（发酵工程专业论文）海洋微藻抗菌活性藻株筛选及其活性物质分离纯化研究.pdf

天津商业大学硕士学位论文 摘要 酎药性逐渐成为2 l 世纪威胁人类健康的一大因素，故开发新的抗菌资源迫在眉睫。近 年来，由于具有丰富的生物活性物质，微藻及其代谢物的研究逐步成为世界各国科学家的 研究热点。本文采用琼脂扩散法测定- j 9 种微藻不同溶剂提取物的抗菌活性，筛选出目标 藻株进行优化培养，并对其抗菌活性物质进行了分离纯化研究。 本文采用琼脂扩散法测定了9 种微藻不同溶剂提取物的抗菌活性。结果显示：( i ) 9 种 微藻不同溶剂提取物均显示了不同程度的抗菌活性，尤其是球等鞭会藻h 2 9 ，球等鞭会藻 3 0 1 1 ，球等鞭金藻8 7 0 1 ，牟氏角毛藻，扁藻和小球藻具有良好的广谱抗菌活性，且其营养 要求简单，易培养，具有巨大的开发潜力。 ( 2 ) 在所受试的微藻提取物中，6 6 6 7 的具 有抗金黄色葡萄球菌活性的样品仍具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，尤其是球等鞭 金藻h 2 9 、牟式角毛藻、蓝隐藻、球等鞭金藻8 7 0 1 和扁藻的不同溶剂提取物具有良好的抗 m r s a 活性，表明微藻可能是开发抗m r s a 物质的潜在资源。( 3 ) 球等鞭会藻h 2 9 丙酮提 取物对革兰氏阴性菌( 大肠杆菌) 和革兰氏阳性菌( 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌) 均 有抑制作用，且其对m r s a 的抑制作用是万古霉素( 4 8 $ x g m l ) 抗m r s a 作用的一半， 表明- 丌发球等鞭金藻h 2 9 中的抗菌物质具有广泛的前景。 目前，球等鞭金藻h 2 9 的细胞培养密度较低，不利于其活性物质的分离制备。故本实验 以舵培养基为基础，采用正交试验方法对其培养条件进行了优化。其最佳培养条件为：( 1 ) 温度为2 5 c ，光通量在5 0 0 0 l u x ，p h 在8 时内生长最好。( 2 ) n a n 0 3 、n a h 2 p 0 4 、f e c 6 h 0 7 、 n a c i 的浓度依次为3 7 5m g l 、4 4m g l 、3 9g l 、2 3g l ，且其余营养成分与f ，2 培养基 相同时，球等鞭金藻h 2 9 生长最好，生物量达到1 3 5 9 l 。 以球等鞭金藻h 2 9 藻粉的丙酮粗提物为材料，经过反复柱层析，最后分离到两种抗菌物 质l l 和l 2 ，它们对耐甲氧西林会黄色葡萄球菌的m i c 分别为1 5 0s t g m l 和1 0 0s t g m l ， l 2 对大肠杆菌的m i c 为1 0 s t g m l 。根据紫外光谱和质谱结果分析，化合物l l 可能为醌类 化合物，化合物l 2 的分子量为2 7 4 ，其可能为硫醚类化合物，具体结构需要进一步研究。 关键词：球等鞭会藻：微藻：抗菌活性：筛选；分离纯化：耐甲氧西林会黄色葡萄球菌 天津商业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s d r u g - r e s i s t a n c eo fm i c r o o r g a n i s m sh a sb e c o m i n go n eo ft h ef a c t o r st h r e a t e n i n gt h eh e a l t ho f h u m a ni n2 1c e n t u r y t h e r e f o r e ，e x p l o i t i n gn e wa n t i m i c r o b i a lc o m p o u n d si se m e r g e n t t h e r e s e a r c ho nm i c r o a l g a e sa n di t sm e t a b o l i s m si sb e c o m i n gh o tt o p i ca r o u n dt h ew o r l dr e c e n t l y i n t h i sa r t i c l e ，w em a i n l ys t u d yt h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fd i f f e r e n ts o l v e n te x t r a c t so f1 0 m i c r o a l g a e su s i n ga g a rd i f f u s i o nm e t h o d ，o p t i m i z i n gt h ec u l t u r a lc o n d i t i o n s ，i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o no ft h et a r g e tm i c r o a l g a e t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fd i f f e r e n t l ys o l v e n te x t r a c t sf r o mn i n em i c r o a l g a e sw e r e i n v e s t i g a t e di nt h i sa r t i c l e ，v i aa g a rd i f f u s i o nm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) d i f f e r e n t s o l v e n te x t r a c t sf r o mt e nm i c r o a l g a e si n d i c a t e dd i f f e r e n td e g r e e so fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s a g a i n s tt e s t e dm i c r o o r g a n i s m s e s p e c i a l l y , i s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9 ，l s o c h r y s i sg a l b a n a p a r k e8 7 0 1 ，i s o c h r y s i s g a l b a n ap a r k e3 0 1 1 ，c h a e l o c e r o sm u e l l e r i ，c h l o r e l l a p y r e n o i d o s ac h i c k a n dp l a t y m o n a s h e l g o l a n d i c av a rt s i n g t a o e n s i ss h o w e dc o n s i d e r a b l ea n dw i d es p e c t u m a n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s o t h e r w i s e ，t h ee x p l o i t a t i o no ft h e s em i c r o a l g a e si sp o t e n t i a l l yv a l u a b l e f o rt h es i m p l en u t r i t i o n a ln e e d sa n de a s i l yc u l t u r e di np h o t o b i o r e a c t o r ( 2 ) i na l lt h es a m p l e s ， 6 6 6 7 o f t h ee x t r a c t ss h o w i n ga n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u se x h i b i t e dt h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tm e t h i c i l l i n r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ( m r s a ) i ns p e c i a l ， i s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9 ，c h a e t o c e r o sm u e l l e r i ，c h r o o m m o n a ss a l i n a ，i s o c h r y s i sg a l b a n a p a r k e8 7 0 1a n dp l a t y m o n a s h e l g o l a n d i c av a rt s i n g t a o e n s i si n d i c a t e dc o n s i d e r a b l ea c t i v i t i e s a g a i n s tm r s a ，w h i c hp r o v i n gt h a tt h e s em i c r o a l g a e sm a yb e an e wp o t e n t i a ls o u r c e so f a n t i m r s as u b s t a n c e s ( 3 ) t h ea c e t o n ee x t r a c t so fi s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9i n d i c a t e d c o n s i d e r a b l ea c t i v i t i e sa g a i n s ts t a n d a r ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，b a c i l l u ss u b t i l i sa n de s c h e r i c h i a c o l i m o r e o v e r ，t h ea c t i v i t yo fa c e t o n ee x t r a c t so fi s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9a g a i n s t m e t h i c i l l i n r e s i s t a n ts t a p h ) 一l o c o c c u sa u r e u $ i se q u a lt oh a l fo ft h a to fv a n c o m y c i nh c l ( 4 8 i t g m l ) w h i c hp r o v i n gt h a te x p l o i t i n gt h ea n t i b a c t e r i a lc o m p o u n d sf r o mi s o c h r y s i sg a l b a n a p a r k e1 - 1 2 9h a sb r o a d f o r e g r o u n d a tp r e s e n t ，t h ec e l lc o n c e n t r a t i o no fc u l t u r i n gl s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9i ss ol o wt h a ti t s b i o a c t i v ec o m p o u n d sc o u l dn o tb ee a s i l yi s o l a t i o na n dp r e p a r a t i o n t h e r e f o r e ，b a s e do nt h ef 2 m e d i u m ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o n so ft h em i c r o a l g a ew e r eo p t i m i z e di nt h i sa r t i c l e t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ：( 1 ) o p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n so fl s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9w e r e t h a t 天津商业大学硕士学位论文 t e m p e r a t u r ew a s2 5 c ，i l l u m i n a t i o ni n t e n s i t y5 0 0 0l u xa n dp h8 ( 2 ) t h eb e t t e rm e d i u mf o r m u l a f o rt h eg r o w t ho ft h ei s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k eh 2 9w a su s i n gn a n 0 3a sn i t r o g e nw i t ht h e o p t i m u mg r o w t hc o n c e n t r a t i o no f3 7 5m g l ，n a h ：p 0 4 船p h o s p h o rw i t ht h eo p t i m u mg r o w t h c o n c e n t r a t i o no f4 4m g t la n df e c 6 h 5 0 7 豁i r o nw i t ht h eo p t i m u mg r o w t hc o n c e n t r a t i o no f 3 9 9 ，l t h eb e s tg r o w t hc o n c e n t r a t i o no f n a c lw a s2 3g r l t h er e s tn u t r i t i o na r et h es a m ew i t h t h e f 2 b a s e do nt h ea c e t o n ee x t r a c t so fi s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k ch 2 9 ，t w oa n t i m i c r o b i a l s u b s t a n c e s ，n a m e d 鲻l ia n dl 2 ，w e r ei s o l a t e d ，v i ae x t r a c t i n ga n dr e d u p l i c a t e c o l u m n - c h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl le x h i b i t e da n t i b a c t e d a la c t i v i t ya g a i n s t m r s a ，a n di t sm i ci s15 0 p g m l l 2e x h i b i t e da n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s tm r s aa n de ，c o l i ， a n di t sm i ca r e1 0 0p g m la n d1 0i t g m l ，r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so fu v a n d h p l c e s i m s l 1m a yh eq u i n i n e s ，m o l e c u l a rw e i g h to fl 2i s2 7 4 ，a n dl 2m a yb es u l p h u r i c e t h e r h o w e v e r , m es t r u c t u r e so fl la n dl 2s h o u l db ef u r t h e rs t u d i e d k e y w o r d s ：l s o c h r y s i sg a l b a n ap a r k e ；m i c r o a l g e ；a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ；s c r e e n ；i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o n ；m e t h i c i u i n - r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s i i 第一章前言 第一章前言 1 1 微藻及其应用现状 1 9 4 0 年，抗生索的商业化生产为人类健康做出了巨大贡献，但是由于环境、医药和社 会因素，在二十世纪末传染疾病的发病率和死亡率高的情况再度出现i ”，这主要是由于细 菌的耐药性对抗生素构成了威胁。尽管大量抗生素可用于治疗感染性疾病，但由于它们作 用于相同的生物途径甚至相同的酶，反而提高了细菌的耐药能力1 2 i 。因此，寻找和丌发新 的抗菌机制药物是开发新抗生素的迫切任务和发展趋势。 天然产物始终是新药的源泉p 】，随着陆地资源的枯竭，丰富的海洋生物资源无疑是人 们寻找天然药物的重要来源。2 0 世纪6 0 年代初日本学者对河豚毒素的研究拉丌了海洋药 物研究的序幕。作为海洋的初级生产者和海洋生物种属的主体，海洋微藻在海洋生态系统 的物质循环和能量流动中起着重要作用，独特的生存环境和原始地位赋予了微藻多种新颖 独特的具有生物活性的代谢产物，使其成为丰富的开发新药的潜在资源1 4 1 。 微藻虽然是地球上出现最早的生物，但由于它们个体微小( 一般只有几微米到十几微米 或几十微米) ，一般要用显微镜才能看到，所以对它们的研究起步较晚对海洋微藻来说，早期 研究主要集中在微藻的分类学和生态学方面【5 1 。 近几十年来，微藻及其代谢物的研究逐步成为世界各国科学家的研究热点。原因有两 方面【6 l ：一方面是海洋微藻是有害赤潮的源泉。有害赤潮可通过消耗水中氧气、堵塞鱼类 呼吸器官、分泌藻毒素或累积毒素等途径造成鱼虾贝类大量死亡和危害人类健康：另一方 面是海洋微藻含有丰富的生物活性物质。由于海洋微藻种类多，营养丰富、富含微量元素和 各类生物活性物质，而且细胞小，易于人工繁殖，因此，它们不仅适宜作为水产养殖动物幼体 的适口饵料，而且可以作为人类的保健食品，还可以提取在食品、医药、化工等方面有重要 应用前景的生物活性物质f 见图1 1 ) t 7 l 。 尽管微藻生物技术还没有受到大型制药公司的青睐，但是科学家们仍然对微藻的生物 技术及其产品充满信心。m i g u e lo l a i z o l a s l 认为这只是因为他们缺少成功的例子来证明罢 了，今后微藻研究的发展方向主要是其药物和高价值化合物的筛选及其生产。 1 1 1 微藻中的活性物质 2 0 世纪8 0 年代后，对微藻的生物活性物质的研究成了人们关注的热点，主要与陆地有限 资源的衰竭和分析测定新技术的应用有关。s h i m i z u ( 1 9 9 3 ) 根据微藻产物的结构将其分为： 第一章前言 固醇类及膜相关化合物；哈蚌毒索及g o n y a u t o x i n 衍生物；聚醚类化合物；大环内酯类化合 物：开环聚酮化合物；环o x y l i p i i l s 或类二十烷酸化合酸；多肽类化合物；其他藻类产生的 化合物1 9 1 。研究发现，海洋微藻代谢物具有如下活性 1 0 , 1 1 , 1 2 , 1 3 1 ：( 1 ) 抗细菌和真菌活性：( 2 ) 抗病毒( 如艾滋病) 活性：( 3 ) 抗肿瘤；( 4 ) 营养保健作用：( 5 ) 治疗心血管疾病的活性： ( 6 ) 植物或动物生长调节活性：( 7 ) 美容作用；( 8 ) 其他。 f o o i l n u t r a c e u t i c a l ，f u n c t i o n a l f o o d ，f o o da d d i t i v e ， ( e m u l s i f i e r , t h i c k e n e r ) ， s w e e 协 c o m m e r c i a lp r o d u c t s 啼 c o l o r a n b h y d r o c a r b o n s ( f u e l ) f o o d ( 1 e ec r e a m s j e l l i e s a d s o r b e n t sc o n f e c t i o n a r i e s ，j u i c e s ) e n z y m e sa n do t h e rr e s e a r c hc o s m e t i c s ( l i p s t i c k s ，c r e a m s ， m a t e r i a l s l o t i o n s ) p h a r m a c e u t i c a lp r o d u c t s p h a r m a e e u t i c a l a n t i b i o t i c ，a n t i b a c t e r i a l ， b u l k i n ga g e n t , b i n d e r , h a r da n ds o f tc a p s u l e s h e l l ，t h i c k e n e r d i a g n o s t i ca g e n t s 幽i - i 微藻在不同领域的应用 目鲍，工业化上用柬生产活性物质的微藻有小球藻、螺旋藻、杜氏盐藻和阿尘红球藻。 此外，多种微藻及其生物技术产品j 下在被丌发，具有巨大的开发潜力和诱人的市场前景”“。 1 1 2 微藻在药物研发中的研究意义 微藻也称单细胞藻类，是指那些在显微镜下才能辨别其形念、能光自养和产生色素的 微小藻类类群。微藻包括海洋中不能游动的单细胞的和丝状体的真核海藻、微藻鞭毛藻、 微浮游藻等，其中有进化过的、近代的以及古老的微藻。迄今全球已知微藻约2 万余种， 约占全球已知藻类的7 0 ，可见其具有高度的生物多样性”1 。 第一章前言 、| e w 衄：穰r h o 钳 d b 茹 ，破嘶：能 幽i 2 研究微藻的巨大优势就是其代谢物的新颖性，这使它由研究转向约物开发具有很高的可能 性。( 基于夏威夷大学药物研究所对1 7 8 种活性物质的研究g p a k e r s o n ) 客观的讲，微藻的利用具有悠久的历史，比如在非洲和墨西哥，当地居民早在远古时 代就食用螺旋藻( 勋i r u l i n a ) 等等。但是有目的性的利用微藻生产活性物质却仅有几十年 的历史，而被深入研究或者用于工业化生产的微藻更是屈指可数，不过这为微藻的丌发提 供了巨大的空间。此外，微藻中的活性物质结构新颖，是陆地上的生物和其他物种所不能 含有的1 1 6 】( 见图1 - 2 ) 。综上所述，微藻具有良好的药物开发前景。 相对于其他生物来说，微藻还具有很多独特的优点，使它由研究转向应用更具有可行 性。具体优点如下【1 7 】：( 1 ) 种类繁多，迄今发现地球上约有3 力余种不同的微藻，占全球已 知藻类的7 0 左右。而且新的品种正在不断地被发现，具有广泛的开发潜力；( 2 ) 许多微藻 可以进行人工养殖，且生长速度快，光合效率高，营养要求简单，无性繁殖且周期短，能够较 好地保证资源供应而且成本低，较易投入生产：( 3 ) 微藻可塑性强，容易通过改变环境条件 等因素来提高其体内生物活性物质的含量：( 4 ) 随着光生物反应器技术( e n c l o s e d d h o t o b i o r e a c t o r s ，p b r s ) 的应用【1 8 】，微藻的培养及其活性物质的生产具有不污染环境、可 持续发展的优势。 1 2 微藻抗菌物质的国内外研究现状 几十年来抗菌物质筛选一直是海藻化学的研究内容之一。六十年代以来，人们从大量 海藻中筛选出了许多抗细菌和抗真菌的种类，一些有效成分也逐渐被确定2 0 2 1 1 a 然而， 大多数的研究都集中在大型海藻中，对微藻的抗菌活性的研究却进行得较少。而最近的研 第一章前言 究则表明1 2 2 1 ，许多微藻含有结构独特的抗菌物质，微藻所产生的抗生素大多未鉴定清楚， 已知的有脂肪酸、其它有机酸、溴酚、酚类抑制剂、丹宁、类萜、多糖和其它碳水化合物 及酚类( 见表l - 1 ) 。 微藻中的许多种属都能产生生物活性物质。p r a u ( 1 9 4 0 ) 等 2 3 1 是最早从微藻中分离抗生 素的研究者，他们从小球藻中分离到小球藻素( c h l o r e i l i n ) 脂肪酸混合物，此混合物具有抗 细菌和自身毒性的功能。此后，各国科学家陆续发现了许多具有抗菌活性的微藻。h a n s e n 研究发现马汉母赭胞藻( o c h r o m o n a sm a t h a m e n s i s ) 中存在一种结构尚未鉴定清楚的叶绿 素酯( c h l o r o p h y l l i d e s ) 抗生物质。丙烯酸是人们第一次从一种褐囊藻( p h a e o c y s t i s p o u c h e “i ) 中分离得到并确认对革兰氏阳性细菌、酵母菌、曲霉菌等很有效的抗菌物质，它在细胞内 通常部分以游离状态存在，部分以无活性的巯基乙酸二甲内盐形式存在。i s h i b a s h i 等从伪 枝藻( s c y t o n e m ap s e u d o h o f m a n n i ) 中分离出s c y t o p h y t i n - a 是强烈的细胞毒素和杀菌刺，对 k b 癌细胞最低抑制浓度为1 p g m l ，在浓度为l o i _ t g m l 时，具有广谱的抗真菌作用。 对海洋蓝藻次级代谢物生理活性的研究报道最早见于1 9 6 2 年s t a r r 等发表的文章，研 究者从夏威夷蓝藻l y n g b y am a j u s c u l a 藻体的甲醇提取物中发现有抗生素活性，对 m i c r o c u c c u s p y o g e n e sv a t ，a u r e e u s ，m y c o b a c t e r i u ms m e g a t i s 等有拮抗作用。m o o r e 等在o a h u 的k a h a l a 海滩的蓝藻m a j u s c u l a g o m o n t 藻体的二氯甲烷提取物中得到的内酯m a l y n g o l i d e 则具有明显的抗菌活性，尤其对m s m e g m a t i s 和s t e r p t o c o c u sp y o g e n e s 有较强的拮抗活性。 m o o r c 等从陆生的蓝藻泉生软管藻( h a p a l o s i p h o nf o n t i n a l i s ) 的提取物中分出一种含氯和 异腈基团的吲哚生物碱，软吲哚a ，这种吲哚生物碱具有抑制藻类生长和抗真菌的活性。 后来m o o r e 又从这种藻中分离出1 8 种含量极少的软吲哚，它们皆具有抗细菌和真菌的活 性【2 4 1 。g e r w i c kw h 等从北波多黎各沿岸的浅水域中采集的热带海洋蓝藻( h o r m o t h a m n i o n e n t e r o m o r p h o i d e s ) 分离到一系列亲脂性的环肽，其中极性最小的一个环肽h o r m o t h a m n i n a 具有细胞毒性和抗微生物活性，其藻体的脂提物有明显的抗革兰氏阳性菌的活性，用硅胶 柱层析和r p h p l c 可以容易地将其分离。灰色念珠藻( n o s m cm u s c o r u m ) 含有的酚类化合 物能够抑制多种人类致病菌的生长。p i t ib o m bh o l e s 从蓝藻l y n g b y am a j u s c u l a 分离出的 p i t i p e p t o l i d e s a 和b 对分支杆菌m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s a t c c 2 5 1 7 7 和a t c c 3 5 8 1 8 表现 出了比链霉菌素还要强的活性【2 5 1 。s u s a n n 通过研究不同的蓝藻发现，蓝藻可产生多种抗菌 物质，可作为抗生素的重要来源【2 6 j 。 硅藻是海洋中最为丰富的微藻，但其次尘代谢产物报道较少。近来研究发现，硅藻的 代谢物具有生物活性和化学多样性。近来的研究表明，海洋硅藻c h a e t o c e r o sl a u d e r i ， 第一章前言 c b r e v i s c s o c i a l i s tc d i a d e m a ，cp r o t u b e r a n s ，c p s c e u d o c u r v i s e t u s ，c s i m p l e x ，t e t r a s e l m i s s u e c i c a ，s k e l e t o n e m a c o s t a t u m 等具有抑制弧菌的作用，特别是s k e l e t o e m ac o s t a t u m 具有 极广的抗菌谱。1 9 6 3 年b u r k h o l d e r 研究发现中肋骨条藻( s k e l e t o n e m ac o s t a t u m ) 的水提液能 抗大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌及一些海洋细菌的生长：1 9 6 6 年a u b e r t 和 g a u t h i e r l 2 2 1 发现秘鲁角刺藻( c i l a e t o c e r o sp e r a v i a n u s ) 、长菱形藻( n i t z s c h i af r a u e n f e l d i i ) 等的提 取物能抑制藤黄八叠球菌、奈氏球菌的生长。p e s a n d o 研究表明同本星杆藻( a s t e r i o n e l l a j a p o n i c a ) 6 p 产生的顺二十碳五烯酸( c i s - e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ) 的光氧化产物具极强的抗生 活性。 甲藻作为一种结构特殊的海洋微藻，其次生代谢产物结构特殊，活性多样，尤其是其 显著的抗菌活性受到广泛关注。甲藻产生的多醚化合物和大环内酯化合物与链霉菌属产生 的大坏内酯抗生素很相似。前一类化合物以冈田酸为代表，它是一种强力的蛋白磷酸酶抑 制剂。后一类化合物包括一系列细胞毒素化合物，如由a m p h i d i n i u ms p 产生的a m p h i d i n o l i d e s a v ，来自p r o r o c e n t r i u m l i m e 的p r o r o c e n t r o l i d e 以及发现于g o n i o d o m c l ( g o n y a u l a x x xs p ) 的g o n i o d m i n a 。g o n i o d m i n a 具有强力的抗真菌活性。另外，从i ； 沟藻属甲藻中分离到的 a m p h i d i n o l sf a m s ) 类化合物都具有显著的抗菌作用，其中以a m 3 的活性最型”】。m u r a k a m i 从甲藻a l e x a n d r i u mh i r a n o i 中分离出来的g o n i o d o m i na ( 6 0 ) 具有强力的抗真菌活性1 2 ”。 还有许多其它学者对微藻的抗菌活性进行了筛选，具有抗菌活性的有效成分也逐渐被 鉴定。所发现的海藻萜类及其他代谢产物大多数含有卤元素，特别是溴元素。并且这些化 合物多数带有较强的抗菌活性。溴代酚大都具有抗菌活性。至今，溴代鼢主要在红藻的松 节藻科( r h o d o m e l a c e a e ) 中发现，但近来，从蓝藻、绿藻、和褐藻中也陆续发现了溴代酚。 许多海藻的提取物具有抗菌活性，都是与卤代酚类物质的存在有关。综上表明不同的藻类 对细菌和真菌的抑制活性有明显的差异。 有关研究表明，微藻的脂溶性化合物的抗菌活性要明显大于其水溶性化合物的抗菌活 性。1 9 8 8 年英国的r i c h a r d 掣2 9 】对4 0 0 种淡水微藻进行了大规模的筛选，发现其中有4 0 种 具有抗菌活性；k e l l a m 等1 3 0 l 在1 9 8 8 年对1 3 2 种海洋微藻和4 0 0 种淡水微藻进行了筛选，发 现有2 0 多种具有抗菌活性；s t e p h e n 等1 3 1 在1 9 8 9 年对1 3 2 种海洋微藻进行了筛选，发现有 2 7 种微藻具有抗菌活性；8 0 年代的这三位学者都发现具有抗菌活性的化合物都是脂溶性化 合物。而少数为水溶性化合物；1 9 8 8 年同本的村上昌弘等【3 2 l 对2 0 多种微藻进行了抗菌活性 筛选，发现有l o 种其脂溶性组分都或多或少的有抗菌活性，而水溶性组分均无活性。 墨= 童堕童 一一 表卜l 微藻抗生素 微藻 有效成分 活性 绿藻jc h o r o p h y t a 小球藻c h l o r l l as p 水绵s p i r o g y r as p 金藻fj 球彳i 藻c o c c o l i t h u ss p 单金鞭藻m o n o c h r y s i ss p 褐胞藻p h a e o c y s t i s p o u c h e i i 小定鞭金藻p h a e o c y s t i s p a r v u m 砖藻l lc h r y s o p h y t a 羽纹脆杆藻f r a g u k k a r u a p i n n a t a 骨条藻s k e l e t o n e m ac o s l a l u r a 海链藻t h a l a s s i o s i r as p 幅杆藻b a c t e r i a s t r u me l e g a n s 聚生角刺藻cl a n d e r i 钉皮藻l i t h o d e s m i u mu n d u l a t u m 星杆藻a s t e r i o n e l l a j a p o n i c a 舟形藻n a v i c u l ai n s o i a t o 甲藻jp y r r o p h y t a 片甲藻g o n i o d o m as p 原膝沟藻p r o t o g o n y a u l a xt a m a r e n s i s 原甲藻p r o r o c e n t r u mm w a n a 监藻fj c y a n o b a c t e r i a 眉藻c a l o t h r i xb r e v i s s i m a 巨人鞘丝藻l y n g b y am a j u s c u l e 水鞘藻h y d r o c o l e u ss p 水华鱼腥藻a n a n b a e n a f l o s a - q u a e 小球藻素( 脂肪酸混合物) 抗细菌杀藻 丹，j l 抗病毒 萜烯，碳水化台物 萜烯，碳水化合物 丙烯酸 糖脂，脂蛋白 肽类 脂肪酸 脂肪酸 脂肪酸 多糖脂肪酸 脂肪酸 核苷朋自肪酸 顺- 二十碳五烯酸植酯 岸甲藻素 萜烯，碳水化台物 萜烯，碳水化台物 溴苯酚 巨人鞘丝藻素 脱溴海螺毒素 萜烯，碳水化合物 抗细菌 抗细菌 抗细曲 抗卤、抗原虫 抗真曲、抗细菌 抗细菌 抗细菌 抗细菌 抗真菌、抗细凶 抗细凶 抗细菌 抗细凶 抗细曲 抗细菌 抗细凶 抗细菌、杀藻 抗真菌 抗细菌 抗细菌 灰色念珠藻n o s t o c u s c o r w - i 酚类化合物 抗菌 一一一 6 第一章前言 有关微藻提取物对细菌和真菌抑制活性的比较，通常是对细菌的抑制活性大于对真菌 的抑制活性。r i c h a r d 等对蛋白核小球藻的研究中发现，无论是其脂溶性化合物的粗提物， 还是其各洗脱组分，均对2 种革兰氏阴性菌大肠杆菌和普通变形杆菌没有抑制活性。 说明蛋白核小球藻的脂溶性化合物对革兰氏阳性菌的抑制活性大于对革兰氏阴性菌的抑制 活性。该实验对蛋白核小球藻的研究中，其脂溶性化合物的粗提物对真菌的抑制活性明显 大于对细菌的抑制活性。 我国是海洋大国，包括渤海、黄海、南海、东海四大海域。海岸线长1 8 万公罩，岛 屿海岸线长1 4 万公罩，享有主权和管辖权的海域面积约3 0 0 万平方公罩，跨越热带，亚热 带、温带、寒带不同气温带。拥有四大类型海洋生态系统，包括滨海湿地生念系统、珊瑚 礁生态系统、上升流生态系统和深海生态系统。我国的海洋微藻种类繁多，资源极为丰富( 已 记录的近2 0 0 0 种，约占全球微藻的1 0 ) 。但是，目前我国微藻中抗菌活性物质的研究很 少，因此积极开展我国海洋微藻抗菌活性物质的大规模筛选与新药研发，以便尽快地进入 微藻抗生素开发的前列。 1 3 抗菌物质的筛选方法研究现状 当自h ，丌发新抗生素的途径有两种：一种是在原抗尘素基础上进行修饰，另一种是在天 然资源中寻找新的抗菌物质和机审l j 3 3 l 。海洋药物研究可分为两个步骤：一是药物作用的发 现：二是药物的应用。药物筛选是新药研究的关键步骤。现在市场上大多数使用的抗生素 都是从天然资源中随机筛选，一旦发现抗菌物质，接下来的大量工作是利用生化和基因技 术识别其分子靶点，观察其是否有选择性。理论上，细胞分析可以通过快速地浏览基因文 库来找到许多分子靶点【3 4 1 。最近，b a y 通过基因和蛋白表达图谱确定了乙酰- - c o a 羧化酶 与转肽酶抑制剂的作用机理，这是首次通过基因和蛋白表达图谱识别了未知机理抑制剂的 作用机理【”1 。 目前，应用于开发新的抗生素三个主要筛选方法是：细胞水平筛选( a n t i b a c t e r i a l w h o l e c e l l s c r e e n i n g ) ；靶点筛选( t a r g e t b a s e ds c r e e n i n g ) ：结构基因组学( s t r u c t u r e g e n o m i c s ) | ”j ( 见图1 3 ) 。 第一章前言 e 至蚕至要 c ，y 删_ ，c t ，f 佃妒 i c o 州t - 叫口，h t 8 h ”、懈n 一a f 口1 k l t - n f l l y ”l - t 1 1 ，d i 7 t _ m d l yb 口c h u c u o n 0 i j 啊n _ - _ 咿8r 廿i t d - 口。叫 ，r _ 黼- “k i t i | v i r t u b ；c n 掣肌- m g o n ) k n 协r 扣i 卉；a ；i i k d ；7 砷越j k 图i - 3 抗生素二个主要筛选方法 1 4 天然产物有效成分的提取分离与浓缩方法 1 4 l 溶剂提取法 原理：溶剂提取法是根据天然产物中各种化学成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成 分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，将有效成分从药材组织内溶解出束的方 法。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性 的不同。因此，我们就可以通过对天然产物成分结构分析，去选择提取时该用的溶剂。 总的说来，只要天然产物成分的极性与溶剂的极性性质相当，就会在其中有较大的溶 解度，即所谓“相似相溶”规律，这是选择适当溶剂从天然产物中提取目标组分的重要依据。 ( 1 ) 溶剂的选择 选择溶剂要注意以下三点：溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；溶剂不能 与中药的成分起化学变化：溶剂要经济、易得、使用安全等。 常见的提取溶剂可分为以下三类： 1 ) 水：水是一种强的极性溶剂。天然产物中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太 大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸类、生物碱盐等都能被水溶出。为了增加某 些成分的溶解度，也常采用酸水或碱水作为提取溶剂。 2 ) 亲水性的有机溶剂：是指与水可以混溶的有机溶剂，如乙醇( 酒精) 、甲醇、丙酮等， 以乙醇最常用。与水相比，用乙醇提取用量少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少： 尽管乙醇为有机溶剂。易挥发，但毒性小，价格便宜，来源方便，可回收反复使用，而且 第一章前言 乙醇的提取液不易发霉变质，因此用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一 3 ) 亲脂性的有机溶剂：就是与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙 酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂 挥发性大多易燃( 氯仿除外) ，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组 织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。大量提取天然产物原料时，直接 应用这类溶剂有一定的局限性。 ( 2 ) 提取方法：用溶剂提取天然产物成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法 及连续回流提取法等。同时原料的粉碎度、提取时日j 、提取温度、设备条件等因素也都能 影响提取效率，必须考虑。 1 ) 浸渍法：浸渍法系将天然产物粉末或碎块装入适当容器中，加入适宜的溶剂( 如乙醇、 稀醇或水) ，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，如用水 为溶剂，其提取液易于发霉变质，须及时处理。