵牛改变花色的实验就采用此方法。将玉米 d f r基因导 入矮牵牛 r l o 1突变体后，使二氢堪非醇还原，提供了天竺葵色素生物合成 的中间产物，从而获得了矮牵牛的新花色一 淡砖红色。荷兰 s ( 2 )与黄酮类修饰有关的基因;( 3 )开关全部或部分合成途径的调节基 因;( 4 )影响黄酮类浓度的基因，包括增强或减弱色素合成，阻止色素积累， 引起酶促或化学褪色;( 5 )与花朵结构有关的基因，包括花瓣特定部位色素 不同的产生或积累，花嵌合体的形成，转座子引起的基因不稳定表达;( 6 ) 影响花色的基因或因子，包括共着色，黄酮类和金属离子的互作，液泡 p h 值;( 7 )控制花瓣毛，乳突，色素细胞的形状和分布，角质层类型等形态特 征的基因。目前对除类黄酮的其他花色基因研究相对较少，且对类胡萝 卜 素 的研究也较少。因而花色的基因工程仅限于少数几种花卉的黄酮类的操作 上，自砖红色矮牵牛问世近十年，尚未见花色基因工程培育的新品种进入花 卉市场。目 前花色基因工程面临的问题是有的花卉的色素组成不清楚。对花 色表型遗传规律的研究，尤其是黄酮类与胡萝 卜 素共着色的遗传机理是花色 基因工程急需解决的问题。 此外，花色基因还可以用于研究植物花色素的代谢途径及植物发育，也 可以用于研究基因间的互作原理，调节基因也是最方便的植物遗传转化报告 基因。 2 . 分离和克隆花色基因的技术 目 前分离和克隆花色基因的技术主要是功能克隆， 转座子标签法， p c r 和差别筛选法，下面将分别介绍。 2 . 1功能克隆 功能克隆是以了解基因功能为前提的克隆基因的方法。它利用基因可以 转录、翻译成特定的蛋白质为前提来进行的。其基本原理是利用一些特定的 功能信息，在纯化相应的蛋白质后，进行氨基酸测序，根据该序列合成寡聚 核普酸探针并从 c d n a或基因组文库中筛选编码基因，或制成相应抗体，从 c d n a文库中筛选相应克隆，而不需要任何定位根据。c h i 基因就是用这种 方法分别从法国豌豆和矮牵牛中分离而来的。但是由于大多数基因产物不 第1 0 页 南开大学硕士研究生毕业论文 详，或即使知道也不能纯化出足够的蛋白质用于测序或抗体的制备，因而使 这一方法的应用受到限制。 2 . 2 转座子标签技术( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 转座子( t r a n s p o s o n ) 也 称转位因子 ( t r a n s p o s a b l e e l e m e n t ) 是指一段d n a , 它能够通过切割、重新组合等一系列过程从基因组的一个位置 “ 跳跃”到另 一个位置。当转座子插入的位置恰好是在一个特定的基因中或附近时，这个 基因的表达将或多或少的受到影响，改变的程度是由 转座子的整合位置与编 码区或调节区是否接近而决定的。例如:当一个转座子跳到一个参与花色素 昔 ( a n t h o c y a n i n ) 生 物合成的 基因中 ，就 可能产生这样一个突变体， 本 来开 紫花的植物突变成开白 花。在一般情况下，由转座子产生的突变体不太稳定， 因 此当转座子从基因中 切掉，紫花又 可以 恢复。 这一技术最早是由b i n g h a m 提出来的，并定义为用转座子特异基因片段作探针，通过杂交分离出由转座 子导致突变的目的基因。后来经过衍生的转座子标签技术是克隆花色基因最 常用的方法。 用这种方法已经从玉米中分离到了d f r基因、 a n s 基因 . 3 g t 基因:从金鱼草中分离到了 d f r基因;几乎全部的调节基因都是用这种方 法分离到的。 尽管这一技术路线十分明了，但在实际操作过程中也存在不少问题。首 先它用到一个己经克隆好的功能性转座子，而己经克隆好的转座子的植物只 有几种，这限制了这一方法的应用。有人对其进行了改进，用一段特殊的外 源 d n a代替转座子转入植物，这样更容易筛选突变的转基因植物，而这首 先需要该种植物能够获得稳定的转基因植物。其次转座子标签技术需要一个 转位频率相对较高的转座子系统。第三还需要了 解转座子的拷贝数，因为低 拷贝数的转座子产生的突变体更容易获得。第四在对带标签的基因进行鉴定 时，通常采用的方法是对正常植株和回复突变株进行 s o u t h e r t ; 杂交，而回复 突变株通常不易获得。目前该技术只用于分离克隆单基因。 2 . 3 差别筛选法 不同表型的差异是通过基因表达的质和量的差异实现的。这一理论为克 第i t 页 南开大学硕士研究生毕业论文 隆复杂性状相关基因开辟了又一个重要途径。研究m r n a差异表达通用的方 法m r n a差减杂交的费用高，时间长，因而推广困难。1 9 9 2 年， p e n g l i a n g 和 a . b .p a r d e e 首先建立了一种新的 m r na差异显示技术 ( m r n a d i ff e r e n t i a l d i s p l a y )也称差异显示反转录 p c r ( d i f f e r e n t i a l d i s p l a y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p c r ,d d r t - p c r ) 在一定程度上克服了差减杂交的不足。1 9 9 4年，k a o r u等人 用 r a p d ( r a n d o m ly a m p l i f i e d p o ly m o r p h i c d n a ) 引物差别筛选随机扩增的 c d n a ， 使 m r n a差别显示技术更简便，同时对低水平表达基因更敏感。由于 这种方法可以在短时间内获得差异基因克隆，因而被广泛应用。第一例黄酮 类生物合成的基因就是用这种方法从欧芹中分离而来。用该方法从金鱼草中 分离到了f 3 h基因。 高等生物一般具有 1 0 个基因，对于每一个细胞来讲仅表达其中的1 5 %, 约1 5 0 0 。 种m r n a o m r n a差异显示技术的基本原理是利用合成的两组引 物， 通过随机组合，使 1 5 0 0 0 种m r n a均有扩增的机会，并显示清晰的带。其基 本的操作程序是:先将两种细胞的m r n a提取出来并反转录成 c d n a ，然后 以一定的引物作随机聚合酶链反应扩增，将扩增的产物用聚丙烯酸胺凝胶电 泳比较，筛选并分离出不同样品间的差异带，经过验证，回收扩增后作为探 针，在 c d n a文库或基因组文库中钓取相应基因的全序列，然后在进行功能 分析。这种方法成功的关键在于 p c r的引物。根据真核生物细胞的 m r n a 均含有p l o y ( a ) 末端的特点， 把 其中3 端引物设计成t 1 2 m n ( m, n表示四 种 碱基中的一种， 但m不能为t ) 共十二种，分别对总r n a进行反转录， 从而 将m r n a分成了十二组.再加土5 端的引物随机的结合在m r n a上， 使得每 一条m r n a均有机会得到扩增， 这样就可以显示不同细胞间的m r n a的差异. 并减少了每次分析的 m r n a的数量， 提高了分辨率经过进一步的专一性、重 复性、灵敏性的研究发现，可以进一步将 n改成简并碱基，这样引物可减少 为四种，从而减少了工作最。 m r n a差别显示技术虽然是一种快速克隆基因的好方法，并己经被广泛 应用，获得成功。但 m r n a差别显示技术在操作过程中存在一个最大的问题 是差异表达带的假阳性率高达7 5 %，而且近 2 5 % a - 4 0 %的差异带不能重复。这 第1 2 页 南开大学硕士研究生毕业论文 主要是因为引物片段太短，p c r扩增时退火温度低且扩增的 c d n a片段均位 于 p o ly ( a ) 的末端区，而这些区域有些是不翻译或重复的，因而得不到特异 的基因。 3 . s m a r t p c r e d n a - a f l p 银染技术的基本原理 3 . 1 s m a r t c d n a的 基本原理和应用 本实验所采用的s m a rt p c r c d n a分析试剂盒是一个新颖的， 以p c r为 基础的 可以 从几纳克总r n a 或p o l y ( a ) + r n a 样品 获得高 质量c d n a的方 法。 这一方 法对于小 样品尤 其合适。 通常的c d n a合成方 法依赖于r t ( 反转录酶) 转录 m r n a成单链 d n a ，然而 r t不能总是完全转录全长 m r n a ，这样在 c d n a中5 端的基因倾向于低表达。这种情况尤其表现在长m r n a中，当第 一 条链仅由o l i g a ( d t ) 起始或 m r n a存在有二级结构尤甚。这是因为即使在 不考虑r n a降解的情况下，r t常在转录完全前失活，这样 c d n a文库中就 会存在一些被截的 c d n a分子。 而s m a r t t m p c r方法却可以富集全长 c d n a . s m a rt c d n a的合成起始于总r n a或p o l y ( a ) r n a ， 用被修饰的o li g a ( d t ) 引 物引导第一条链的合成 ( 见图二) 。当 r i ， 到达 m r n a的 5 端，酶的末端转 移酶活性将加入几个附加的核昔酸，主要是脱氧胞昔。s m a rt 寡聚合营酸在 其3 末 端有o l i g a ( d g ) 序列， 这样可以 和附 加的核普酸 脱氧胞昔 碱基配 对产生 一 个延伸的模板。 当r t开启模板复制到末端， 就得到一个含有5 末端m r n a 的全长c d n a和与s m a rt t 寡聚合昔酸互补的序列。这是因为当r t停止在模 板完全转录前加上脱氧胞昔后，这样的序列与 r n a 杂交的能力低于全长 c d n a ， 因而阻止了与 s m a rt 寡聚合普酸互补配对。s ma r t的锚定序列和 p o l y a序列 就通常作为引 物起始位点 进行从头至尾的c d n a扩增。 因此由f r t不 完全 酶活 导 致的不 完 全 转 录， 或从 p o l y a -转录而 来的c d n a以 及基因 组 d n a不会被扩增。 但是降解的r n a片段会被扩增， 从而影响c d n a文库。 首先s m a rt c d n a的合成可以用于c d n a文库的构建。 其次， s m a rt c d n a 的合成可以用于 p c r - s e le c t c d n a减法杂交，因为当用总 r n a作为模板合 成 c d n a时，如果用通常的方法，将会有过多的核糖体 r n a被转录，这样 第”页 南开大学硕士研究生毕业论文 就造成了减法杂交的效率低。而用总r n a作为模板合成的s m a rt c d n a可以 直接用于 p c r - s e l e c t c d n a 减法杂交。另外当研究人员缺少足够的总 r n a 或p o l y ( a ) r n a时，可以用s m a rt c d n a代替总r n a或p o l y ( a ) r n a进行 v i r t u a l n o rt h e r n杂交，这种方法可以 提供与标准的 n o rt h e r n杂交一样的 信息。此外 s m a rt c d n a还可以用于为杂交准备探针口 3 . 2 a f l p银染技术的基本原理和应用 a f l p ( a m p l i f i e d fr a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 即扩增片 段长度多 态性是 1 9 9 3 年由荷兰k e y g e n e 公司的科学家z a b e a u m a r c 和v o s p i e t e r 发明而创建 的一种 d n a分子标记技术它不仅具有其它分子标记所具有的特点，多态性 丰富，共显性表达，不受环境影响，无复等位效应，而且具有灵敏度高，快 速高效等优点。其基本原理是:对植物的总d n a双酶切后经过p c r扩增后 的限制性片段进行选择。即将植物的基因组 d n a经过限制性内切酶双酶切 后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定的接头( a d a p t e r ) 连接在 这些片段的两端，形成带有接头的特异片段，通过接头序列和 p c r 引物 3 末端的识别，特异性片段经过变性，淬活和延伸周期性的循环而扩增，最终 通过聚丙烯酞胺凝胶电泳分子筛的作用，将一些特异的限制性片段分离开 来。( 见图三) a f l p 流程包括模板准备、片段扩增和凝胶分析。 a f l p技术在遗传学和育种领域有广阔的应用前景。由于专利的限制主 要用于研究工作。其范围包括; a _ 遗传多态性的研究 美国康耐尔大学的b l a i r 利用a f l p技术分析了5 4份水稻的遗传多样性， 研究其系统发育和分类，发现 a f l p技术对于水稻品种的遗传变异和构建基 因组图谱较同工酶生化标记和 r f l p技术更理想。p a u l, s等 ( 1 9 9 7 )用 5对 引物组合对来自 印度和肯尼亚不同地区的3 2 个基因型的茶树基因组d n a进 行了 a f l p检测，探讨了种群内和种群间的遗传差异和多样性及亲缘关系。 本实验室张峰也用该技术分析了多种梨的亲缘关系。 b构建遗传图谱 第1 4 页 南开大学硕士研究生毕业论文 b 构建遗传图谱 a f l p技术的多态性很强，适合构建高密度的遗传图谱。玉米，大麦， 马铃薯的 遗传图 谱上都有a f l p 的 遗传标记。 荷兰的k e y g e n e 公司p o t j e r i n a 构建了 拟南芥高密度的遗传图谱，其中 a f l p的遗传标记 7 0 0余个，覆盖了 拟南芥的整个染色体。 c 标定基因 c .m . t h o m a s ( 1 9 9 3 ) 利用番茄与野生种 切c o p e r s i c o n p e n n e l l i i 种间杂交 f 2 群体发现4 2 0 0 0 条a rt条带与番茄抗叶霉病基因c f - 9 紧密连锁. k .mc k s e n ( 1 9 9 2 ) 也报道了有3 2 0 0 个a f l p 位点与马铃薯v 染色体上抗p h g t o p h t h o r a i n f e s t a n s 基因ri 具有连锁关系，其中 8个位于r 1 基因的 r f l p标记g p 2 1 和g p 1 4 7 之间。这样高密度的遗传图谱有助于基因的图谱克隆。 d .辅助育种 用分子标记辅助育种较传统的育种方式更具有针对性，并且大大的缩短 了育种的周期， 减少了人力、物力的消耗。目 前 a f l p技术己经实验用于棉 花、垂枝桦树、大豆的育种中。 e .鉴定品种绘制指纹图谱 这是 a f l p技术最适合的应用领域。用 a f l p技术鉴定品种的质量和纯 度， 十分的灵敏。 f a y e ( 1 9 9 6 )用一个 a f l p引物在玉米的两个基因 型中得 到 3 0条以上的多态性条带，证明该方法十分适用于玉米基因型的指纹鉴定。 本实验室也用该技术成功的绘制了华北地区的玉米指纹图谱。 由 于 a f l p技术所使用的放射性同位素对人体和环境的危害都较大，因 而在本实验中采用银染技术代替同位素的使用。 4 .本研究的内容和目的 尽管对花色的研究工作进行的很多，但是主要集中在对少数几种植物的 黄酮类物质的研究工作上。对脂溶性的胡萝卜 素的研究还是以厌氧的光合细 菌为材料来进行的。黄色花系的基因工程还没有起步。有报道黄色花主要是 源于胡萝卜 素的作用。本研究将 s m a r t c d n a和 a f l p银染技术结合起来， 第巧页 南开 大学硕士 研究生毕业论文 二 材 料 和 方 法 1 .实验材料 1 . 1 植物材料: 花椰菜黄花和白花的近等基因系 a o - 3和 a l - 3 。其中a o - 3为黄花纯合株系， a l - 3是白花突变株经与 a o - 3回交后，筛选到的白花纯合株系。( 由天津蔬菜所提 供) 1 . 2 实验所需试剂 1 . a f l p试剂盒及引物从g i b i c o - b r l公司购买。 2 . 用于检测重组克隆子的寡聚核昔酸引物由上海生物工程公司合成。 引物 i 为 5 a c a g g a a a c a g c t a t g a c c a 3 引物 2为 5 c g t t g t a a a a c g a c g g c c a g3 3 . s ma r t t m p c r c d n a分析试剂盒从c l o n t e c h公司购买。 4 . d i g d n 标记检测试剂盒和 a n t i - d i g o x i g e n i n - p o d ( h o r s e - r a d i s h p e r o x i d a s e , p o d ) 从b o e h r in g e r m a n n h e i m公司 购 买。 5 . 硝酸银 染色试剂盒从p r o m e g a 公司 购买。 6 . 其他主要试剂 t 4 d n a l i g a s e , r n a s e , p r o t e i n a s e k , p u c 1 9 , 氨节青 霉素 ( 华美生 物i 程 公司 ) ; c i p ( 牛小肠碱性磷酸酶) ， k ie n o w f r a g m e n t , i p t g , x - g a l, k ie n o w酶 ( p r o m e g a ) , 硫酸葡聚糖,p u c 1 9 , 1 . 3 菌种: e s c h e r i c h i a c o l i d h s a ( 细 胞生物学实验室惠赠 ) 1 . 4 实验主要仪器 p c r仪为英国t e c h n e 公司生产的p r o g e n e r c r 循环仪; 电泳仪为北京东方仪器厂生产的恒压d f - d型电泳仪; 高压电泳仪为g i b c o公司生产的4 0 0 1 p w: 第1 8 页 南开大学硕士研究生毕业论文 电泳槽为国产d f - 6 型; 分光光度仪为北京东方仪器!生产的7 5 2 型分光光度仪 2 .实验方法 2 . 1 总 r n a的提取及处理 主要参照异硫氰酸呱一步抽提法 ( c h o m c z y n s k i p , s a c c h i n , 1 9 8 7 ) 提取 植物总r n a . 1 . 取0 .2 克全花用液氮研磨成粉末， 加入2 m 1 s o l u t i o n d( 异硫氰酸呱4 m , 柠檬酸钠 2 5 m m， 十二烷 基肌氨竣钠 0 . 5 %,琉基乙醇 i o o m m )和 。i体积 2 m p h 4 .0 的醋酸钠， 研磨至清亮， 转入7 m l 的离心管中，加入巧6 川琉基乙 醇，混匀后加入 1 体积水饱和酚和 0 . 2体积氯仿一 异戊醇 ( 4 9 : 1 ) ,混匀后静 置 2 0分钟。 2 . 4 0 c , 1 2 0 0 0 r p m离心2 0 分钟。 取上 清转入另一 个7 m 1 的离心管中，加 入2 . 5 倍体积的无水乙醇混匀，- 2 0 0 c保存 2 小时二 3 . 4 0 c , 1 2 0 0 0 r p m离心2 0 分 钟，去 上 清， 用3 m酷酸钠6 0 0 p 1 洗两次， 再用7 5 % 的乙醉6 0 0 州洗两次，真空干燥1 5 分钟，加入6 0 闪 d e p c 水溶解。 4 .取出2 川于2 m l 蒸水中测o . d值。 以上操作在冰浴中进行) 。 5 另取出2 u 1 4 2 0 c 保温2 小时后， 进行琼脂糖凝胶电泳检测，并照相。 2 . 2 c d n a的获得 将黄花和白花各十株花椰菜的总 r n a混合，取适量作为模板按照 s m a r t c d n a p c r试剂盒说明书进行。 a 第一条c d n a的合成 1 .将以下试剂加入一个干净的0 .5 m 1 的离心管中: 2 e t l 总r n a样品 ( 约0 _ s u ) l l t l c d n a合成( c d s ) 引物 ( l o u m ) i l t l s m a r t 1 1 寡聚合营酸 ( 1 0 4 m) 1 u 1 无 离 子水 5 w 1 第1 9 页 南开大学硕士研究生毕业论文 2 .将混合物轻轻混匀 3 . 7 2 0 c温浴 2分钟后 再 加入 稍离心; 冰浴 2分钟 4 .稍离心后 2 1 1 1 5 x 第一条链的缓冲液 i 1 i 1 d t t ( 2 0 m m) 1 1 l 1 d n t p ( 1 o m m) 1 a l一 - m m l v 返# i 垦 丝 ( 2 0 o u / u l ) 1 0 林 1 5 .将混合物轻轻混匀，稍离心; 6 . 4 2 0 c温浴1 小时后，转移到冰上终止反应: 取出2 闰用于 l d - p c r ; 余下的放置在一 2 0 0 c保存。 b 用 l d - p c r扩增 c d n a 1 _ 将以下试剂加入一个干净的0 . 5 m 的离心管中: 8 0 闪无离子 水 i o u l 1 0 x c d n a p c r缓冲液 2 1 x 1 d n t p 4 1x 1 p c r引物 一一一 2 0 一 5 0 x c d n a聚合酶混合物 9 8 u 1 2 将混合物轻轻混匀，稍离心， 3 加入合成好的第一条c d n a链2 闰，混匀; 4 按以下循环进行p c r扩增: 9 5 0 c 9 5 0 c 6 5 0 c, 6 8 0 c, 1 分钟; 巧秒 3 0 秒 6 分钟重复进行 玲个循环。 第2 o a 南开大学硕士研究生毕业论文 6 - 取5 w用1 。 % 的琼脂糖凝胶电 泳检测， 2 . 3 a f l p 扩增和聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( 1 ) a f l p扩增 表 1 a f l p 接头及引物序列 t a b l e 1 t h e s e q u e n c e s o f a f l p a d a p t e r s a n d p r im e r s e c o r i 接头 ( a d a p t e r ) 5 - c t c g t a g a c 丁 g c g t a c c - 3 3 - c a t c t gac gca t ggt t aa- 5 ms e l 接头 ( a d a p t e r ) 5 - g a c g a t g a g t c c t g a g - 3 3 - t act c aggact ca t - 5 预 扩增引物 ( p r e - a m p l i c a t io n p r i m e r ) e o 5 - gac t gcgt ac caa t t c - 3 mo 5 - ga t gagt c c t gagt aa- 3 选 择 性引 物 s e le c t iv e p r im e r e l 5 - gact gcgt a cc aa t t ca cg- 3 e 2 5 - gac t gc gt ac caa t t ca gg- 3 m1 5 - g a t ga gt c c r ga gt a ac a g- 3 m2 5 - ga t gagt cc t gagt aact c - 3 m3 5 - ga t g agt cc t gagt aact g- 3 m4 5 - ga t g agt c c t ga g t aa c a c - 3 m5 5 - ga t gagt c c t g agt aa ca t - 3 m6 5 - ga t gagt c c t gagt aact a- 3 m7 5 - g a t gagt c c t gagt aac t 丁 一 3 a f l p试剂盒购自g i b c o - b r l公司，操作步骤如 卜 : i .总体d n a限制性酶切反应 酶切反应体系2 5 川，体系中含 有5 日s x 酶切反应缓冲液 ( 5 0 m m t r i s - h c i p h 7 . 5 , 5 0 m m m g a c . , 2 5 0 m m k a c ) , 2 5 0 n g 总体d n a , 2 . 5 u e c o r i 酶， 2 . 5 u m s e l 第2 1 页 南开大学硕士研究生毕业论文 酶，3 7 0c 酶切3 小时。 2 接头连接 限制性酶消化产物中，再加入 1 州 t 4 d n a连接酶 ( i u / 4 1 ) , 2 4 闪接 头混和液 ( 0 .4 m ma t p , l o m m t r i s - h c i p h 7 . 5 , l o m m m g a c , 5 0 m m k a c , 5 p m e c o r i 接头，5 0 p m m s e i 接头) ， 3 7 连接过夜。 接头序列见 表t o 3 连接产物的预扩增 取5 p 1 连接 产 物， 加入4 0 p 1 预 扩增混 和液( 1 5 0 n g m 0 0 引 物， 1 5 0 n g e o 0 引 物， 0 .2 5 n 1 m d n t p s ) , s p i i o y p c r缓冲液( 2 0 0 m m t r i s - h c i p h 8 .4， 1 5 m m m g c l 2 , 5 0 0 m m k c l ) 。 进 行p c r 扩增， 反 应条 件为: 9 4 1c 3 0秒 5 6 0c 1 分钟 7 2 0c i 分钟，共进行2 0 个循环。引物序列见表t o 4 选择性扩增 将预扩增产物稀释 1 0倍后， 取 5 闪做模板，加入。 1 8 p le c o r 1 引物 ( 2 7 .8 n g t p l ) , 4 . 5 g m s e i 引 物 ( 6 . 7 n g t p 1 , i m m d n t p s ) , 2 4 1 1 o x p c r缓冲液 ( 2 0 0 m m t r i s - h c i p h 8 .4，1 5 m m m g c l2 , 5 0 0 m m k c i ) , i u t a q酶，补 水至2 0 州。 p c r反应条 件为: 9 4 0c 3 0秒 6 5 1c 3 0 秒 7 2 1c i 分钟，以后每个循环复性温度减0 . 7 c ，共计 1 3 个循环。 9 4 0c 3 0秒 5 6 0c 3 0秒 7 2 c 1 分钟，再进行2 3 个循环。 ( 2 ) 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳 配制 6 %的变性聚丙烯酞胺凝胶 ( 6 %丙烯酞胺，0 . 3 2 %甲叉丙烯酞肢 7 m o l / l尿素，i x t b e ) ， 采用国 产 d f - 6型电 泳槽 ( 购自 北京东 方 特力 科贸 中心) ，恒功率 3 0 w 预电泳 3 0分钟。将扩增产物加入等体积的上样缓冲液 第2 2 页 南开大学硕士研究生毕业论文 ( 9 8 %甲酞胺，1 0 m m o l 几 e d t a