预防艾滋病梅毒乙肝母婴传播实验室检测PPT医学课件.pptx

1,预防艾滋病、梅毒、乙肝母婴传播实验室检测,2,目录第一部分艾滋病实验室检测第二部分梅毒实验室检测第三部分乙肝实验室检测,3,第一部分艾滋病实验室检测,4,艾滋病病原学及分型,艾滋病由艾滋病病毒引起目前已发现艾滋病病毒分HIV-1型和HIV-2型，后者主要流行于西非。我国目前流行的绝大多数毒株是HIV-1型中的M亚型，而HIV-1型中的O亚型、N亚型和HIV-2型主要在非洲某些局部地区流行。HIV属于RNA病毒，是一种变异性很强的病毒，不同的病毒株之间差异很大，甚至同一毒株在同一感染者体内仅数月就可以改变，使原中和抗体失去中和效能，这给疫苗的研制造成很大困难。,5,发病机理,艾滋病侵入人体后首先与细胞表面含有CD4受体CD4+T淋巴细胞（原始T细胞）结合，进入细胞进行复制，部分整合于细胞染色体DNA中成为潜伏型。感染初期由于机体细胞免疫和体液免疫对艾滋病毒的抵抗作用，艾滋病毒低水平复制。潜伏的艾滋病毒被激活而大量复制，广泛侵入人体CD4+T淋巴细胞，使CD4+T淋巴细胞、单核-巨噬细胞、B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞等功能受损，最后导致整个免疫功能缺陷，最终发生一系列顽固性机会感染和肿瘤的发生。,6,自然病程,途径HIV感染至AIDSAIDS后存活性传播6-10年（平均8年）12月静脉吸毒6年左右8.4月血源传播4-10年（平均6.2年）10-14月,7,感染后的临床类型,典型进展：8-10年内免疫力下降。快速进展：CD4+T细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒一直维持较高病毒栽量。长期不进展：保持较高细胞计数12-15年以上。,8,感染后的自然病史,9,传播方式,性接触传播：主要传播途径，包括同性及异性之间的性接触。肛交、口交有着更大的传染危险。血液传播：输入污染了艾滋病病毒的血液或血液制品；与艾滋病病毒感染的吸毒者共用注射器。共用医疗器械消毒不彻底或不消毒以及生活用具（如牙刷、剃刀等）,10,传播方式,母婴传播：通过胎盘通过分娩时产道通过哺乳传染。*不会经浅吻、握手、拥抱、共餐、共用办公用品、共用厕所、游泳池、共用电话、打喷嚏等而感染，甚至照料病毒感染者或艾滋病患者都没有关系。,11,实验室检测,一、HIV实验室诊断二、母亲为HIV阳性所生婴幼儿HIV实验室检测,12,一、HIV实验室诊断,13,HIV感染特点,所有的HIV感染者体内都会产生针对HIV的抗体这种抗体是针对病毒的特定蛋白而生成的，对HIV而言是独一无二的。感染者终生都会带有这种抗体。,14,HIV检测种类,HIV抗体、抗原检测HIV病毒栽量检测HIVCD4+T淋巴细胞检测HIV耐药性检测,15,我国HIV抗体检测程序,筛查试验重复试验确认试验,16,抗体筛查试验的流程图,重复检测,阴性反应,筛查试剂,原有试剂+另一种筛查试剂,阴性报告,送确认实验室进行确认,均阳性反应,均阴性反应,样本,筛查检测,阳性反应,17,初筛试验报告方式,筛查实验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告筛查实验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出阳性报告。,18,HIV筛查检测结果的解释,HIV筛查检测结果“阴性(-)”：受检者没有感染HIV受检者已经感染了HIV，但处于窗口期：3个月后再次进行检测HIV筛查检测结果“阳性(+)”：病人可能已经感染HIV但应再次重复检测，如两次重复检测中1次或2次检测结果为阳性，需要进行确认试验,19,在产前检查服务中开展整合的检测咨询所采用的HIV检测流程,20,产时HIV抗体检测流程,21,HIV抗体初筛检测试验,酶联免疫吸附实验（ELISA常用方法）金标快速检测实验化学发光检测实验明胶颗粒凝聚实验（PA）,22,酶联免疫吸附实验（ELISA）,特点：准确性高、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存，适合于大批样本检测。手工操作时应注意点：标本采集试验准备加样温育洗板显色比色,23,抗体初筛检测中出现的问题,假阳性：血液恶化病变自身免疫性疾病多发性胆汁型肝硬化酒精性肝炎疫苗接种（流感、乙肝）多发性骨髓瘤肾移植或慢性肾衰竭疟疾或丝虫病其它（如孕妇）,24,抗体初筛检测中出现的问题,假阴性：窗口期免疫移植换血输血恶性肿瘤免疫功能丧失（B细胞功能缺失）其他（试剂或操作原因）,25,检测HIV的ELISA诊断试剂的进展,26,HIV抗体确认试验,免疫荧光试验（IFA）放射免疫沉淀试验（RIPA）免疫印迹（WB）（常用方法）,27,确认试验报告方式,阴性阳性不确定,28,HIV确认试验结果的解释,免疫印迹法（WB）确认试验结果：阳性：病人确认感染HIV阴性：受检者没有感染HIV不确定：受检者必须在4周后再次采血进行确认试验。,29,HIV抗体确认试验流程图,免疫印迹法（HIV1/2混合型),HIV-1阳性反应,不确定反应,出现HIV-2指示条带,阴性反应,阴性报告,HIV-1阳性报告,免疫印迹法（HIV-2),阳性反应,阴性反应,阴性报告,不确定反应,报告HIV-2血清阳性，必要时测核酸,每3个月随访一次，共2次，仍属可疑，则作阴性报告。如随访出现阳性反应，则报告阳性。,30,HIV抗体检测类型,31,二、母亲为HIV阳性所生婴幼儿HIV实验室检测,32,感染特点,母亲HIV抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染。出生时婴儿体内的母亲HIV抗体，80-90%在生后9-12月消失，出生后18个月基本上全部消失。18个月后儿童体内HIV仍然阳性，视为自身感染产生的抗体。18个月以下HIV暴露婴儿早期诊断推荐检测HIVDNA，原因是HIV前病毒DNA，以细胞内前病毒感染状态存在，所以它不受母亲围产期抗病毒治疗和婴幼儿预防性抗病毒治疗的影响。,33,应用DNA-PCR方法进行婴儿感染早期诊断（EID）（1）,采集干血斑（DBS）在婴儿6周龄时进行检测。如果PCR检测结果阳性，尽快再次采血再次进行DNA-PCR检测，如果第二次PCR检测结果阳性，婴儿确定感染HIV如果PCR检测结果阴性，婴儿出生后3个月再次进行PCR检测。,34,应用DNA-PCR方法进行婴儿感染早期诊断（EID）（2）,出生后3个月再次进行HIVDNA-PCR检测如果PCR检测结果阳性，尽快再次采血再次进行DNA-PCR检测，如果第二次PCR检测结果阳性，婴儿确定感染HIV。如果PCR检测结果阴性，婴儿视为未感染HIV，但在婴儿满12月龄时进行HIV抗体检测（如有必要，在18月龄时再次进行检测）。检测结果阴性的婴儿接受母乳喂养，必须在停止母乳喂养后6周再次进行PCR检测，以确保婴儿没有在母乳喂养期间感染HIV。,35,婴儿HIV感染早期诊断流程,36,HIV暴露婴儿/儿童的HIV抗体检测,所有HIV感染母亲所生儿童，在出生后6周或3个月未接受EID检测者，应进行HIV抗体检测。检测时间：满12月龄和满18月龄（必要时，见HIV抗体检测流程）出生后3个月EID检测结果为阴性的儿童也应接受HIV抗体检测满18月龄HIV抗体检测阳性，可确认儿童HIV感染。,37,HIV暴露儿童HIV抗体检测流程,38,收集、制备干血斑（DBS）,什么是干血斑（DBS）？干血斑是直接用滤纸收集一滴全血进行干燥用于血样本的长时间储存DBS是用HIVDNA-PCR方法进行婴儿HIV感染早期诊断检测的最佳采血方法HIVDNA和HIV抗体可稳定地保存在干血斑中转运方便：无需冷藏,39,如何采集干血斑血样本（1）,时刻遵循“普遍防护原则”采集足跟血选择合适的采血部位，皮肤消毒（图片中阴影部位）必要时保暖足跟使用一次性消毒采血针足跟置于心脏水平位或之下不要“挤”足跟,40,如何采集干血斑血样本（2）,1.用消毒纱布擦掉第一滴血2.收集此后滴出的大滴血液3.快速、轻柔地用滤纸片的一面接触血滴4.让血液滴到采血圈中重复步骤1-4，直到整个采血圈全部充满血液。在卡片上标注患者的编号。每个儿童用一张新纸片。收集2-4个血斑。不要：用滤纸片按压出血部位不要多次在同一个采血圈中涂抹血滴在滤纸片两面均滴入血滴,41,如何采集干血斑血样本（3）,采血圈充满后：避免碰触或涂抹血滴水平放置滤纸片，室温下自然晾干（至少4小时）。避免阳光直射，不要加热。不要将多张滤纸片叠放在一起，避免血滴接触其他表面。一旦血样本完全干燥：放入可封闭的塑料袋中加入干燥剂和湿度指示卡干燥、阴凉保存干血斑滤纸片包装袋，直到转送到相关实验室,42,采集样本所需要的设备,血样本采集卡片(滤纸片)；可密封的塑料袋；湿度指示卡；干燥剂（1-2g/袋）；,43,怎样采集抗凝静脉血DBS,静脉血充分与EDTA混合；足跟血采集到带有EDTA抗凝剂子弹头内；最好采集后立即制备干血斑；血浆与血细胞分层的全血在制备干血斑前，应轻柔地上下颠倒采血管（避免血细胞破裂），使血液混匀后制备；,44,用移液枪加代滤芯枪头移取50-80ul血液；枪头对准印圈的中心缓慢将血液滴于滤纸上；避免有气泡；,45,在包装前DBS充分干燥,46,怎样包装DBS易于保存,最好一个样本一个包装，多个样本一个包装时，样本间用称量纸隔开；放入可密封塑料袋中；加干燥剂；加湿度指示卡；标记包装中的内容物并密封；,47,48,49,50,怎样保存DBS,将干燥后的DBS冷藏干燥-20度保存；避免阳光暴晒和加热；,51,怎样为运输样本包装,第一层包装好的DBS放入结实的纸袋中，放入相应的文件（采样单），将上述两样放入邮寄信封中并密封，,52,有效的样本,血液充分吸收透过滤纸，填满印圈，不要在一个圈上重复采血，避免触摸或涂抹血斑。,53,54,55,样本在干燥小于4小时前即寄出,1、吸附血液过多；2、双面贴,56,干血斑送检,1、填写送样表2、单位：北京海淀区妇幼保健院检验科地址：北京海淀区苏州街53号联系人：卢新（主任）杨海珊、王孟滨电话9614邮编：100080邮箱：hdfyHiv,57,三、HIV感染的实验室监测,58,HIV感染的实验室监测,实验室监测主要用于：决定开始抗病毒治疗还是预防性应用抗病毒药物；效果监测:抗病毒治疗效果；毒性监测:抗病毒药物引起的毒副作用。,59,孕产妇抗病毒治疗的相关检测,用药前，进行CD4+T淋巴细胞计数、病毒载量检测及其他相关检测（包括血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂、血糖等）。用药过程中，每三个月进行1次CD4+T淋巴细胞计数及其他相关检测（同前）。孕晚期，进行1次病毒载量检测，并在分娩前获得检测结果。,60,HIV感染孕产妇常规实验室检测,61,HIV感染孕产妇常规实验室检测,62,第二部分梅毒实验室检测,63,梅毒病原学,梅毒螺旋体呈细长形似细密的弹簧大小为5-150.1-0.2um，一般染料不易着色。梅毒螺旋体有生活发育周期，平均约30小时增殖一代。发育周期与所致疾病周期、隐伏发作及慢性病程有关。,64,梅毒致病性,梅毒螺旋体只感染人类人是梅毒的唯一传染源根据感染方式不同可分期：见图。,65,66,梅毒免疫性,梅毒的免疫是以细胞免疫为主，体液免疫只有一定的辅助防御作用，意义不大。当螺旋体从体内清除后仍可再感染梅毒，而且仍可出现一期梅毒症状。梅毒螺旋体侵入人体后，机体会产生梅毒螺旋体特异性抗体以及抗磷脂的自身抗体（非特异性抗体）称之为反应素。,67,梅毒传播途径,性接触传播：是主要的传染途径。未经治疗的患者在感染后1年内最具有传染性；随着病期的延长，传染性越来越小；到感染后2年，通过性接触一般无传染性；母婴传播：梅毒螺旋体可通过胎盘传染给胎儿。未经治疗者，病期2年虽性传播危险性较低，但妊娠时仍可传染给胎儿。血液传播：输血、吸毒、纹身、医源性传播等。,68,梅毒实验室检测方法,暗视野显微镜病原学检测镀银染色镜检非特异性抗体：即抗心磷脂抗体等（反应素）血清学检测特异性梅毒螺旋体抗体：,69,暗视野显微镜,70,镀银染色镜检,71,病原学检测特点,直接镜检找梅毒螺旋体，可确诊梅毒。具有快速、方便易操作的特点。早期诊断、及时治疗预后和尽早切断传染源都具有十分重要的意义。如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。,72,梅毒血清学检测,非梅毒螺旋体抗原血清学试验（检测非特异性抗体）RPR（快速血浆反应素环状卡片试验）TRUST（甲苯胺红不加热血清试验）VDRL（性病研究实验室试验）梅毒螺旋体抗原血清学试验（检测特异性梅毒螺旋体抗体）TPPA（梅毒螺旋体颗粒凝集试验）:WHO公认的“金标准”ELISA（酶联免疫吸附试验）POC（快速检测、一站式检测）,73,梅毒血清学试验基本实验室设备,74,非梅毒螺旋体抗体试验（一）,梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对螺旋体表面脂质作出免疫应答，在3-4周产生抗类脂质抗原的抗体（反应素），并且在不断升高。抗体主要是IgM和IgG。除梅毒外，其他医学情况如结核、疟疾、妊娠和风湿关节炎、狼疮及硬皮病等自体免疫学疾病也可导致假阳性结果。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。,75,非梅毒螺旋体抗体试验（二）,抗体滴度通常与疾病活动度有关。治疗后（可能几个月）非梅毒螺旋体抗原血清学试验通常转变为不反应；如果用同一种实验，相同试验滴度4倍变化（如从1:16下降到1:4或从1:8上升到1:32）为临床显著变化；有些病人，抗体滴度可始终处于较低水平，有时可持续终生（血清固定）。注意：病人血清学监测应在同一个实验室使用同一种检测方法（RPR、TRUST）进行连续多次检测；RPR和TRUST方法均有效，但检测的滴度结果不能直接进行比较。,76,非梅毒螺旋体抗体试验特点,快速、简便、便宜、敏感性和特异性较高；早期梅毒感染后1-2周内可呈阴性；出现硬下疳后1-2周变为阳性。二期梅毒时也可出现阴性反应。前带现象：血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果，而临床上又象二期梅毒，此时将血清稀释后再进行试验，出现了阳性结果。可用于：筛查样本；评估对治疗的反应；鉴别复发还是再次感染。,77,治疗后非梅毒螺旋体抗体试验抗体滴度变化的临床意义,一期梅毒和二期梅毒：成功治疗，抗体滴度应3个月后下降2倍6个月后下降4倍一期梅毒：1年后抗体滴度转阴二期梅毒：2年后抗体滴度转阴晚期梅毒：治疗后抗体滴度缓慢下降50%的病人2年后抗体滴度仍为阳性,78,RPR(加速血浆反应素环状卡片试验)基本原理：在心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原中加入活性碳颗粒，与待检血清中的反应素结合，形成肉眼可见的黑色絮状物TRUST（甲苯胺红试验)特点：其原理和成分与RPR试验相同用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒其余的特点均与RPR相同,79,定性试验(1)加样：吸取50微升血清（浆）放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈中。(2)加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原。(3)反应：将卡片置水平旋转仪旋转8分钟(1005)转/分钟，立即在亮光下观察结果,80,凝集反应强度分级：3+4+：圆圈内出现中到大的黑色絮状物，液体清亮。2+：圆圈内出现小到大的黑色絮状物，液体较清亮。1+：圆圈内出现小的黑色絮状物，液体浑浊。：圆圈内仅见黑色集中于中央一点或均匀分散。,81,操作步骤,孔号12345678稀释倍数原倍1:21:41:81:161:32阳性K阴性K生理盐水(ul)-50.050.050.050.050.0-样品(ul)50.050.050.050.050.050.0弃50.0-阳性血清(ul)-50.0-阴性血清(ul)-50.0抗原悬液(ul)16.716.716.716.716.716.716.716.7,82,83,84,确保非梅毒螺旋体抗原血清学试验质量的关键点,按照标准操作程序（SOPs）进行操作推荐使用评价特性较好的试剂*按照统一的标准报告结果开展实验室质控（QC）和参加室间能力验证（PT）*由中国疾病预防控制中心性病中心国家参比实验室提供,85,梅毒螺旋体抗原血清学试验,检测梅毒螺旋体抗原特异性抗体可用于确认非梅毒螺旋体抗原血清学试验的阳性结果，排除其假阳性。阳性结果可持续存在，即使治疗后仍可为阳性。*梅毒螺旋体抗原血清学试验与疾病的活动度无关，不能用于鉴别现症感染还是既往感染，也不能用于判断疗效。*一期梅毒治疗病人中，15%-25%可在2-3年后转为血清学阴性,86,TPPA,基本原理：用超声裂解梅毒螺旋体制备抗原，致敏明胶颗粒，其致敏粒子与待检血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体结合，产生肉眼可见的凝集。,87,操作步骤,1.试剂准备：试验前将试剂和待检标本恢复到室温。2.加稀释液：每份样本做4孔，加标本稀释液加至微量反应板孔内，第1孔100微升，第24孔各25微升。3.样本稀释：取血清25微升加至第1孔，混匀后取25微升至第2孔，混匀后取25微升至第3孔，混匀后取25微升至第4孔，混匀后弃去25微升。4.加对照液：第3孔加未致敏颗粒25微升，第4孔加致敏颗粒25微升。5.混合：将反应板置振荡器振荡30秒。6.反应：置有盖湿盒，孵育2h，或放4冰箱过夜观察结果。,88,结果判断,1.观察加未致敏颗粒的第3孔，不出现凝集为有效试验。2.观察凝集反应强度：分级如下。4+：颗粒光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠。3+：颗粒光滑覆盖大部分孔底。2+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一颗粒环。1+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显颗粒环。：颗粒沉集孔底，中央形成一小点。一：颗粒紧密沉积孔底中央。,89,90,RPR与TPPA的关系,RPR(初筛）TPPA(确证试验）关系RPR是为TPPA排除是既往感染还是现症感染；TPPA是为RPR排除是试验假阳性还是现症感染；两者互为现症梅毒的确认试验。,91,妊娠期梅毒检测,所有孕产妇应进行梅毒筛查检测：孕期尽早（如果可能，在孕早期时）以及如果在分娩前/临产时没有筛查检测结果，在分娩时检测。所有筛查检测结果阳性的孕产妇都应用另外一类检测方法进行复检确认是否为现症梅毒所有产妇及所生婴儿出院前，产妇梅毒检测结果都应记录在病历中，以确保需要时给予治疗,92,孕产妇梅毒检测流程,93,94,HIV感染病人的梅毒血清学试验,一些HIV感染病人，其梅毒血清学试验结果不典型，包括：滴度超常高或超常低；滴度不断变动。如果临床表现提示早期梅毒，而血清学试验结果与此不一致，考虑：病灶活检或暗视野显微镜检查注意：对于大多数HIV感染病人而言，梅毒血清学试验是诊断梅毒感染、随访观察疗效准确、可靠的检测方法,95,梅毒血清学试验报告方式,如果RPR阳性，要做稀释滴度。报告：RPR为阳性（如滴度1：32）如TPPA阳性：报告TPPA阳性如ELISA阴性:报告ELISA阳性,96,梅毒血清学检测结果的解释,备注：*包括结核、疟疾、风湿性关节炎或妊娠。以上诊断标准不适宜诊断胎传梅毒和神经梅毒检验结果要结合病史、临床症状，才能作出正确诊断,97,梅毒实验室检测的特点,临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡淋巴结病原学检查血液血清学检查二期梅毒皮损淋巴结病原学检查血液血清学检查潜伏梅毒血液血清学检查三期梅毒血液血清学检查神经梅毒血液血清学检查脑脊液细胞、蛋白量检查、VDRL等,98,二、暴露婴儿的梅毒检测,99,梅毒暴露婴儿先天梅毒检测,因母体非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体IgG抗体可通过胎盘，所以应谨慎地对婴儿梅毒血清学试验结果进行解释。婴儿需要接受预防性治疗还是规范的抗梅毒治疗应根据：母亲确诊梅毒感染母亲治疗情况婴儿梅毒感染的临床表现、实验室检查或x线检查结果母亲及婴儿非梅毒螺旋体抗原血清学试验滴度水平的比较（尽可能在同一个实验室使用相同的试验方法）,100,先天梅毒的诊断标准,梅毒暴露婴儿具有以下条件之一：任何先天梅毒临床表现；暗视野显微镜检梅毒螺旋体阳性（+）；梅毒螺旋体IgM抗体阳性；RPR/TRUST检测阳性，滴度比母亲分娩前最近一次滴度高4倍及以上；RPR/TRUST监测随访中，任何一次滴度不下降或反而上升；满18月龄后，TPPA检测阳性。*婴儿RPR检测不能使用脐带血，因其易被母体血液污染，从而出现假阳性结果。,101,第三部分乙肝实验室检测,102,乙肝病原学,乙型肝炎病毒结构是由一个不完全双链DNA组成，约3200个氨基酸。乙型肝炎病毒基因结构可分为四组可编码蛋白基因。即：S基因：编码外膜蛋白。C基因：编码核心抗原和e抗原。P基因：编码DNA聚合酶。X基因：编码X蛋白。,103,乙肝病原学,S基因区可分为三段：前S1区、前S2区、和S区。乙型肝炎病毒为嗜肝DNA病毒，感染对象为肝细胞。HBV的抵抗力较强，但6510小时、煮沸10分钟或高压蒸气均可灭活。环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏也有较好的灭活效果。对干燥、紫外线均有耐受性。,104,乙肝传播途径,血液、体液（唾液、精液、阴道分泌物、乳汁、泪液、尿液）母婴输血及血制品性传播皮肤、粘膜*HBV不经呼吸道和消化道传播，流行病学和实验研究亦未发现HBV能经吸血昆虫（蚊、臭虫等）传播。,105,HBV的母婴阻断,对乙肝表面抗原阳性孕产妇所生新生儿，在出生后24小时内注射：乙肝免疫球蛋白+乙肝疫苗阻断率能达到85%以上。,106,乙肝实验室检测方法,电化学发光免疫分析法ECLIA法酶联免疫吸附试验法ELISA法金标法放免法PCR等。*ECLIA法测定灵敏度为008ngml；ELISA法测HBsAg灵敏度为07ngml，金标法灵敏度1ngm