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海洋生物中牛磺酸的提取及分析 摘要 牛磺酸是人体必需的一种氨基酸，它的化学名称为2 一氨基乙磺酸。牛 磺酸以游离的形式存在动物机体中，除牛胆汁外，还广泛存在于牡蛎、墨鱼、 蛤蜊等海洋生物中。牛磺酸对促进大脑发育、调节神经传导，维持正常的心 脏、肝脏、内分泌系统的功能等具有独特的生理及药理作用。牛磺酸已被广 泛的应用于食品添加剂、医药及洗涤剂等行业。目前，国内外对牛磺酸的提 取多采用化学合成法，合成法总的来说，均具有原料毒性大，工艺操作复杂， 生产设备投资高，环境污染等问题。因此，从海洋生物中提取牛磺酸长期以 来一直是人们关心和研究的热点。本文对海洋生物一牡蛎中牛磺酸的提取及 分析方法进行了研究。 目前，对牛磺酸的分析方法主要采用氨基酸分析仪和柱前衍生高效液相 色谱法，但所需仪器设备投资大，分析时间长。本文采用吸光光度法对牛磺 酸进行测定，对影响吸光度的因素进行了比较全面的分析和讨论，并在最佳 条件下测得加标回收率为9 6 6 2 ，相对标准偏差为2 3 ，说明该方法可用 于水产品中牛磺酸含量的准确测定。 牛磺酸本身无荧光，在2 _ 巯基乙醇的存在下，牛磺酸与邻苯二甲醛反 应生成的衍生物具有荧光，利用这一性质，本文采用荧光法测定牛磺酸，并 对影响因素进行了分析和讨论，在最佳条件下测得牛磺酸浓度与相对荧光强 度之间成良好的线性关系。 本文研究了毛细管电泳测定牛磺酸的方法，采用萘一2 ，3 一二甲醛( n d a ) 和牛磺酸反应，衍生为电化学活性的物质，进行电泳测定，并对衍生反应条 件和电泳分析条件进行了优化，建立了种测定牛磺酸的新方法。 本文分别采用水煮法和酶解法提取牡蛎中牛磺酸。水煮法中采用薄层色 谱法定性、分光光度法定量测定牛磺酸，并对影响提取的因素进行了讨论， 产品经重结晶后，可得到白色针状晶体；酶解法中采用活力单位数( ur a g ) 2 5 0 0 的胰蛋白酶对牡蛎中牛磺酸进行提取，对影响酶解反应的因素进行了 讨论，并运用荧光法测定牛磺酸含量，加样回收实验结果表明平均回收率为 9 6 ，5 2 ，相对标准偏差为2 9 6 。 关键词：牛磺酸的测定毛细管电泳荧光法吸光光度法 e x l r a c t i o nan da n a i ，y s i so ft a u r 【n ei n h a l o b l 0 s a b s t r a c t t a u r i n ei sa t le s s e n t i a la m i n oa c i di nh u m a n b o a yw h i c hc h e m i c a ln a r f t ei s2 - - a m i n o e t h y l s u l f o n i ca c i d t a u r i n ee x i s t si no r g a n i s mi nt h ef o r mo f l i b e r a t i o n i t e x i s t sn o to n l yi no x g a l lb u ta l s o i nh a l o b i o ss u c ha so y s t e r , s e p i a ，c l a m ，e t c t a u r i n eh a ss p e c i a lp h y s i o l o g i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a la c t i o n s ，w h i c hc a r l s t i m u l a t et h ed e v e l o p m e n to fc e r e b r u m ，a d j u s tn e r v ec o n d u c t i o n ，m a i n t a i nt h e p r o p e rf u n c t i o n i n go fh e a r t ，l i v e r , i n t e r n a ls e c r e t i o n i n t e m a l ，e t c t a u r i n ei sw i d e l y u s e di nf o o da d d i t i v e ，m e d i c a m e n t ，d e t e r g e n le t c a tp r e s e n t ，t h ee x t r a c t i o no f t a u r i n ei su s u a l l ym a d eb yc h e m o s y n t h e s i sa th o m ea n da b r o a d i th a sal o to f d i s a d v a n t a g e s f o r e x a m p l er a wm a t e r i a l s a l ev e r y p o i s o n o u s ，m e t h o d o l o g y o p e r a t i o ni sc o m p l e x ，f a b r i c a t i o nf a c i l i t i e sn e e db i gi n v e s t m e n t s ，e n v i r o n m e n tc a n b ep o l l u t e d ，e t c s oe x t r a c t i o no ft a u r i n eh a sl o n gb e e nc o n c e r n e da n dr e s e a r c h e d b yp e o p l e t h i sp a p e re s t a b l i s h e ds e v e r a lm e t h o d so fe x t r a c t i o na n da n a l y s i so f t a u r i n ei nh a l o b i o s o y s t e r a tp r e s e n t ，t a u r i n ei su s u a l l yd e t e r m i n e db ya m i n oa c i da n a l y z e ra n dh p l c w i t hp r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n b u tf a b r i c a t i o nf a c i l i t i e sn e e db i gi n v e s t m e n t sa n d t h et i m eo fa n a l y s i si sv e r yl o n g t h i sp a p e re s t a b l i s h e dam e t h o do fa n a l y s i so f t a u r i n e b ys p e c t r o p h o t o m e t r y a n dd i s c u s s e dt h e f a c t o r st h a ta f f e c t e d s p e c l x o p h o t o m e t r y t h er e c o v e r yw a sf o u n d t ob e9 6 6 2 a n dt h er s dw a sf o u n d t ob e2 3 b yt h es t a n d a r da d d i t i o nm e t h o d ，w h i c hi n d i c a t e dt h em e t h o dc o u l db e a c c u r a t e l yu s e di nt h ed e t e r m i n a t i o no f t a u r i n ei nt h ea q u a t i cp r o d u c t s t a u r i n eh a sn of l u o r e s c e n c ea n di tc a ng e tt h ed e r i v a t i o nw h i c hh a s f l u o r e s c e n c ew i t ho p ai nt h e p r e s e n c eo f2 - m e r e a p t o e t h a n 0 1 t h i sp a p e r e s t a b l i s h e dam e t h o do f a n a l y s i so f t a u r i n eb yf l u o r e s c e n c es p e c q o p h o t o m e t r ya n d d i s c u s s e dt h ef a c t o r sw h i e ha f f e c t e df l u o r e s c e n c e 1 1 1 ec h i v eb e t w e e n c o n c e n t r a t i o no ft a n r i n ea n dr e l a t i v ef l u o r e s c e n c eh a dg o o dl i n e a rr e g r e s s i o n u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s t l i sp a p e rr e s e a r c h e dam e t h o do ft h ed e t e r m i n a t i o no ft a u r i n eb yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s t h e d e r i v a t i o nw h i c ht a u r i n er e a c t e dw i mn d ah a s e l e e t r o c h e m i c a la c t i v i t ya n di tc a nb ed e t e c t e db yc e t h ef a c t o r sw h i c ha f f e c t e d d e r i v a t i v er e a c t i o na n dt h ed e t e r m i n a t i o no fc ew a sd i s c u s s e d t h i sp a p e r e s t a b l i s h e dan e wm e t h o do f d e t e r m i n a t i o no f t a u r i n e t h i sp a p e re s t a b l i s h e dm e t h o d so fe x t r a c t i o no ft a u r i n ef r o mo y s e rb yb o l i n g a n de n z y m o l y s i s q u a l i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ft a n r i n ew a sd e t e r m i n e db yt l c a n dq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nw a sd e t e r m i n e db ys p e c t r o p h o t o m e t r yi nb o i l i n g m e t h o d t h ef a c t o r sw h i c ha f f e c t e d 也ey i e t do ft a u p ew e r ed i s c u s s e da n di tc a n g e tw h i t ea c i c u l a rc r y s t a l a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n t a u r i n ei nt h eo y s t e rw a s e x t r a c t e db yt r y p s i na n dt h ef a c t o r st h a ta f f e c t e de n z y m ep r o c e s sw e r ed i s c u s s e d t h ec o n t e n to ft a u r i n ei sd e t e r m i n e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t r y t h e r e c o v e r yw a sf o u n dt ob e9 6 5 2 a n dt h er s dw a s2 9 6 b yt h es t a n d a r d a d d i t i o nm e t h o d k e yw o r d s ：d e t e r m i n a t i o no ft a u r i n e ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r y ；s p e e t r o p h o t o m e t r y 1 1 牛磺酸的简介 1 文献综述 牛磺酸( t a u r i n e ) 是在1 8 2 7 年由t i d m a n 和g m e t i n 从牛的胆汁中分离 出来的一种酸，后经研究测定，在1 8 4 6 年确定其组成中含有硫，故名牛磺 酸、牛胆碱，其结构较为简单：h 2 n c h 2 c h 2 s o j h ，称为2 二氨基乙磺酸( 2 - - a m i n o e t h y l s u l f o n i ca c i d ) ，它以游离态或胆汁酸的结合体存在。 牛磺酸分子量为1 2 5 1 5 ，单斜棱状白色晶体，熔点3 2 8 c ，无毒、无 臭、味微酸，对热稳定，能溶于水，不溶于乙醇、乙醚或丙酮，其化学性 质稳定，在室温、避光、密闭干燥条件下可保存3 年。牛磺酸以游离形式 大量存在于人及哺乳动物体内，对人体无毒、无副作用，是人体必需的一 种氨基酸。 1 2 牛磺酸在动物体内的来源、分布、合成及代谢 1 2 1 机体中牛磺酸的来源、分布与合成 人体牛磺酸的主要来源有三个途径：( 1 ) 通过胎盘从母体获得；( 2 ) 从 母乳中获得；( 3 ) 自身合成。 牛磺酸在体内主要分布于中枢神经系统、视网膜、肝脏、骨骼肌和心 脏等组织“1 ，新生大鼠的大脑及小脑中牛磺酸含量非常高。g a u l l ”1 发现生长 发育中动物大脑中牛磺酸含量显著高于成年动物大脑中该物质的含量。成 年动物大脑中牛磺酸含量仅为新生动物的1 3 “1 。 目前，人们公认的经半胱氨酸转化为牛磺酸的合成途径有四条：( i ) 半 胱亚磺酸脱羧酶途径，中枢神经以该途径为主；( 2 ) 磺基丙氨酸脱羧酶途径； ( 3 ) 半胱氨脱氢酶途径；( 4 ) 二亚砜途径。 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 1 2 2 牛磺酸的分解代谢m 牛磺酸通过不同途径代谢成牛磺胆酸、牛磺脲酸、脒基牛磺酸、异乙 基硫氨酸等四种物质。其中牛磺胆酸可调节脂类代谢：牛磺脲酸的功能尚 不清楚：脒基牛磺酸可作为低等动物的一种磷酸源，在能量代谢中起作用； 而异乙基硫氨酸是牛磺酸分解为硫酸的中间产物，具有与牛磺酸一起调节 离子通过膜的转移作用。动物对牛磺酸的需要量受多种因素的调控，如： 动物年龄、日采食量、日粮性状、牛磺酸与胆汁酸结合的量、肌肉池内牛 磺酸的含量等，肾脏是排泄与调节牛磺酸含量的主要器官。 1 3 牛磺酸的生理功能 1 | 3 1 促进营养物质代谢 1 3 1 1 调节脂类的消化吸收 肝脏中牛磺酸的作用是与胆酸结合形成牛磺胆酸，牛磺胆酸常以盐的 形式存在，对于消化道中脂类的消化吸收是必需的：它能增加各种脂肪酶 的活性，加速脂肪水解；可降低脂肪的表面张力，使脂肪乳化成微粒，分 散于水溶液中，从而增加与脂肪酶作用的界面，促进水解的进行；还能与 甘油一脂结合，促进胆固醇、脂溶性维生素等的消化吸收及胆汁的分泌， 增加胆汁排泄量，抑制胆结石形成。鼠胆固醇胆右形成试验中，食品添加 牛磺酸可抑制胆石形成，晚明其具有促进胆汁排泄的作用。给纤维囊肿病 人补充牛磺酸，可促进病人对脂肪的吸收作用“1 。 1 3 1 2 参与蛋白质、氨基酸代谢 牛磺酸虽不参与蛋白质生物合成，但可以出现在某些小胎中，如脑组 织中的y 谷氨酰牛磺酸。添加牛磺酸可提高蛋白质的消化率从而间接促进 动物生长发育。刘晓军等”1 研究表明，在以酪蛋白为主要蛋白质来源的大鼠 饲料中添加1 牛磺酸，可提高蛋白质消化率，其原因是牛磺酸可促进某些 激素或酶的分泌，而且增加外源性牛磺酸的摄入量，相应地减少体内牛磺 酸的生物合成使更多的含硫氨基酸参与蛋白质的合成，从而使蛋白质的质 量得到相对提高。另外，蛋白质营养不良可降低血浆牛磺酸浓度，说明牛 2 青岛科技大学研究生论文 磺酸与蛋白质二者之间的作用是相互的。 1 3 1 3 促进糖代谢 细胞膜对葡萄糖的摄取是细胞内糖代谢的限速步骤，牛磺酸可加速葡 萄糖进入细胞，还促进细胞内糖代谢和糖原合成，降低动物血糖水平，其 机制与牛磺酸诱导或抑制某些限速酶活性有关，它可使糖原合成酶，活力 升高而使糖原磷酸化酶活力降低。另外，牛磺酸还可作用于胰岛素受体， 发挥胰岛素样效应，协同胰岛素对糖代谢的调控效应，参与维持机体葡萄 糖自稳态，对糖尿病及其并发症具有明显的细胞保护作用。 1 3 1 4 参与矿物元素代谢 研究表明，牛磺酸对c a z + 有调节作用：低钙时促进c a 2 + 的内流，高钙 时减少c a 2 + 内流和增加c a 2 + 与细胞的亲和力，以降低游离钙水平，即牛磺 酸具有抗钙超载作用，从而对应激性损伤的心肌细胞起保护效应。牛磺酸 还可促进肠道对锌的吸收，2 ，5 有影响，8 无影响；另有资料表明牛磺酸 与锌有互作效应”1 。李万里等。1 研究结果表明，牛磺酸可显著增加饲喂高脂 饲粮家兔血清锌含量，提示牛磺酸可能通过调节体内锌、铜代谢而影响脂 质代谢。总之，牛磺酸可参与机体内矿物元素的代谢，其机制可能与牛磺 酸促进甲状腺激素代谢有关，具体机制有待于进一步探讨，但牛磺酸可能 通过参与矿物元素代谢而间接调节脂类代谢，发挥抗氧化功能及其它生理 活性。 1 3 2 提高机体免疫力 在淋巴细胞中牛磺酸韵含量占整个游离氨基酸的5 0 ，在中性粒细胞 中牛磺酸的含量占所有游离氨基酸的7 6 ，免疫细胞中牛磺酸的含量极高， 说明其与免疫功能密切相关”。牛磺酸可以结合白细胞重的次氯酸并生成无 毒性物质，降低次氯酸对白细胞自身的破坏，从而提高人体免疫力。添加 适量牛磺酸可提高鸡血清中新城疫抗体效价( h i ) 及免疫器官腔上囊、脾脏 的相对重量，增强鼠机体免疫应答反应及白细胞计数( w b c ) ，增强机体免 疫力“”3 。牛磺酸缺乏时可引起机体自细胞数量下降，多核白细胞与单核 细胞比值降低，还可使创伤或坏血病病人的免疫反应受到抑制。 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 1 3 ，3 参与神经内分泌的调节 牛磺酸是中枢神经系统中含量最多的游离氨基酸，在动物大脑皮层、 小脑、和嗅球等区域含量很丰富，是大脑神经细胞间相互连接的介质，参 与脑神经功能的调节。牛磺酸缺乏的大鼠，脑及智力发育受到不良影响， 表现为脑重量、脑功能达不到正常水平1 。牛磺酸缺乏的幼猫，其大脑重 量也显著低于补充牛磺酸组。牛磺酸在人脑细胞的增值周期中具有明显的 促增值作用“。牛磺酸对神经细胞的分化成熟也起着促进作用“，当牛磺 酸缺乏时，体外培养的人脑神经细胞的分化成熟过程受阻。临床研究表明 “，小于1 3 0 0 9 的早产儿补充牛磺酸组与对照组相比，补充组有一更成熟 的脑干诱发电压，提示牛磺酸对大脑发育的重要性。 1 4 牛磺酸的生产现状“阳 我国牛磺酸的工业生产始于2 0 世纪8 0 年代，1 9 8 1 年中科院长春应用 化学研究所与长春市春城制药厂协作开发成功牛磺酸并投入工业化生产。 由于牛磺酸生产原料易得，工业简单，投资较少，产品大部分出口，适合 中小型企业上马，因此国内许多中小型企业和乡镇企业都看好这一产品， 纷纷投资开发牛磺酸，上新的生产线，使牛磺酸生产厂家由2 0 世纪8 0 年 代末的1 0 多家增长到目前的4 0 多家。其中持有牛磺酸药品生产批准文号 的生产厂家有2 0 家，另外还有2 0 家化工厂生产。生产工艺大都采用乙醇 胺法进行生产，合计生产能力达到约1 0 0 0 0 吨年，产量约为3 0 0 0 吨年。 生产厂家主要有辽宁沈阳市第五制药厂、黑龙江哈尔滨市白天鹅制药厂、 江苏丽宝集团公司昌利化工有限公司、长春市长城制药厂、上海第- - n 药 厂、江苏南京制药厂、广东肇庆西江制药厂、湖北黄岗市富池制药厂、江 苏武进华夏动物药品厂、江苏南通第二制药厂、浙江宁波东海化工厂、浙 江临海制药厂、江西黎明制药厂以及湖北武汉制药厂等。其中南京制药厂 和广东肇庆嚣江制药厂是我国目前生产能力最大的两家企业，生产能力分 别为1 2 0 0 吨年和8 0 0 吨年，其余生产能力大多为1 0 0 2 0 0 吨，年。 4 青岛科技大学研究生论文 1 5 牛磺酸的应用 随着人们的生活水平和生活质量的提高，具有较高营养价值和多种药 力作用的牛磺酸已越来越受到人们的青睐，在众多的行业中得到广泛的使 用。 1 5 1 食品添加剂 国标g b 2 7 6 0 - - 8 6 将牛磺酸列为强化营养保健的食品添加剂。牛磺酸 是人体内具有多种生理功能的氨基酸，在人体内起重要作用。人体所需牛 磺酸来源大致为：自身合成占3 7 7 ，动物性食物的补充占1 1 4 ，化学合 成补充占5 0 9 ，人体所需牛磺酸一半以上需从外界摄取“”。因此，它作为 一种优良的食品添加剂，目前正日益广泛的应用于食品和饮料行业中。 现代研究表明，牛磺酸对婴幼儿的健康和正常发育起着至关重要的作 用，婴幼儿的脑、神经、心脏、内分泌机能等发育以及钙质、脂肪、维生 素的吸收都离不开它。婴幼儿所需的牛磺酸一般是从母乳中获得的，若由 于某种原因不能喂养母乳时，就需要在牛奶和奶粉中适当添加牛磺酸，以 保证婴幼儿的健康发育“。目前，美国、日本等一些发达国家为了确保婴 幼儿的健康成长的需要，早己规定婴幼儿食品中必须添加牛磺酸，而且含 量不得低于o 1 6 m g m l 。德国就含有牛磺酸的饮料对运动员的忍耐力进行 研究：表明含有牛磺酸的饮料能提高运动员的忍耐时间“”。墨西哥对牛奶 中牛磺酸的含量进行研究分析”，结果表明不同产地的牛奶其含量不同， 同一产地不同时期生产的牛奶，其牛磺酸的含量也不相同。1 9 9 0 年，我国 允许牛磺酸作为营养食品添加剂添加到乳制品、饮料等多种食品中。因为 婴幼儿体内的半胱氨酸转化成为牛磺酸的量很少，不能满足婴幼儿正常生 长发育的需要，特别是依靠奶粉生长的婴幼儿，由于普通奶粉中牛磺酸含 量仅不足母乳的1 1 0 ，随着婴幼儿体内血浆中牛磺酸含量下降，婴幼儿将 出现营养不良，严重时将造成视力损害，影响正常生长发育。在国内市场 上针对儿童的营养保健品，如：“娃哈哈”儿童营养液、“聪聪”母液、乐 百氏儿童专用奶、龙丹奶粉等多添加有牛磺酸“”。牛磺酸对成年人的心血 管系统、神经传导系统、消化系统及眼、脑、肝、肌肉等方面亦有重要的 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 作用，可以增强体质，提神醒脑，提高工作效率。因此牛磺酸也是成年人 食品的一种优良的添加剂。”。 目前。用作添加剂的主要是合成的牛磺酸，而天然则很少m “，如1 9 9 1 年，日本国内合成品产量达3 0 0 0 t ，而天然品的产量仅为2 0 - 3 0 t 。二者的售 价也有很大的差别，如纯度在9 8 以上的牛磺酸，进口价在2 2 0 0 日元瓜g 左右，而天然海产品提取的牛磺酸，纯度只为7 0 8 0 ，售价却为2 - - - 3 万日 元l 唱，9 8 以上的天然品，价格则高达3 4 万日元i ( g 。因此，从海洋生物 中提取牛磺酸将具有巨大的市场潜力。 表l 1 各类食品添加参考剂量”3 t a b l e1 1t h ea d d i t i o no f t h er e f e r e n c ec o m p a e i t yo f a l lk i n d sf o o d 食品种类添加剂量 婴幼j l - 孚l 类和食品 非婴幼j l - 孚l 类和食品 调制乳及饮料 水产、动物饲料 3 0 0 3 5 0m g & g 干基 3 5 0 4 4 0 0m g k g 干基 3 3 4 6m e , l o o m l 4 5 0 5 0 0m g j k g 干基 i 5 2 临床应用 1 5 2 1 保护视觉功能 人体长期确乏牛磺酸可能会导致视觉功能障碍。在某些特殊或疾病情 况下，例如胆汁损失或长期接受营养输液，最易出现牛磺酸缺乏，产生视 网膜电图异常。治疗时，在输液中加入牛磺酸，可使视网膜电图恢复正常”。 临床上，将牛磺酸作为一种用于治疗由氧化剂如次氯酸引起的眼表面损伤 的常用药物。其作用机理为，当患白化病的兔眼遇到刺激时，由眼组织释 放的乳酸脱氢酶进入眼泪，此时乳酸脱氢酶作为一种眼表面损伤的诱导物 存在。先灌注牛磺酸，再以同样方法灌注次氯酸，则可有效的抑制次氯酸 引起的乳酸脱氢酶的释放。因此，存在于眼表面组织中的牛磺酸，可通过 清除次氯酸而抵抗次氯酸，使眼睛在受到次氯酸伤害后能有效的保护眼表 6 青岛科技大学研究生论文 面。 1 5 2 2 治疗神经、心脑组织和血管系统疾病 牛磺酸已被试用于辅助治疗血胆固醇增高及心血管功能失调。广州军 区总医院王顺年等。”合成供静脉注射的针剂一心肌宁注射液，其利用牛磺 酸具有消炎和兴奋心肌的作用，用于治疗病毒性心肌炎：癫痫患者脑中的 牛磺酸浓度降低，注射或口服牛磺酸，可提高大多数患者血浆中的牛磺酸 含量，有助于脑脊液中氨基酸水平正常化，减少发病率，无任何副作用。 日本学者报道，将牡蛎肉提取物粉末( 主要含牛磺酸和锌的螯合物) i k g 和 乳糖2 0 0 k g 混合后压片，每片含2 0 0 5 0 0 m g 牡蛎提取物粉末，用以治疗精 神分裂症。口服含有牛磺酸( 7 5 m g 片) 和其它氨基酸的片剂，治疗偏头痛， 可使神经细胞吸收牛磺酸和胶质细胞转运牛磺酸的能力恢复正常：临床治 疗试验提示，牛磺酸对治疗原发性高血压有效。 1 5 2 3 解毒作用 服用牛磺酸，可治疗酒精中毒。它可有效的减少或防止乙醇戒断症状， 减少神经和痉挛症状的发生率，预防乙醇对肝脏的损害：牛磺酸是清热解 毒中药牛黄、全蝎的成分之一。 1 5 2 4 止血养血 珍珠晶母注射液和妇乐片的有效成分是牛磺酸，具有止血和增强子宫 收缩的作用，用于治疗功能性子宫出血和贫血。“；含有牛磺酸的牡蛎全营 养片具有养血滋阴之功效。”。 1 5 - 2 5 抗肿瘤作用 将牛磺酸与其它氨基酸、维生素并用，可用于癌症的治疗。临床上以 牡蛎( 主要成分为牛磺酸) 辅以其它药物，对治疗胃癌有效1 。 此外，王顺年等”应用马氏珍珠贝全脏器制成注射液一益肝注射液， 用于治疗乙型病毒性肝炎，取得明显的效果；以牛磺酸为有效成分的药物 软膏( 含牛磺酸o 叭) ，可用于治疗牛皮癣：牛磺酸还可用于治疗神经痛、 扁桃体炎、支气管炎等病症；将牛磺酸作为治疗剂，治疗由于某些伤害， 如局部缺血缺氧、v b 6 缺乏、听源性刺激引起的疾病；作为一种脊髓过氧 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 化酶活性的兴奋剂和炎症抑制剂；将牛磺酸制成气雾剂，可用于治疗气喘 病；能增强阿司匹林、消炎痛抑制人体血小板的聚集，从而为抗血栓的研 究开拓出一条新路”。 1 5 3 洗涤剂祀荧光增白剂。” 牛磺酸应用于洗涤剂和荧光增白剂中可以增加洗涤和增白效果，如在 二苯乙烯双嗪类荧光增白荆中引入氨基磺酸基团后，可以明显地改善增白 剂的水溶性和增白效果。该类增白剂主要用于造纸、纤维素纤维和聚酰氨 纤维的增白。 牛磺酸在有机合成、生化试剂、p h 缓冲剂等方面有着广泛的应用。同 时，随着对其的研究不断深入，它的应用领域也将不断扩大。 1 6 牛磺酸的市场分析 1 6 1 国外市场分析“” 目前世界上牛磺酸的年消耗量已超过1 5 万吨年，其中8 0 以上用作 食品营养添加剂，消费主要集中在美国、西欧和东南亚等国家，在这些国 家，牛磺酸被广泛应用于奶粉、乳制品、饮料、滋补品、复合味精及某些 特定食品中，并逐渐扩展到农业、水产业以及化学工业等领域。美国是世 界上牛磺酸产量和消费量最大的国家，其应用已由最初的药用为主，转向 以食品添加剂和营养保健品为主，成为普遍、大众化的消费品。日本早在 七十年代出售的某些营养品中就将牛磺酸添加到其中。据统计，目前美国 和曰本等发达国家牛磺酸的消费结构为：食品类添加剂、营养保健品占 9 8 ，药品约占1 ，其他约占1 ，并且大众化食品类添加剂对牛磺酸用 量所占比例还在不断增加。目前，美国牛磺酸的年产量已经超过7 0 0 0 盹 年，消费量约为1 2 0 0 0 吨年，进口量约为5 0 0 0 吨年。r 本也是牛磺酸的 消费大国，其年消费量已经达到约5 0 0 0 吨年，在日本，儿童食品中不添加 牛磺酸即视为不合格产品，不准上市出售。日本人均牛磺酸年消费量超过 6 0 克，儿童人均年消费量在5 0 0 克以上，且人均年消费量正以3 2 的速度 青岛科技大学研究生论文 增加，其中相当一部分依靠进口。其他国家的牛磺酸人均年消费情况大致 为：英国3 4 克，德国3 2 克，加拿大2 9 克，法国2 6 克，印尼1 8 克，新加 坡1 7 克，韩国1 9 克。随着世界经济的发展，特别是东南亚经济的恢复和 发展，各国对牛磺酸的需求在以不同的速度增长。 1 6 2 国内市场分析。” 我国牛磺酸生产起步较晚，国内牛磺酸生产技术、产品质量，尤其是 开发应用均与发达国家有一定的差距。我国目前年产量约为3 0 0 0 吨，其中 9 0 用于出口，药用占5 ，食品添加剂占6 ，国内消费量很少。但是， 我国是个巨大的潜在市场，中国有1 3 亿人口，其中儿童有3 8 亿，如果其 中有l 3 的婴幼儿、儿童每年补充3 0 0 9 牛磺酸，仅此一项就需要近4 万吨， 而每人每年所花费用不超过1 8 元。我国有关部门已经把牛磺酸作为氨基酸 营养强化剂，确定为应采取措施鼓励发展的重要精细化工品种之。而且 随着人们生活水平和消费层次的提高，会有越来越多的人青睐牛磺酸。我 国牛磺酸用量也正以0 8 的速度增长，相信在不远的将来，牛磺酸在国内 的应用一定会出现一个崭新的局面。 1 7 海洋生物中牛磺酸的分布 牛磺酸在海洋生物中含量十分丰富，软体动物中尤甚，可以说海洋生 物是牛磺酸的天然宝库。 表1 2 中列出了几种具有代表性的鱼贝类牛磺酸含量，从表中可以看 出，贝类、甲壳类等的牛磺酸含量较高，其中马氏珠母贝含量高达 1 3 8 3 0 m g k g 。“，牡蛎、翡翠贻贝中含量也不少”“。“1 。 需要说明的是，对于同一种鱼贝类来说，由于存在多方面原因，不同 的学者可能得到不同的结果，其中主要有以下几方面原因：( 1 ) 操作上存 在误差。( 2 ) 实验所选用的部位不同。( 3 ) 鱼贝类的前处理方法不同。( 4 ) 不同的生长水域和季节等因素，也影响着鱼贝类牛磺酸的含量。 9 海洋生物中牛磺酸韵提取及分析 表1 2 海产品中牛磺酸含量。1 t a b l el 一2t a u r i n ec o n t e n to fs e af o o d 鱼贝类水分啶垦分数，牛确鳝洽量k g ) 真鲷 红鱿鱼 枪乌贼 赤贝 蛤蜊 紫贻贝 蝾螺 扇! ：f l 姥蛤 海松贝 马氏珠母贝 牡蛎 蚶 小虾 翡翠贻贝 日奉对虾 雪蟹 竹荚鱼 黄鲷 劁e 鱼 多春鱼 绿鳍鱼 7 7 4 8 0 6 7 7 9 8 5 4 8 5 9 7 8 9 7 8 8 2 4 7 9 4 8 1 7 8 0 9 8 2 4 7 6 9 8 1 8 7 7 8 7 6 3 6 0 7 6 a 7 4 2 远东多线鱼 7 1 6 2 1 6 0 1 0 姗 姗 姗伽 姗 彻峨 舢麟一一 弼雄脚啪姗呦啪呦渤姗弼蚴舢螂姗姗脚锄姗 青岛科技大学研究生论文 1 8 与合成法相比，从天然物中提取牛磺酸具有显著的优点 国内外牛磺酸的制取多采用化学合成法，其中主要有以下几种方法i “： 二氯乙烷法以二氯乙烷为原料，经磺化、氨化、酸化三步合成， 其最大的优点是原料较易获得。但本法工艺落后，生产步骤多，原料多， 副产物多，成本很高。 乙醇胺法反应分脂化、磺化两步进行： n h z c h 2 c h 2 0 h ( d + t - 1 2 s 0 4 ，n h 2 c h 2 c h 2 0 s 0 3 h ( ) + h 2 0 ( 1 ) n i 毛c h 2 c h 2 0 s 0 3 h ( i i ) + n a 2 s 0 3 h n h 2 c h 2 c h 2 s 0 3 h ( i i i ) + n a 2 s 0 4 ( 2 ) 反应( 1 ) 不易进行完全，要彻底脱水，一般要加热至1 2 0 1 5 0 ，最 后物料变成固体，粉碎运送都极不方便，工人劳动条件差，劳动强度大， 产品不纯。反应( 2 ) 在亚硫酸钠水溶液中进行，反应时间长，能耗大，又 由于反应时有水存在，h 2 n c h 2 c h 2 0 s 0 3 h 则发生反应( 1 ) 的逆反应，水 解又生成乙醇胺，水分越多，收率越低，在工业生产中难以控制。 乙撑亚胺法以乙撑亚胺为原料，直接与亚硫酸反应。 该法反应条件温和，没有副产物，精制十分方便，投资省，成本低， 但乙撑亚胺毒性大，易聚合爆炸，不易保存，而且此反应为剧烈放热反应， 给工业化生产带来困难。 合成法总的来说，均具有原料毒性大，工艺操作复杂，生产设备投资 高，回收困难，环境污染等问题。而从天然物中提取牛磺酸，无任何有毒 试剂加入，生产过程亦无环境污染，设备简单操作易行，与合成品相比， 更易被人们所接受。而且，可以利用海洋产品加工的下脚料提取牛磺酸， 提高海洋资源利用率，减少环境污染。目前，国际市场上从天然物提取的 牛磺酸的价格远高于合成品，我国海洋生物资源丰富，从鱼贝类及其下脚 料中提取牛磺酸，具有巨大的经济效益。所以从海洋生物中提取牛磺酸将 成为人们关心和研究的热点。 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 表1 3 牛磺酸的各种合成方法和产率情况1 t a b l e1 3 s y n t h e t i cm e t h o d sa n dy i e l do f t a u r i n e 名称 产率 2 - - 氯乙胺氢盐酸盐合成法 2 一氨基乙醇合成法 乙撑亚胺合成法 胱胺氧化合成法 n 一乙烯基烷基酰胺合成法 2 一卤乙磺酸钠合成法 乙二磺酸酐合成法 硝基乙烯合成法 磺基丙氨酸脱羧合成法 1 9 从天然物中提取牛磺酸的方法 法。 目前，主要采用从原料经提取、分离、精制，最后得牛磺酸纯品的方 1 9 1 水煮提取法分离牛磺酸m 1 牛磺酸在水产动物组织中以游离状态存在，适合水煮法提取。提取液 中除含牛磺酸外，还有大量的强电解质盐类和蛋白质、多糖等物质。在用 沉淀法分离除去蛋白质、多糖之后，提取液中的牛磺酸和强电解盐类通过 盐型离子交换树脂，用蒸馏水洗脱，利用盐型离子交换树脂的董南排阻作 用，强电解质盐类先于牛磺酸流出，接取电导率下降的流份，通过浓缩可 制得牛磺酸纯品，使脱盐和牛磺酸精制同时进行。 样品经过预处理后，使提取液浓缩至原体积的1 6 ，加入1 ：l 盐酸调p h 1 2 砉| 奶 娜 嘶 黔 一 哪 一 ；。 青岛科技大学研究生论文 值至3 ，即有酸性蛋白沉淀，用离心法( 2 0 0 0 r m i n ) 分离，离心液用5 m o l l n a o h 调p h 至l o ，即有碱性蛋白质沉淀，离心分离。离心液用盐酸调p h 至4 5 ，待上柱。使提取液通过n a + 型强酸性离子交换树脂，蒸馏水洗脱， 洗脱速度为1 0 m l m i n 。接取电导率开始下降至稳定期间的流出液，然后经 结晶重结晶，即可得牛磺酸针状晶体，反复重结晶，纯度可达9 8 。5 。 1 9 2 高温高压提取法分离牛磺酸 水煮提取法所得提取液中含有大量的蛋白质等物质，给牛磺酸的分离 带来不便。昌子有1 采用高温高压下把原料处理一定时间，所得提取液中 不含蛋白质，不仅简便了分离操作，而且提高了分离收率。 将水产原料在温度5 0 - - - 3 5 0 ，压力5 2 0 0 k g c m 2 条件下，保存一定时 间，即可得到液体物质。将此溶液通过活性碳脱色，离子交换分离，乙醇 结晶纯化后即可得到牛磺酸。 1 9 3 利用蛋白酶分离牛磺酸 上述两种方法均采用离子交换法分离提取液，但因离子交换法需要阴、 阳离子两根交换柱，且为了再生离子交换树脂，使用大量的强酸强碱溶液， 使操作繁琐，而且浪费试剂。吉川秀范。”等人利用蛋白酶处理提取液，经 冷却，直接分离即可得到牛磺酸。 水产原料经水煮提取后，在提取液中加入o 0 1 - - - 0 1 ( 重量) 蛋白酶，将 温度控制在4 5 - - 6 0 范围内，反应2 5 小时，反应结束后，加入o 1 1 的 硅藻土，使未分解的蛋白质及小颗粒杂质沉淀，放置一定时间，取上层清 液加热至8 0 左右，趁热过滤除去杂质，滤液经冷却可析出牛磺酸。 1 1 0 牛磺酸的分析方法 随着牛磺酸研究及应用的迅速发展，牛磺酸的定量分析方法也有待进 一步改进和完善，现把目前常用的牛磺酸测定方法列举如下： 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 1 1 0 1 柱前衍生离子色谱法 1 1 0 1 1 邻苯二甲醛( o p a ) 柱前衍生离子色谱法“ 样品经简单预处理后，采用在2 巯基乙醇存在下，o p a 与牛磺酸生成 具有荧光性衍生物，用反相高效液相法分离提取物中的牛磺酸，在荧光下 检测定量。柱前衍生剂含有1 2 m go p a 和1 2 5 u l2 - 巯基乙醇的( p h = 9 5 溯酸 钠缓冲液。流动相为甲醇：0 0 5 m 醋酸钠缓冲液( p h = 6 ) ：四氢呋喃= 3 5 ：6 5 ：1 。 荧光检测器波长为3 3 4 n m 和4 2 5 n m 。该方法具有前处理简单，衍生试剂、 反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，检测灵敏度高等特点。 但操作过程较繁琐，容易影响定量的准确性，因此准确控制衍生反应是整 个测定的关键。 1 1 0 i 2 邻苯二甲醛尿素柱前衍生离子色谱法 采用邻苯二甲醛柱前衍生法具用灵敏度高，定量准确等优点，但巯基 乙醇具有无法消除的恶臭，对人体毒害大。谢航等“采用尿素替代巯基乙 醇的o p a 衍生试剂，在酸性条件下与枸杞液中的牛磺酸反应，避免了巯基 乙醇的恶臭和毒害，具有经济、安全等特点。 将干枸杞经简单预处理后，通过阳离子交换柱脱去样品中其他氨基酸， 再通过z o r b a x c 8 柱进行柱前衍生分离，用紫外检测器在3 3 0 n m 处检测定 量。衍生剂；a 4 o p a 甲醇溶液b 尿素：磷酸钠盐缓冲液( p h = 6 8 ) = 1 ：3 ( w v ) 。流动相：甲醇；o 0 1 m o l l 乙酸钠溶液( p h = 6 8 ) = 3 5 ：6 5 ( v v ) 。 紫外检测波长3 3 0 r i m 。牛磺酸浓度在0 1 1 0 m o l l 范围内可被定量测定。 回收率可达1 0 0 3 1 1 9 8 ，变异系数为1 9 4 。 1 1 0 2 柱后衍生离子色谱法 样品经预处理后，在阳离子交换柱中被分离，在与o p a 进行柱后衍生 反应，有荧光检测器检测定量，该方法具有操作简便，可连续反应以实现 自动化分析，灵敏度高等优点，但分离需使用价格昂贵的钠离子交换柱， 给此法的推广应用带来了困难。 1 4 青岛科技大学研究生论文 1 1 0 3 薄层色谱法m 1 将样品中牛磺酸经离子交换柱提纯后，以薄层色谱法作定性、定量实 验。 制备离子交换柱对样品进行预处理后开始测定。制各薄层板、点样、 展看、显色，根据样品r f 值进行定性，根据斑点大小及颜色深浅进行半定 量测定。该方法既能进行定性测定，又能定量测定，操作简便，不需特殊 试剂和昂贵仪器，适宜在基层单位推广应用。但测定不是很精密。 1 1 0 4 分光光度法 1 1 0 t 4 1 茚三酮比色法 用酸性阳离子交换树脂分离，柱后茚三酮显色，于4 4 0 n m 检测牛磺酸 含量，但由于茚三酮与牛磺酸难显色，因此定量有一定困难。 1 1 0 4 2 酚试剂比色法 试样用酸性阳离子交换柱分离后与磷酸盐缓冲液混合，d n h 酚试剂和 次氯酸钠溶液反应，生成兰色化合物，于6 3 0 n m 下检测牛磺酸含量。 1 1 0 5 氨基酸分析仪测定法“3 1 氨基酸分析仪分析氨基酸主要是通过强酸性阳离子交换树脂对氨基酸 的吸附、洗脱、分离来完成的。将样品进行预处理后上机检测，利用牛磺 酸与茚三酮反应后的光密度与牛磺酸浓度成正比，将样品得到的峰面积与 标准图谱中相对应的峰比较，得出牛磺酸含量。 这种方法具有较高的精密度，加标回收率在9 7 一1 0 5 之间。但对实 验仪器要求严格，样品经预处理可防止其他氨基酸的干扰。 海洋生物中牛磺酸的提取及分析 光谱法测定牛磺酸 目前，牛磺酸的分析方法主要采用氨基酸分析仪和柱前衍生高效液相 色谱法。李丽莉m 1 采用氨基酸分析仪分析测定了几种海产品中氨基酸和牛 磺酸含量；钱琳琳等“”采用在2 一巯基乙醇存在下，o p a 与牛磺酸生成具有 荧光性衍生物，用反相高效液相法定量测定牡蛎提取物