（材料学专业论文）化学法与电化学法制备HACOL复合层的研究.pdf

中文摘要 本文主要研究了用化学法和电化学法制备h a i c o l 复合层的工艺，利用扫 描电子显微镜( s e m ) 、x 射线衍射o c p d ) 、红外光谱( i 】时、x 射线光电子能谱( x p s ) 和透射电子显微镜( t e m ) 等检测手段以及划痕实验、体外细胞培养实验对复合涂 层的形貌、结构、性能进行了表征。 一实验结果表明：在高钙磷离子浓度的改进模拟体液( m s b f ) q b ，通过d h 的控 制可在n i t i 合金表面化学仿生生长( b g ) 碳酸h a c o l 复合层，且比l x s b f 中形 成的复合层的结晶度提高。复合层中h a 的c 轴平行于c o l 纤维的纵向方向， 这与人骨中磷灰石晶体和胶原纤维的结构取向相同。 电化学沉积法( e l d ) 帛i j 备的h a c o l 复合层形貌和结晶度均与b g 法制备的 复合层有差异。电化学沉积化学仿生复合生长法( e b g ) 可以诱导形成结晶更好、 厚度更大的复合涂层，且该复合层中有机无机相也具备与b g 法中相同的类骨 结构。e l d 和e b g 法制备的呲o l 复合层的结合性能优于b g 法。而体外细 胞培养实验则证明b g 法得到的复合层的细胞相容性是三种方法中较好的。 眦o l 复合层在基体表面形核受蝴o l 在溶液中析出动力学影响。e l d 法的电流密度值在很大程度上取决于电解液中钙磷离子浓度。b g 、e b g 法的复 合层结晶更好是受界面离子过饱和度和界面p h 的控制。h a c o l 复合层的表面 晶体排列、涂层粗糙度、外加电场等因素与基体涂层的结合性能有关，而复合 层表面形貌、涂层c a - p 溶解能力则会对细胞培养结果产生影响。 关键词：h a c o l 复合层；改进模拟体液；化学仿生生长；电化学沉积 a b s t r a c t i nt h i sw o r k , t h eh y d r o x y a p a t i t e ( h a ) - c o l l a g e n ( c o l ) c o m p o s i t ec o a t i n gp r e p a r e d b yb i o m i m e t i cg r o w t h g ) a n de l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o n ( e l d ) w a ss t u d i e d s e m ， x r d ，i m , x p s ，t e m ，s c r a t c ht e s ta n di nv i t r oc e l lc u l t u r ee x p e r i m e n tw e r ee m p l o y e d t oi n v e s t i g a t et h em o r p h o l o g y , m i c r o s t r u c t u r ea n dp r o p e n t yo ft h ec o m p o s i t ec o a t i n g s t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ec a r b o n a t eh a c o lc o m p o s i t ec o a t i n gc o u l db e o b t a i n e di nm o d i f i e ds i m u l a t e db o d yf l u i d ( m s b f ) b yr i s i n gp h c o m p a r e dw i t ht h e c o a t i n gf o r m e di ns i m u l a t e db 0 0 yf l u i d ( s b f ) ，t h ec o a t i n gb i o m i m e t i c a l l yg r o w ni n m s b fp o s s e s s e dah i g h e rd e g r e eo fc r y s t a l l i n i t y i nt h ec o m p o s i t ec o a t i n g ，t h ec a x i s o fh ac r y s t a l sa l i g n e dp a r a l l e lt ot h el o n g i t u d i n a ld i r e c t i o no ft h ec o l l a g e nf i b r i l s ， w h i c hw a ss i m i l a rt ot h er e l a t i v eo r i e n t a t i o ni nn a t u r a lb o n e b o t hm o r p h o l o g ya n dc r y s t a l l i n i t yo fe l dc o a t i n gw e r cd i f f e r e n tf r o mb g c o a t i n g i tw a sa l s op r o v e dt h a te b g ( r e - s o a k i n ge l dc o a t i n gi nm s b fa g a i nf o r f u r t h e rb i o m i m e t i cg r o w t h ) m e t h o dc o u l di n d u c ead e n s e r , t h i c k e ra n db e t t e r c r y s t a l l i z e dh a c o lc o a t i n g m o r e o v e r , e b gc o a t i n gs h o w e dt h es a m es t r u c t u r a l o r i e n t a t i o nb e t w e e nh aa n dc o l ，w h i c hh a db e e nf o u n di nb gc o a t i n g e l da n d e b gc o a t i n g sd i s p l a y e dt h eh i g h e rl o a d i n gf o r c et h a nb gc o m i n gi nt h es c r a t c ht e s t h o w e v e r , t h eo c t - lo s t e o b l a s t - l i k ec e l l sc u l t u r ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tb gc o a t i n g p r e s e n t e db e t t e rp r o p e r t yi nc e l l sb i o c o m p a t i b i l i t y t h en u c l e a t i o no fh a c o lc o m p o s i t e0 1 1s u b s t r a t ew a si n f l u e n c e db yk i n e t i c so f h a c o l p r e c i p i t a t i o n t oal a r g ee x t e n t ，t h ee l i ) c u r r e n td e n s i t yw a sd e p e n d e do n c aa n dpi o n sc o n c e n t r a t i o n si ne l e c t r o l y t e b e t t e rc r y s t a l l i z e db ga n de b gc o a t i n g s a r ea s c r i b e da st h ec o n t r o l so fi o n i cs u p e r s a t u r a t i o na n di n t e r r a c i a lp h w es u g g e s t e d h e r et h a tt h ec o m p o s i t ec o a t i n gr o u g h n e s s ，c r y s t a l sa r r a n g e m e n ta n de l e c t r o s t a t i c a t t r a c t i o ne f f e c th a dt h ei m p a c t so na d h e s i o ns t r e n g t hb e t w e e nc o a t i n ga n ds u b s t r a t e o nt h eo t h e rh a n d ，t h er e s u l t so fc e l lc u l t u r et e s tw e r ei n f l u e n c e db ys u r f a c e m o r p h o l o g ya n dc a pd i s s o l u t i o no fc o m p o s i t ec o a t i n g k e yw o r d s ：h m c o lc o m p o s i t ec o a t i n g ；m o d i f i e ds i m u l a t e db o d yf l u i d ； c h e m i c a l l yb i o m i m e t i cg r o w t h ；e l e c t r o c h e m i c a ld e p o s i t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：胡亏皆 签字日期：2 。口7 年，月2 岁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解叁鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明j 学位论文作者签名： 胡锴 签字日期：加口7 年，月2 弓日 导师签名：扔埃釜 签字日期：卅年 1 月“日 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 随着科学技术进步和生产力的迅速发展，人们生活水平得到提高，如何改善 康复治疗水平以提高患者的生活质量也受到了重视和关注。生物医学工程学的快 速发展为实现这一需求提供了可能，其研究热点之一是对新型生物医用材料的探 索。生物医用材料是对生物机体进行诊断、治疗及用以置换损坏的组织、器官或 增进其功能的材料，而硬组织修复材料一直是生物医用材料的研究热点 1 ，2 。 修复因外伤、炎症、肿瘤和先天畸形等原因所造成的骨缺损，对解除千百万 患者痛苦以及恢复患者硬组织功能，无疑具有重大意义。自体移植( a u t o g r a f t ) 或 者异体移植( a l l o g r a f f ) 是当前对骨损伤进行修复的手段之一。自体骨易被患者接 受，但会给患者带来别的损伤；异体骨取材简便，但是在生物安全性上存在相当 的隐患，患者有可能对其产生免疫排斥。所以，临床上越来越广泛地采用人工制 备的材料作为硬组织修复材料。在美国每年1 , 2 3 0 ，0 0 0 例骨修复手术中约8 0 需 植入人工材料 3 】。 硬组织修复材料是生物医用材料中发展最早最成熟的一个领域，其研究及开 发是当前生物医用材料中全球关注的课题，是生物材料中非常活跃的方向。金属 材料作为最早被使用的硬组织修复、替代材料，以其优异的力学性能在最初的研 究和应用上得到了巨大发展。为了摆脱金属材料自身的缺陷( 如腐蚀性能差，生 物相容性不佳等) ，近年来，针对该类医用材料的表面改性工作进行的方兴未艾。 1 2 骨组织的成分和结构 1 2 1 骨组织的成分 骨是天然的生物复合材料，其主要组成是水，有机物和无机盐等 4 。其水 的含量较其他组织少，平均约为2 0 。2 5 。在剩余固体物质中，约4 0 是有机物， 约6 0 是无机盐，其中无机盐决定骨的硬度，有机物则决定骨的弹性和韧性【5 。 成熟骨的有机物中9 0 9 5 为胶原( c o l l a g e n ，c o l ) ，其余为糖胺聚糖、其它 蛋白质、肽类及酯类。无机盐中磷酸钙类矿物占有质量的6 0 7 0 ，其中最主要 的相是羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) ，除了钙离子，骨中还有少量的镁离子、 第一章文献综述 钠离子以及极少量的钾离子；而阴离子除磷酸根是主要的以外，还有一些碳酸离 子和柠檬酸离子以及少量氯离子和氟离子 5 】，c 0 3 2 - 可取代o h - 或p 0 4 3 。的位置而 形成a 型或b 型碳酸磷灰石( c h a ) 。此外，骨中还存在非晶磷酸钙( a c p ) 、磷酸 八钙( o c p ) 、二水磷酸氢钙f d c p d ) 等多种矿物相【4 】。 1 2 2 骨组织的结构 骨骼可视为一种天然生物材料，它具有不同尺度上的自组装多级结构 4 ， 胶原纤维中的原胶原( t r o p o e o l l a g e n ) 分子是由三股伍螺旋结构的多肽链相互缠绕 而形成，具有三重螺旋结构。这种原胶原分子沿着一个相互错开1 4 的阵列规则 排列即构成胶原纤维，骨中的矿物相呈片状，尺寸约为5 n m x 2 0 n m x 4 0 n m ，位于 原胶原分子间隙孔之内，晶体的c 轴平行于胶原纤维，这样就构成了骨的基本微 结构 6 。 通常，骨头围绕血管呈同心圆层，在大部分区域中，所有骨胶原纤维都是平 行的，但每一层纤维的方向是不同的，在连续的层中纤维可由纵向变为环向，或 由左螺旋变为右螺旋。纵向纤维和环向纤维共存的结构使得骨骼具有抗拉( 纵向 纤维为主) ，抗压( 环向纤维) 为主等很好的力学性能。此外，骨骼的空心结构也赋 予骨的多种优越的力学性能 5 】。 骨的上述结构使其能够保证人体的机械稳定性，保护纤弱的器官，并作为肌 肉的附着体使身体能产生运动。 1 3h a 与c o l 的基本性质 1 3 1h a 羟基磷灰石是磷灰石的典型结构，无味无嗅、白色半透明粉末，是严格化学 组成的化合物，其单元晶胞的原子组成以分子式 c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，c a s ( p 0 4 ) 3 0 h 或3 c a a ( p 0 4 ) 2 c a ( o h ) 2 来表示，溶度积常数k s p ( 2 5 c ) = ( 6 3 2 1 ) x1 0 巧9 ，c a 占重 3 9 6 8 ，p 占重1 8 4 5 ，c a p 重量比为2 1 5 1 ，c a p 摩尔比为1 6 9 + o 4 ( 化学计 量理论值c a p - - 1 6 7 ) ，密度为3 1 6 9 c m 3 ，性脆，折射率为1 6 4 一1 6 5 ，线性热膨 胀系数为1 5 x 1 0 击k - 1 ，微溶于水，水溶液呈弱碱性( p h 7 9 ) ，易溶于酸，难溶于碱 7 】。 h a 的晶胞为六方晶系，属l 6 p c 对称型和p 6 3 m 空间群，是正交菱形柱体 无限重复而生成的一种简单的六角晶格，a a b - - 1 2 0 ，a ac = b ac = 9 0 c ，晶胞 参数为a = b = 0 9 4 3 2 n m ，c - - 0 6 8 8 l n m 。 第一章文献综述 h a 晶粒可能存在的几种表面状态 8 】：当o h 位置位于晶体表面时，该位置 连着两个c a 离子，在水溶液中，这个表面的o h 。位置至少在某一瞬间空缺， 由于两个c a 离子带正电，形成一个吸附位置，该位置能吸附p 0 4 孓、大分子上 的磷酸根基团或羧基基团。当c a 位置位于晶体表面时，由于c a ( i ) 连着六个带负 电荷的o 原子，c a ( i i ) 连着三个带负电荷的0 原子，在水溶液中，表面的c a 位 置至少在某一瞬间空缺，c a ( i ) 位置就形成了一个较强的吸附位置，能吸附s r ， k 等阳离子以及蛋白质分子上的基团，而c a ( i i ) 位置则形成一个较弱的吸附 位置。当p 0 4 3 位于晶体表面时，h 2 0 通过氢键与p 0 4 3 - 结合，h a 的表面水化层 借氢键与水有很好的相容性，所以h a 在水中的表面能较低，能长时间保持细小 的分散状态。 生物磷灰石( b i o l o g i c a la p a f i t e ) 广泛存在于哺乳动物的骨骼和牙齿中，也存在 于人体的一些病态组织中( 如唾液结石、脑结石、尿道结石) 之中，具有与h a 同 样的组成和结构，通常以羟基磷灰石表征，但其与h a 在化学计量、化学组成以 及结晶度等方面有一定差异。因此，生物磷灰石更接近碳酸羟基磷灰石( c h a ) 9 1 。 1 3 2c o l 胶原( 或称胶原蛋白) 是蛋白质的一种，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙 齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极其重要的结构蛋白质，起着支撑器官、 保护机体的功能。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的 2 5 3 0 ，相当于体重的6 1 0 】。 胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本组成单位是原胶原蛋白分 子，长度为2 8 0 n t o ，直径为1 s n m ，分子量约为3 0 0 ，0 0 0 ，每个原胶原分子由三 条n 肽链组成，洳肽链自身为( i t 螺旋结构，三条叶肽链以平行、右手螺旋形式缠 绕成草绳状结构，再经分子间的多级聚合形成胶原纤维。稳定原胶原三螺旋的力， 一是螺旋间的范德华力，二是螺旋间的氢键，三是链间的共价交联键【l l 】。 胶原的一些基本物理化学性质如下：胶原与其他蛋白质一样，也是一种聚两 性电解质，胶原每个肽链具有许多酸性或碱性的侧基，且肽链两端有a 羧基和仅 氨基，这些基团具有接受或给予质子的能力。对蛋白质来说，它在某一p h 值的 溶液中表现出不带电荷，呈两性离子状态，此p h 即是蛋白质的等电点( i s o e l e c t r i c p o i n t ，i p ) ，胶原的等电点是p h 7 5 7 8 ，呈现偏碱性，经碱法和酸法制得的胶原 蛋白的等电点差别很大。胶原在水溶液中具有胶体性质，其与水分子以氢键结合， 在胶原分子周围形成一层水分子膜，从而发生水合作用，若提高温度，延长水的 浸泡时间，胶原可进一步吸水，形成亲水胶体。外部条件的变化可使胶原溶液发 生凝固沉淀的变性反应，称作胶原的凝胶( g e l a t i o n ) 。胶原与亚硝酸、甲醛、茚三 第一章文献综述 酮反应可进行氨基酸测定。胶原在盐溶液中其肽链间的离子键会被打开，从而吸 水膨胀。 胶原蛋白所特有的三重螺旋的氨基酸结构使它具有许多很有用的特性，如 高拉伸强度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性和低细胞毒性以及促进细胞 生长的性能。所具有的这些特性都使其成为一种理想的生物医用材料 1 2 】。 1 4h a 与c o l 的仿生复合 在微观尺度上理解骨是磷灰石胶原复合材料，这是制备生物活性陶瓷聚合 物类骨仿生复合材料的基础，目前主要是通过羟基磷灰石与胶原复合的方法制备 骨修复和替代材料 1 3 】。从总体上，可以将h a c o l 的仿生复合分为h a c o l 复合支架材料和涂覆在金属基体表面的h a c o l 复合活性层。以下从这两个角 度对制备工艺进行综述。 1 4 1h a c o l 复合支架材料 从查阅到的文献资料看，自上世纪8 0 9 0 年代就已经开始出现了h a c o l 复 合材料的相关报道，尤其是最近几年，研究使用h a c o l 复合材料制各骨修复 和替代材料，已成为硬组织生物医用材料的热点，形成多种相关的制备方法。 1 4 1 1 磷酸钙( c a p ) 溶液浸泡法 g k h u n t e r 1 4 研究了在胶原凝胶( c o l l a g e ng e l ) 上复合h a 的方法。作者从鼠 尾部肌腱提取i 型胶原，经酸处理提纯后溶于2 0 r a mh c l 溶液中，胶原的浓度为 5 m g r n l ，之后再加入1 mt r i s h c l ( p h 7 4 ) ，5 mn a c i ，0 2 mn a 3 p 0 4 ( p h 7 4 ) 和抗 生素溶液的混合液，胶原被稀释后的浓度为2m g m l ，在4 连续搅拌防止凝胶； 溶液除气后于3 7 c 静置1 2 h ；凝胶产生之后，在3 7 恒温下将含有e a c h 的溶液 加入凝胶相上，反应完毕收集析出物。通过粉末x r d 衍射照片说明凝胶上的析 出物是h a 晶体。在h a 形成的动力学分析中，用溶液4 5 c a 的变化量与反应时 间线性图说明h a 析出的时间在反应开始1 8 2 4 h 之后，即存在一个所谓的“孕 育期”。此外还研究了硫酸软骨素( c s ) 的加入对h a 形成的影响，认为高浓度的 c s 会延缓胶原凝胶上h a 的形核，且最终h a 的析出量也会减少。 n j m a t h e r s 1 5 用不溶性胶原为基体，在不同浓度h a 的溶液中浸泡得到复 合材料。其方法是从牛跟腱中提取i 型胶原，经处理并预浸入l m m 乙醇酸中形 成凝胶，然后将胶原基体先在2 0 m l 钙溶液中浸泡l h ，蒸馏水清洗5 m i r a 再浸 入3 m m 和l m mh a 溶液中分别1 h ，2 h ，1 0 h ，浸泡1 0 h 后的胶原用蒸馏水清洗 第一章文献综述 2 4 h 。作为对比，重复整个过程，只是去掉两次水洗过程。通过s e m 观察，在胶 原基体上都形成了外表为六方形的h a 小颗粒，若不用水洗，晶体的形核更加完 全，在基体上的覆盖更加广泛。按照g k h u n t e r 1 4 的理论，h a 在胶原上的形 核需一个2 4 h 的孕育期，但本文由于胶原经乙醇酸预处理，纤维强烈交联，导致 形核时间大为缩短，可见胶原的凝胶形式利于h a 的形核，但h a 与c o l 之间 的键合变弱，使得晶体易于在水洗中脱落。 e z c u i 1 6 错l j 各的原材料是购买的h a 粉末和i 型不溶性胶原。在2 0 将 l g h a 溶入1 5 0 m l h c i ( 0 1 m ) ，同时再加入4 5 0 m g c o l ，超声处理后获得混合物 的浆体；然后用2 0 0 0 m l 去离子水稀释，加入2 3 3 7 6 9 n a c l 以增强含c a 溶液的 稳定性，从而得到p h = 3 的5 m mc a 溶液：在2 0 c 搅拌溶液，滴入0 0 5 mk o h 调节p h 至7 4 ，当p h 超过7 0 ，溶液过饱和，h a 开始在c o l 上析出，保持p h 7 4 ， 1 0 m i n 后将复合物离心清洗，冷冻干燥。通过形貌、结构分析说明c o l 基体上 形成的是h a 纳米晶体，但矿化的h a 在c o l 上并没有显现出任何择优取向。 利用同样的方法，c u i 1 7 1 在止血海绵i 型胶原板上矿化得到多孔h a c o l 三维 支架，着重研究了该材料的细胞相容性。将鼠的颅骨取出，切碎，在e a g l e s 溶 液中培养，保持潮湿环境( 含c 0 25 ) ，3 7 恒温，e a g l e s 溶液一周更换2 次； 把h a c o l 支架浸入培养液，在骨碎片嵌入支架材料后，将h a c o l 复合模板 卷曲，在上述环境中保持2 1 天。结果表明复合模板的多孔结构为细胞连接提供 了很大表面，有足够空间便于营养物质的运输，纺锤状细胞从骨碎片中迁移出来， 增殖并沿卷曲体系扩展，支架内的细胞最终形成三维多边形，而新骨就在 h a c o l 复合材料与骨碎片的界面处形成。 a b i g i 1 8 研究了去钙化的鸡腿腱在不同浓度的磷酸钙溶液中再次钙化的过 程。其实验方法是从鸡腿腱提取胶原，于1 8 冷冻直至使用。将胶原切成 1 l 3 咖3 大小，用中性e d t a 去钙化；之后用大约1 0 0 r a g 的样品浸于1 0 0 m l 磷酸钙溶液中，在4 0 m mh e p e s 溶液中缓冲( p h 7 4 ) ，其中磷酸钙溶液的浓度为a ： c a 2 + 4 5 m m ，p 0 4 3 - 2 。7 m m ，b ：c a 2 + 2 4 m m ，p 0 4 3 1 4 4 m m ，c ：c a 2 + 1 8 r n m ， p 0 4 3 。1 0 8 r a m ，d ：c a 2 + 1 2 m m ，p 0 4 3 - 0 7 2 r a m ，室温下放置不同时间( 1 3 0 d ) ；取 出后清洗，空气中干燥。结果表明，钙化液a 由于c a p 浓度太高，h a 析出过快 而无法与c o l 反应，钙化液d 则由于c a p 浓度太低而阻碍了无机相的沉积。通 过大d , 角度x r d 分析，在钙化液b 、c 沉积的磷酸钙晶体的c 轴都择优平行于 胶原纤维轴生长，c 中也有择优取向垂直于纤维轴生长的情况。此外，在一定钙 化液浓度下，磷灰石的沉积会导致胶原轴向电子密度分布的改变，这可能与无机 相在胶原结构的间隙区域沉积有关。 y d o i 1 9 用重组胶原凝胶和胶原膜在p 甘油磷酸钙溶液中制备磷灰石一胶 第一章文献综述 原复合材料。方法是：对购买的i 型胶原溶胶( 0 5 ，加h c i ，p m o ) 分别进行处 理，制成重组胶原凝胶和1 0 r a m 宽2 0 3 0 r a m 长的胶原膜；两种胶原材料在3 7 浸入3 0 m lt r i s 溶液( 2 0 0 m m ) 中6 d ，该溶液包含碱式磷酸盐( o 1 3 9 9 m l ) ，卵黄高 磷蛋白( 0 1 3 9 9 m l ) 和有机交联溶剂( 1 m g m l ) ，交联后c o l 用2 0 0 r a mt r i s 洗涤 几次，除去未反应的化学品和副产品；6 0 m g 胶原先浸入l o m l 的t r i s ( 含碱式磷 酸盐和卵黄高磷蛋白各0 1 3 9 9 m l ) q b3 h ，3 7 ，再浸入4 0 m l 的肛甘油磷酸钙 溶液( 6 r a m ) 中2 0 h ，用2 0 0 r a mt r i s 溶液缓冲，并分别重复1 4 ，2 8 次，每次结束 后清洗处理。通过对两种不同胶原基体的复合材料的形貌、成分和相容性评价， 认为可作为骨替代材料。 1 4 1 2 模拟体液( s b f ) 浸泡法 s h r h e e 2 0 配置了1 s x s b f ，溶液在p h 7 4 ，3 6 5 c 下用( c h 2 0 h ) 3 c m - 1 2 ， 1 mh c i 缓冲，加入l m m 的柠檬酸，再用( c h 2 0 h ) 3 c n h 2 将p h 调至7 4 备用； 从牛皮中提取无活性c o l 膜，经处理后切成l c m x i c m x 0 i c m ，3 6 5 下浸入 3 0 m l 上述1 5 x s b f 中一周，取出后清洗，常温干燥。用不舍柠檬酸的s b f 重复 实验过程以作对比。由于所用的c o l 膜无生物活性，分子间没有化学结合，因 而在s b f 中不能诱导h a 形核。通过s e m 、x r d 、f t i r 分析说明加入柠檬酸 ( c 6 h s 0 7 ) 的s b f 能使h a 沉积在c o l 膜上。作者解释为c 6 h s 0 7 分子中含三个羧 基，在p h 7 4 的s b f 中失去寸变b ( c 6 i q 5 0 7 ) 孓，可以与c a 2 + 结合，从而诱导h a 形核。类似的实验结果作者在文献 2 1 中也有阐述。此后作者 2 2 】又研究了用活 ：性c o l 膜重复上述实验过程，得到了h a c o l 复合材料。从f t i r 分析中可看 到复合材料的c 0 0 吸收峰较纯胶原c 0 0 有所偏移，证明c a 2 + 与羧基之间有反 应，为复合的机理提供了证据。 r h o w l e t t 2 3 使用s b f 化学法制备多孔h a c o l 复合材料。作者将胶原分 散液倒入直径8 m m 的圆形塑模中冻干，c o l 支架经2 5 w v 戊二醛( g a ) 蒸气交 联处理4 、8 、2 4 h 后取出，去离子水清洗，冻干并用氧化乙炔消毒，待用：配置 s b f ，p h 7 2 5 ，加入无菌的硅酸钙玻璃粉末0 2 5 9 ，3 0 r a i n 后待玻璃沉淀后将干燥 的c o l 支架浸入s b f 形核溶液中，3 7 恒温分别保持2 d 和4 d ；再将支架浸入 无菌的1 5 x s b f 生长溶液中( 之前形核溶液中浸泡2 d 的，这里浸泡l d 和1 1 d ， 。形核溶液中浸泡4 d 的，这里浸泡1 4 d ) ，取出后去离子水清洗，冻干。s e m 对 h a 的形核长大过程描述的很清晰。作者对队形核动力学进行了简单推测，认 为加入的硅酸钙玻璃对形核有一定影响作用。此外戊二醛交联处理起到了稳定 c o l 支架的作用。 x s f e n g 2 4 报道了i 型c o l 膜浸入s b f 中仿生生长h a ，从而制备复合材 第一章文献综述 料的方法。实验者购买医用止血海绵作为实验c o l 膜材料，切成一定尺寸的条 带备用；配置1 5 x s b f ，p h 7 4 ，加入0 0 1 m ( c h 2 0 h ) 3 c n h 2 和0 0 1 mh c l 缓冲， 温度保持3 7 o 0 5 ；c o l 膜浸入s b f ，密封，静置，定期观察。对比实验是 将c o l 膜浸入蒸馏水中。c o l 膜取出后清洗5 次，空气中干燥。通过显微观察 以及x r d 分析可知h a 在胶原膜上沉积生长。f t i r 分析结果表明c 0 3 2 部分取 代了h a 晶体中p 0 4 的位置，即磷灰石中含有少量碳酸钙；c o o 吸收峰较纯胶 原c o o 发生偏移，说明c o l 与h a 有某种反应，另外氨基可能也有小幅偏移， 作者推断c o l 膜的羧基和氨基为h a 提供了形核位置。 1 4 i 3 共沉积法 德国德累斯顿工业大学j - h b r a d t 和m m e r t i g 2 5 最先提出了共沉积法制备 h a c o l 复合材料的观念，将胶原纤维的自组装和磷酸钙的析出合成一步完成， 从而获得矿化的胶原凝胶。具体方法是：4 下将i 型酸性可溶c o l 溶解于1 0 m m h c i ( c o l 浓度为l m g m l ) ，将1 0 8 1 x l c a c l 2 水溶液( o 1 m ) 和6 0 0 i t l 胶原溶液混合， 缓冲液由1 6 0 p l ( c h 2 0 h ) 3 c n h 2 ( 0 5 m ，用h c l 调节p h 7 4 ) ，11 0 皿n a c i ( 2 m ) ， 2 1 6 1 t lk h 2 p 0 4 k 2 h p 0 4 ( 0 5 m ，p h 7 4 ) 和5 2 8 1 a l 水混合配置而成；将4 9 2 i t l 缓冲 液加入c o l 溶液，最终的浓度是c o l0 5 m g m l ，c a c l 29 r a m ，h 3 p 0 45 4 m m ， n a c l11 0 m m ，( c h 2 0 h ) 3 c n h 24 0 m m ，以上过程的温度均控制在4 ；将混合物 倒入预先加热的光度计试管中，这样可保证3 0 的反应温度在几分钟内达到， p n 6 8 。反应完毕，用吸管取几m l 矿化c o l 凝胶，滴在s i 基体上，放置l m i n ， 用滤纸吸去液体，再滴入一滴去离子水，用滤纸吸走盐类，重复2 次，待干燥后 进行s e m 、s f m 分析，通过观察可看到纤维的周期性排列以及h a 晶粒在纤维 上平行或垂直的择优取向。矿化c o l 凝胶离心清洗后分散于去离子水中，反复 三次，于- 8 0 冷冻干燥后进行x r d 和瓜分析，结果表明矿化是h a 和o c p 的 复合产物，x r d 中垂直于c 轴的( 0 0 2 ) ( 0 0 4 ) 面的峰最尖锐，证明该面晶化程度高， 是复合过程中形成的织构。作者认为该方法首先是c o l 纤维同无定形c a p 相的 共同形成，而后是c a p 转变成晶体相，但要获得均匀的矿化c o l ，必须严格控 制实验条件和c a p 浓度。此外，作者还讨论了聚天冬氨酸j j 旨( p o l y a s p a r t a t e ) 的加 入对h a - c o l 键联的影响，认为该物质吸附在c a p 晶体表面，是一种很好的分 散剂，该带电表面引起c a p 负电晶体之间的斥力，而使其与带正电的c o l 纤维 之间产生吸引作用，明显改善了c a p 与c o l 的连接。 日本国家材料科学学院( n i m s ) 生物材料中心的j t a n a k a 、m k i k u c h i 课题组 对h a c o l 复合材料进行了一系列卓有成效的研究 2 6 - 2 9 】。该小组制备的基本 工艺是 2 6 】：从猪的皮肤组织中提取胶原，分散于h 3 p 0 4 水溶液中，将c a t 3 水化 第一章文献综述 获得的c a ( o h ) 2 悬浊液与上述混合溶液，用自动滴定装置同时滴入预先盛有i d m 3 水的反应容器中，调节温度( 2 5 c 、3 0 、3 5 、4 0 c ) 和p h ( 7 、8 、9 ) 以获得沉 淀产物，反应温度有水浴控制，p h 也自动滴定调节。最终生成的沉淀在各自反 应温度保持1 8 h ，再过滤、洗涤、干燥。取少量沉淀进行t e m 观察，其余的经 单轴压缩和冷等静压缩后，切成5 3 x 2 0 m m 3 大小，测弯曲强度，杨氏模量，并 进行热分析、f t i r 分析，将复合材料植入狗胫骨2 0 m m 缺损处，1 2 周后取出观 察。实验结果证明，制备的复合材料显示出天然骨中c o l 与h a 类似的结构取 向，加压处理后具备一定的力学强度，植入8 周后新骨在材料周围生长并互相结 合，骨缺损处逐渐被新骨所填充，可作为新型骨替代材料。为了改善复合材料的 力学性能，作者 2 7 利用上述方法把4 0 ，p h 9 条件下获得的沉淀浸入交联剂戊 二醛中1 0 m i n ，清洗后压缩( 2 0 m p a ，2 4 h ) 制成块状复合材料，实验证明此方法提 高了复合材料的机械强度，但交联后的复合材料失去了h a - c o l 之间的特定取 向关系。作者【2 8 将h a c o l 复合材料在压缩后浸入1 w t 戊二醛溶液中1 2 h ， 研究了材料作为重组人骨形成蛋白2 ( r h b m p 2 ) 载体的生物效能，方法是在对材 料加工、钻孔后，用氧化乙烯蒸汽消毒，再浸入4 0 0 i t g m lr h b m p 2 溶液1 5 r a i n ， 从植入实验后得到的骨矿物密度以及显微和组织分析结果来看，该植入体能够诱 导骨的修复，材料携带的r h b m p 2 对骨痂形成和骨愈合有一定帮助。为了进一 步改善材料与骨组织的相容性和材料的组织吸收性，作者 2 9 还对复合体系加入 藻酸盐( a l g i n a t e ) ，合成了h a c o l a l g i n a t e 复合材料。在最近的一篇综述性文章 e e 3 0 ，作者提出生物仿生合成h a c o l 复合材料是借助了h a 和c o l 之间的 “自组织( s e l f - o r g a n i z a t i o n ) 机制，制备的h a 纳米晶的c 轴沿c o l 纤维方向排 列，证明了材料与人骨相似的取向，h a 与c o l 的自组织驱动力可归结为它们 界面间的反应；h a c o l 复合材料的生物相容性甚至优于h a 陶瓷，其骨组织反 应证明破骨细胞的再吸收与成骨细胞诱导形成新骨相伴发生，这与自体骨移植的 反应很相似。因而h a c o l 复合材料可作为医用填充物和体外组织再生物使用。 清华大学崔福斋领导的生物材料实验室，自上世纪9 0 年代就开始了h a c o l 复合材料的研究 1 6 ，1 7 ，近几年来也借鉴j h b r a d t 2 5 共沉积法的思路，设计制 备了自组装的矿化c o l 纤维 3 1 。其方法如下：从鼠尾筋腱处提取胶原，经一 系列提纯过程后，在4 下将胶原溶于1 0 m m 的盐酸溶液中制备浓度为0 6 m g m l 的胶原溶液，把0 1 mc a c l 2 溶液1 4 m l 加入1 0 m l 上述c o l 溶液，混合1 0 m i n ， 再加入o 1 mn a i l 2 p 0 4 溶液0 8 4 m l ，用0 1 mn a o h 调节p h 至7 0 ，当p h 超过 6 时，溶液过饱和，磷酸钙和胶原一起开始沉淀，溶液在p h 7 0 保持1 h ，收集沉 淀，离心除杂，去离子水洗去表面盐类，重复三次，而后样品冷冻干燥，再磨成 细小粉末。利用t e m 、选区电子衍射( s a e d ) 以及高分辨t e m ( h r t e m ) 都说明了 第一章文献综述 人骨中天然形成的h a 与c o l 的取向关系在体外也能合成得到。x r d 、f t i r 分 析结果与其他研究者的结论 2 2 ，2 4 ，2 6 】一致。为了突破h a c o l 复合材料在力 学性能上的缺陷，作者【3 2 】也尝试用加入藻酸盐来进行改性，把研好的h a c o l 复合粉末与藻酸钠 ( c 6 h 7 0 6 n a h 按重量比9 ：1 2 ：1 混合，加水和成糊状，成形后 浸入5 c a c l 2 溶液2 4 h ，再浸入去离子水1 2 h ，样品冷冻干燥。为了达到同样的 目的，作者 3 3 还合成了纳米h a c o l 聚乳酸( p l a ) 复合材料，将h a c o l 粉末 与p l a 按重量比1 ：l 混合，倒入模子，0 到2 0 冷冻干燥得到样品，为提高生 物相容性，在复合体上结合了0 5 r a gr h b m p 2 ，细胞培养和植入实验均证实了该 材料具有良好的骨组织修复能力。最近，作者【3 4 】鉴于胶原提取存在种种困难， 改用重组人体胶原( r h c o l ) 作原料，利用相似的合成方法，在n 2 气氛下制得了纳 米h a r h c o l 复合材料。 n r o v e = r i 3 5 研究了自组装胶原纤维内h a 纳米晶的生物诱导生长。其方法 是：从马的肌腱提取胶原，经一系列提纯后溶解在3 醋酸溶液中，胶原浓度1 ， 将其与h 3 p 0 4 的混合液加入c a ( o h ) 2 悬浮液中，控制p h 在9 一1 0 之间，温度为 2 5 ，反应产物在4 0 冻干后再在真空条件3 6 h 内逐渐升温至3 5 ，得到 h a c o l 复合材料。形貌和结构分析证明其具备类似天然骨的组织。作者 3 6 还 对比了共沉积法与c o l 溶液中直接加h a 晶体所形成的两种复合材料在结构上 的差别，说明后者获得的复合物之间无化学作用，h a 与c o l 不能协调生长。 s - h r h e e 3 7 用共沉积法合成h a c o u 硫酸软骨素( c h s ) 纳米复合材料，以模 拟软骨成分。作者将不同比例的i i 型c o l 和c h s ( c o l 2 0 ，c o l1 4 c h s 6 ， c o l8 c h s l 2 ，c h s 2 0 ) 加入h 3 p 0 4 中，再与c a ( o h h 悬浮液混合反应，沉淀 经过滤和冷等静压后获得成品。经分析证明h a 的析出保持了与c o l c h s 混合 物的特定取向；复合材料的断裂强度和维氏硬度值分别在3 5 5 0 和1 1 9 - 2 1 9 m p a 范围内，且含c o l 比例较大的复合材料有相对较高的强度和硬度。借助软骨内 骨化这种材料可起到骨修复的作用。 m c c h a n g 3 8 认为c o l 制备成本高且其工业来源尚未有统一标准，加工过 程不易控制，而明胶( g e l ) 有很好的水溶性，物理、化学性能明确，所以研究g e l 替代c o l ，利用共沉积法制备h a g e l 复合材料。分析结果表明 l a g e l 具有 与h a c o l 复合材料类似的结构，g e l 溶液的浓度对反应过程以及复合效果有 着决定性作用。而其缺陷是g e l 没有c o l 那样好的自组织能力，因此g e l 纤 维的长度较短。 1 4 1 4 溶液蒸发