（细胞生物学专业论文）河豚nkef与pbef基因鉴定、功能及机制研究.pdf

摘要 论文围绕n k e f 与p b e f 这两类细胞因子分别开展了其基因鉴定、功能及机 制的研究 第一篇为利用基因共线性等生物信息学方法，首次将两个高度保守基因 n k e f a 与n k e f b 在鱼类中成功预测、克隆及进行生物信息学分析，并在 r n r n a 水平比较了两者在正常机体及l p s 刺激情况下表达谱的变化，初步探讨 了两者在免疫调控功能上的异同。n k e f 序列在物种间的高度同源性以及活性位 点的高度保守性暗示了其抗氧化功能的普遍性。我们利用原核表达产生的可溶性 蛋白用以研究n k e f 的抗氧化功能，并初步探讨了其作用机制。实验从体外分 子水平、细胞水平、细菌模型和斑马鱼模型等层面均证明n k e f 具有抗氧化功 能，该功能除了与n k e f 所具有的保守p e r o x i d a s e 活性相关外，可能还与实验中 首次发现的n k e f 具有过氧化氢酶样功能有关实验发现氧化型与还原型n k e f 均具有该过氧化氢酶样活性，且其功能与空间结构有关。 第二篇为利用生物信息学方法首次克隆了河豚的p b e f 基因并对之进行了生 物信息学分析，且在m r n a 和蛋白水平检测了p b e f 在正常机体中的表达情况。 由于不同物种p b e f 具有较高的同源性，尤其是和烟酰胺的结合位点在物种问非 常保守，这暗示其n a m p r t a s e 活性在进化上高度保守。我们将河豚p b e f 基因 导入细菌并诱导其可溶性蛋白的表达，细菌模型证明导入脊椎动物p b e f 后能在 细菌内重建p n c i i i 途径，而细菌细胞内n a d 含量得到显著提高，其相应的抗 过氧化氢能力也显著增强，表明p b e f 所具有的n a m p r t a s e 活性在进化上高度 保守。 n k e f 和p b e f 的抗氧化功能统一在n a d 的生物合成上，由于p b e f 参与 n a d 的生物合成，因此能提高胞内n a d ( p ) h 的水平，从而为系列抗氧化物蛋白 如n k e f 提供还原力，确保抗氧化功能的发挥由于p b e f 几乎仅存在于脊椎动 物中，因此，该抗氧化机制较为特异性地存在于脊椎动物中，具有一定的理论意 义和应用价值。 关键词：鱼类，n k e f ，p b e f ，抗氧化，p n c ，n a d ，n a m p r t a s e a b s t r a c t t h i sa r t i c l ef o c u s e do nt h em o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n , f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o n , a n dm e c h a n i s mo f n k e fa n dp b e fg e n e si nf i s h i np a r to n e ，b a s e do nt h eb i o i n f o r m a t i c sm e t h o ds u c ha ss y n t e n yc o m p a r a t i v e a n a l y s i sa p p r o a c h , w es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e da n dc l o n e dt h et w oh i g h l yc o n s e r v e d g e n e s ，n k e f aa n dn k e f - b ，i nt e t r a o d o nn i g r o v i r i d i s t h eg e n ee x p r e s s i o n p r o f i l i n go fb o t l l n o r m a la n dl p s s t i m u l a t e dw e r ea l s od e t e c t e d t h eh i g h l y h o m o l o g o u sa n dc o n s e r v e da c t i v es i t e si m p l i e dt h ec o n s e r v e da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f n k e eu t i l i z i n gt h es o l u b l er e c o m b i n a n tp r o t e i nw h i c he x p r e s s e di ne c o l i , w e a n a l y z e dt h ea n t i o x i d a n tf u n c t i o na n dm e c h a n i s mo ft n n k e fi n c e l ll e v e l ，nv i t r o m o l e c u l a rl e v e l ，e c o l ia n dz e b r a f i s hm o d e l s n 圮r e s u l t ss h o w e dt h a t 乃泐f e x h i b i t e da n t i o x i d a n tf u n c t i o nw h i c hm a yp a r t i a l l yd u et ot h ep e r o x i d a s ea c t i v i t y h o w e v e r , b o t l lt h er e d u c e da n do x i d i z e df o r mo ft n n k e fp o s s e s s e dac a t a l a s e l i k e a c t i v i t y , w h i c hm a yb er e l a t e dt ot h et e r t i a r ys t r u c t u r eo fn k e f i np a r tt w o ，w ec l o n e da n da n a l y z e dt h et n p b e fg e n ef o rt h ef i r s tt i m e m e a n w h i l e ，b o t i lt h eg e n ea n dp r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l i n g si nn o r m a lc o n d i t i o nw e r e d e t e c t e d t od e t e r m i n ew h e t h e rt h ev e r t e b r a t e sp b e fc o n t r i b u t e st ot h eb i o s y n t h e s i s o fn a da n di t sa s s o c i a t e da c t i v i t i e s ，w er e c o n s t r u c t e da ne x t r ap y r i d i n en u c l e o t i d e c y c l ei i i ( p n cl l i ) s a l v a g ep a t h w a yb yt r a n s f o r m i n gt h ef i s hp b e fg e n ei n t oe c o l i w h i c hl a c k ss u c hp a t h w a ya n dm e a s u r e dt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fc e l l s r e s u l t s c l e a r l yd e m o n s t r a t e dt h a tt h er e c o n s t r u c t e dn a ds a l v a g ep a t h w a yc o u l ds i g n i f i c a n t l y i n c r e a s et h eb i o s y n t h e s i so fn a da n de n h a n c et h ec e l l u l a ra n t i o x i d a n ta c t i v i t y i t i n d i c a t e dt h a tp b e fc a ni m p r o v et h ec e l l u l a ra n t i o x i d a n ta c t i v i t yb yr e g u l a t i o no ft h e n a d b i o s y n t h e s i sa n dt h en a m p r t a s e - l i k ea c t i v i t yo ft h i sc y t o k i n ei sf u n c t i o n a l l y c o n s e r v e dt h r o u g he v o l u t i o n s ot h ea n t i o x i d a n tf u n c t i o no fn k e fa n dp b e fw e r ea l lr e l a t e dt ot h e b i o s y n t h e s i so fn a d t r a n s f o r m i n gt h et n p b e fg e n ei n t ot h ec e l l sc a ns i g n i f i c a n t l y i n c r e a s et h ec e l l u l a rn a da n dn a d pc o n c e n t r a t i o n s ，w h i c hc a l lp r o v i d em o r e r e d u c i n gp o w e rf o r t h ep e r o x i d a s ea c t i v i t yo fn k e es u c hn o v e la n t i o x i d a n tp a t h w a y n e a r l ye x i s t e d i nv e r t e b r a t ea n dp o s s e s s e dc e r t a i nt h e o r e t i c a l s i g n i f i c a n c ea n d a p p l i c a b l ev a l u e k e y w o r d s ：f i s h ，n k e f , p b e f , a n t i o x i d a n t ，p n c ，n a d ，n a m p r t a s e i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝至三盘鲎或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：喜彳节仁签字日期：么栌罗年月易日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 躲磊 名： 签字日期：加分年6 月油e l签字吼埘年乡月艏 致谢 本论文是在导师邵健忠教授和项黎新副教授的悉心指导下完成的。导师渊博 的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严 以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。 不仅让我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究思路，还使我明白了许多待 人接物与为人处世的道理本论文从选题到完成，每一步都是在导师的悉心指导 下完成的，这期间导师倾注了大量的心血和精力。在此，谨向导师表示最崇高的 敬意和衷心的感谢! 在这五年的学习中，我得到了金红建、孟真、冯碧、潘雪霞、刘欣梅、周庆 军、黄洪敏、杨再峰、胡若真、林慧芳、洪旭涛、方玮、温轶、陈烨、王惠菊、 陈颖、陈小永、黄伟、赵晴潇、彭博、胡瑜兰、武小媛、郦佳慧、黄艳丹、吴俊 平、肖永陶、巩永凤、施科云、金阳、林爱福、张瑞鹏、潘若浪、王渠龙、潘萍 萍、王皓、张晓蕾、赵晶、潘新民等师兄弟的关心和帮助，在此我向他们表示深 深的感谢，同窗之间的友谊长存。 本论文的顺利完成还离不开其他老师、同学和朋友的关心和帮助。在此感谢 张继、王勇老师的指导和帮助；感谢绍兴人民医院的孙荷和张惠的指导和帮助。 在这里，我要由衷感谢我的爱人，她五年如一日的默默又坚定的支持让我能 完全静下心来从事科学研究，她为我的求学提供了强大的后勤保障! 同时，我要 衷心感谢我的家人，感谢他们在这五年中给予我莫大的鼓励和永恒的支持。 最后，向在这过去五年中所有给予我关爱和帮助的人致以深深的谢意! 没有 你们的支持、帮助和鼓励，论文就难以完成此外，由于本人学识有限，加之时 间仓促，文中难免有欠妥之处，敬请指正。 第一部分文献综述 一、r o s 与p r x 抗氧化家族的研究现状与进展 1 9 5 4 年g e r s h m a n 发现还原形式的氧会对生物体产生危害【l 】，随着研究的不 断深入，1 9 5 6 年h a r m a n 提出了自由基理论【2 】，人们才开始认识到氧及其衍生产 物对机体的危害性，如能加速生物体衰老原子或分子轨道上存在一个及一个以 上未成对电子的分子或者分子基团称为自由基【3 】。其中由氧衍生而来的活性氧族 是机体内最主要的自由基类别【4 】。 ( 一) r o s 的定义与种类 广义的活性氧族( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 指化学性质活跃的含氧原子或 原子团，包括氧离子、自由基及无机和有机的过氧化物【5 】。狭义的r o s 指不同 还原状态的含氧分子，最常见的如超氧阴离子。0 2 。、羟基自由基。o h 和过氧化氢 h 2 0 2 。r o s 一般都是小分子，由于它们均具有未饱和电子层，因此反应活性很高。 ( 二) r o s 产生途径 r o s 是氧在机体正常代谢过程中的副产物，细胞器( 如线粒体) 不仅能产生 r o s 而且也能将其释放到胞质中【6 】。线粒体在氧化磷酸化过程中将细胞的能量转 换成三磷酸腺苷( a t p ) ，在该过程中质子通过电子传递链穿越线粒体内膜。在电子 传递过程中，电子在通过一系列还原电势逐渐升高的蛋白质后终将电子传递给氧 分子通常氧气被还原成水，但在约o 1 3 的电子在穿过电子传递链时，氧被过 早及未完全的还原为超氧阴离子【3 ，7 1 0 】超氧阴离子自身活性并不是很强，但 其过氧羟基h 0 2 形式可以使特定的酶失活或引起脂质过氧化。线粒体产生的超氧 阴离子一半由线粒体内存在的m n s o d 催化成过氧化氢，另外一半则从线粒体释 放到胞质中【l o ，最后由胞质内的c u 、z n s o d 还原成过氧化氢。除了线粒体内 电子传递过程能产生超氧阴离子外，胞内还存在多个酶能将氧分子催化成超氧阴 离子，见图1 ，如n a d h n a d p h 氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脂肪氧化酶、环氧化 酶和细胞色素p 4 5 0 单加氧酶等 1 1 1 。 在正常生理条件下，过氧化氢的产生除了有超氧阴离子经s o d 歧化生成外， 过氧化物酶体也是过氧化氢重要的产生场所【9 】。此外，许多非吞噬细胞在外源性 因子如神经递质、肽类生长因子、激素等作用下也能产生h 2 0 2 由于胞内离子受到严格的离子调控，因此在正常生理条件下胞内不存在自由 离子然而，在氧化胁迫条件、过量的超氧阴离子会引起胞内f e 2 + 的释放 1 2 1 ， 释放的f e 2 + 与胞内过氧化氢进行f e n t o n 反应( f e 2 + + h 2 0 2 - - - * f e 3 + + o h + o h - ) 从而生 成羟基自由基【1 3 ，1 4 】，羟基自由基其在体内的半衰期虽然只有1 0 - 9 s ，但它具有非 常强的反应活性【1 5 】，一旦生成，羟基自由基马上与附近的基团反应。此外，超 氧阴离子通过h a b e r - w e i s s 反应( 0 2 - 4 - h 2 0 2 一0 2 + o h + o h ) 也能生成羟基自由基 此外，在一些重金属( 铜、镉、铅和锌等) 、环境胁迫( 如电离辐射) 或在受到创 伤和应激条件下机体内r o s 水平也能显著性升高，积累到相当程度后会对机体产 生氧化胁迫，从而对细胞及机体产生极大的危害，会通过损伤细胞功能从而引发 众多疾病和加速衰老的发生 s o d c a t , g p x ll 0 2 一q h 2 0 2 一h 2 0 l 王i 霎 h 0 2 o h f i g 1 t h er e a c t i v eo x y g e ns y s t e m ( 三) r o s 的功能 目前人们r o s 对细胞代谢的影响已经研究得比较透彻。由于r o s 是自然存 在的氧化物，研究显示，低浓度的r o s 在胞内信号传导和调控上发挥积极的作用 1 1 6 ，它能调控多种通路蛋白如转录因子、磷脂酶，蛋白激酶、磷酸酶、离子通 道和g 蛋白等蛋白的活性或功能，从而发挥重要的第二信使功g g 1 7 ，1 8 。r o s 能诱导众多基因的转录- 9 表达 1 8 1 ，如宿主防御基因。r o s 还能调控胞内c a 2 + 浓 度和特定的转录因子如n f r , b 和a p 1 家族因子【1 9 】。此外，r o s 可能与细胞的 定向迁移有关，如血小板在伤e l 修复时会释放r o s 来招募更多的血小板到伤口处 参与修复。有学者认为，免疫系统对白细胞的招募可能也与r o s 相关 而在高浓度的情况下，r o s 对细胞会产生危害效应，如果线粒体内被r o s 过度损伤将引起细胞凋亡它会攻击细胞内核酸、脂质和蛋白等生物大分子【5 】， 主要体现在： 2 l 、引起d n a 的损伤。有学者预计一个哺乳细胞每天要受到高达1 5 1 0 5 次 的r o s 的攻击1 2 0 1 。如羟基自由基能攻击所有的d n a 分子上的嘌呤和嘧啶碱基 及脱氧核糖骨架【3 】。氧化损伤会对遗传信息造成永久性伤害，是引起突变、肿瘤 形成和衰老的前奏。到目前为止人们已发现有超过1 0 0 种d n a 被氧化后的产物。 r o s 会引起单链或双链d n a 产生缺1 2 ；引起嘌呤、嘧啶或脱氧核糖的修饰和d n a 的交联等效应。d n a 损伤还能引起转录的停止或开始、诱导信号传导、复制错误 的产生及基因组的不稳定。 2 、氧化脂类的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用除了攻击d n a 外，r o s 同样能攻击对氧化敏感的磷脂不饱和脂肪e f 2 q ，最终生成丙二醛( m d a ) 2 2 而 m d a 在细菌和哺乳动物中已被证实是一种诱变剂，在大鼠中还被证明是致癌物 【1 0 3 、氧化蛋白质上的氨基酸残基，引起蛋白变性。利用离子辐射产生的羟基 自由基或超氧阴离子作为氧化物，将氨基酸、简单的多肽或蛋白质作为受试对象， 从而研究r o s 对蛋白的氧化影响及其机制。研究表明，在所有的氨基酸残基支链 中，半胱氨酸和甲硫氨酸对r o s 的氧化最敏感 2 3 1 ，氧化后的半胱氨酸能与其他 含巯基蛋白或者含巯基的小分子( 如g s h ) 形成可逆性的二硫键而胞内酶受到 r o s 攻击后会引起空间构象的改变，从而引起酶的失活。 此外，r o s 还能氧化辅酶从而使相应的特异性酶失活；刺激单核白血球及巨 嗜细胞的异常反应，引起炎症反应；攻击人体的牙周组织，分解破骨细胞和骨界 面的骨基质；损伤心脏等器官及血管，引起心血管疾病；加速机体衰老等 ( 四) r o s 的消除抗氧化剂 正是由于r o s 潜在地会对细胞及机体造成巨大的伤害，因此，为了维持细胞 的正常功能和机体的相对稳态，机体内必须需要有合适数量及浓度的抗氧化剂( 包 括抗氧化物酶和非酶系小分子抗氧化剂) 来消除胞内过量的r o s ，从而维持胞内 氧化还原状态的稳定，确保正常的生理功能。细胞内高效的抗氧化物酶主要包括 超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽氧化酶【2 4 】。细胞内的其他小分子抗氧 化剂包括抗坏血酸( 维生素c ) 、维生素e ，类胡萝卜素、天然黄酮类化合物，褪 黑激素、尿酸、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、类脂酸等物质，它们在细胞的抗氧化过 程中发挥着重要作用【2 5 2 7 s o d 是一类高效的抗氧化物酶，它能将超氧阴离子催化成氧分子和反应活性 较低的过氧化氢( 0 2 + 。0 2 。+ 2 n h 2 0 2 + 0 2 ) 2 4 按活性金属中心，亚基数量、 辅酶及其它属性人们将人s o d 分为三类：第一类为定位在线粒体内的b i n s o d ， 该s o d 酶基因定位在2 1 号染色体，其转录产物具有线粒体定位序列；第二类为 存在于胞质的c u 、z n s o d ，其编码基因分别存在于6 和4 号染色体；第三类为 胞外的s o d 2 8 。 由于过氧化氢极易通过f c n t o n 反应转变成破坏性极大的羟基自由基，因此生 物体需要过氧化氢酶( c a t ) 来催化降解过氧化氢。c a t 存在于过氧化物酶体中， 它能高效地将过氧化氢催化生成水和氧气此外，含硒或不含硒的谷胱甘肽过氧 化物酶( g p x ) 能利用胞内丰富的g s h 作为还原力的供体将过氧化氢还原为水。 g p x 与c a t 对h 2 0 2 的竞争性结合避免细胞遭受氧化胁迫。 上述这些抗氧化酶及抗氧化小分子在保护细胞免受氧化胁迫的过程中发挥了 至关重要的作用除了上述抗氧化酶外，1 9 8 8 年有学者在酵母中纯化到一种分子 量为2 5 k d a 的巯基特异性抗氧化酶( t s a ) ，该酶能保护谷胱甘肽合成酶免受氧化 剂引起的氧化失活，而小分子抗氧化物维生素c 则不具备这个保护功能【2 9 】。之 后，人们在不同的物种( 包括原核生物和真核生物) 中陆续鉴定到了这类新的抗氧 化酶家族，这个抗氧化物酶家族在蛋白序列、催化活性及抗氧化机制上与s o d ， c a t 及g p x 完全不同。1 9 9 4 年c h a e 等人将之命名为过氧化物氧还蛋白 ( p e r o x i r e d o x i n ，p r x ) 2 9 3 2 。序列、功能及其机制研究显示这些酶在蛋白n 端均 具有一个保守的具有催化活性的c y s 位点，在与过氧化物反应时c y s 会被氧化成 中间产物次磺酸化的c y s ( c y s s o h ) 3 3 ，而后c y s s o h 与自身或相邻蛋白上 的巯基反应形成分子内间的二硫键和水，从而改变胞内的氧化还原状态并影响相 应蛋白的功能。 到目前为止，在哺乳动物中已经鉴定到六种不同的p r x 基因，分别为 p r x l p r x v i 3 4 ，3 5 。这些基因的产物具有高度的氨基酸序列同源性和普遍的过氧 化物酶活陛( p e r o x i d a s ea c t i v i t y ) ，其中过氧化物酶活性依赖于还原形式的硫氧还蛋 白( t ) 或谷胱甘肽( g s h ) 。研究中学者发现，除了过氧化物酶活性外，p r x 家族成 员还发挥了其他众多的功能【3 6 】。本综述简要地介绍了哺乳动物p r x 家族的结构 和功能的研究现状与进展。 4 ( 五) p r x 家族成员的分类及属性 表1 和图2 显示了p r x 家族成员的同义词、结构及各自特性与g p x 家族成 员在功能位点具有一个催化活性的硒代半胱氨酸类似，哺乳动物p r x 家族的6 个 成员( p r x l 、p r x l i 、p r x l l i 、p r x w 、p r x v 和p r x v i ) 在蛋白近n 端均具有一个保守 的活性c y s 位点，部分成员在蛋白c 端还具有一个保守c y s 位点根据其保守 c y s 的数目，p r x 家族可分为2 个亚家族，即1 - c y sp r x 和2 - c y sp r x 其中前者仅 在5 2 位上有一个高度保守的c y s ，而后者在5 2 位和1 7 2 位上均有一个高度保守 的c y s 残基【3 7 1 。利用p r x i p r x w 在c 端具有的两个保守位点的特点，在这两个 保守的c y s 附近设计p c r 引物则能扩增到大鼠的p r x i p r x l v 3 8 。而p d 【v 和p r x v i 则不能通过这个方法获得，其主要原因这两个蛋白的c 端序列差异较大。通过对 p r x v 分析后可知，p r x v 同样也具有一个额外的c y s ，且这个c y s 对p e r o x i d a s e 活性是必需的，但和p r x i p r x w 相比，这个功能c y s 更接近同源性较差的c 端区 域 3 4 ，3 5 1 。然而，p r x v i 却只在n 端区域有一活性c y s 位f 1 , 3 9 1 。因此，p r x v i 属于1 - c y sp r x ，而其他成( p r x i - p r x v ) 属于2 - c y sp r x 4 0 若根据各个成员间同 源性和保守c y s 的不同则可分为3 个亚型：典型的2 - c y sp r x ( i i v ) 、非典型的2 - c y s p r x ( v ) 和1 - c y sp r x ( v i ) 。 p r x 家族的六个成员在细胞定位上有所不同，p r x i 和p r x l i 定位与细胞质中； p r x l i i 定位在线粒体【4 l 】；p r x i v 的n 端具有信号肽，因此存在于胞外基质和内质 网中 4 2 】；p d 【v 存在于细胞质，过氧化物酶体和线粒体中【3 5 】；p v i 存在与胞质 与血浆中【4 3 。研究显示，这些成员在r o s 的产生部位都普遍存在，该情况与s o d 及g p x 非常相似。而p r x 家族的一些成员其分布更加广范，且受外界刺激后其蛋 白分布会易位，这种情况类似t r x 4 4 此外，细胞内p r x 家族成员的氧化还原状 态在过氧化氢或百草枯处理后会发生改变【4 5 ，4 6 。 p r x i ，p r x l i ，p r x v 和p r x v i 的晶体结构分析显示，p r x i 和p r x l l 的蛋白序列 虽然与p d 【v 及p r x v i 同源性不高，但其三维结构却非常相似。更有意思的是， 含硒g p x 的三维结构与上述四个蛋白的三维结构的相似度同样很高【4 7 5 1 ，集 中体现在它们都具有t r x 1 i k e 的结构域。由于p r x i p 其同源性较高，因此p r x l i l 和p r x i v 虽然没有晶体衍射分析，但它们应同样具有t r x 1 i k e 结构域。此外，p r x v i 的结构分析显示其活性位点上的c y s 会形成次磺酸。 p r x 家族蛋白的普遍功能是具有过氧化物酶( p e r o x i d a s e ) 活性，印从还原态蛋 中p r x i 表达显著增强【5 2 】；乳腺癌组织中p r x i 、p r x l i 和p r x l l l 表达增高【5 3 】；在 间皮瘤病人中p r x i 、i i 、i l l 、v 和v i 表达显著升高【5 4 】；将大鼠暴露于肝脏的致 癌物质n 一亚硝基吗啉后，也发现p r x i l 的表达提高【5 5 】；结肠癌细胞系h c t - 1 1 6 中，p r x l l 和i v 的表达也增i g i 5 6 1 ，均提示了p r x 可能与肿瘤的发生有关 厂ip l 匕童= = = 玲删嘴蛳 ， 2 t y 邻p i c a l 一。q f 号删唧龋 嚣 m s 旧【j = = 卸一咄撕 1 p i v 瓯= f = = = 户勰嘴细 j 帮。刚【芒= 舀辫一一 p r x s s t t 。 1 - c y sp r x p 仪v i 亡j = = = = 了删d a s m e 揣 嗍 6 ( 六) p r x 家族成员发挥p e r o x i d a s e 活性的机制比较 通常而言，蛋白质上的巯基是r o s 的作用位点，而巯基对r o s 的高敏感性 通常在正常生理或氧化刺激下氧化还原信号在细胞内的转导过程中发挥作用。 p r x 的所有成员都具有保护谷氨酸合成酶免受氧化胁迫所引起的失活。p r x 家 族成员在发挥该功能时与过氧化氢表现出高亲和( 2 0 u m ) 5 8 。最初的报导显示 该功能是t r x 依赖性，而后来的研究表明g s h 同样也能作为电子供体【4 3 ，5 8 】。 由于g p x 也同样利用t r x 作为电子供体，因此p r x 与g p x 共享了t r x t r x r 和 g s h g s s g 还原系统。 图3 示意了每个p r x 成员可能的反应机制，机制总体上非常相似，但仍存在 一些细微差别2 - c y s 的p r x ( p r x i p r x l v ) 形成头尾状( h e a d t o - t a i l ) l 均同二聚体，在 发挥抗氧化作用时，其一条肽链上的活性位点c y s 被过氧化物氧化成c y s 次磺酸， 而次磺酸为反应的中间产物，它能与另一肽链c 端的c y s 反应脱氢后形成分子间 二硫键和水，从而还原过氧化氢，而后依靠含巯基分子( 如t r x ) 为供氢体将n a d p h 的质子转移给氧化型p r x ，使其恢复原来的单体结构和功能，从而完成催化循环 5 9 ，因此，2 - c y sp r x 的还原能力最终来源自n a d p h 。 p d 【v 和p r x v i 以单体为存在形式，在进化上被认为与p r x i p r x l v 差距较远。 p v 的n 端具有保守的c y s 残基，但c 端的c y s 更接近同源性较差的羧基端。 在与过氧化物反应时，n 端c y s 同样被氧化成次磺酸，然而，形成的次磺酸和自 身蛋白的c 端c y s 上的巯基反应，从而形成了分子内的二硫键。随后，氧化状态 的p r x v 即被t r x 还原，从而完成了循环。 p r x v i 的情况较为特殊，那是因为它只在n 端有一个c y s 它最初在牛眼睛 中被发现，功能实验显示其具有不含硒属性的谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 活性 【6 0 虽然p r x v l 只具有一个c y s 残基，但有意思的是，p r x v i 并不能形成同型二 聚体，它与其他含巯基化合物形成异二聚体，但目前对其电子供体的类型尚存在 争议 6 1 ，6 2 。目前p r x v i 较为公认的电子供体为g s h ，但也有学者提出e y e l o p h i l i n a 也可能是p r x v i 潜在的电子供体【6 3 】。 7 p r i i v p r xv p v l n s s g s s g t 限 s 再妇 2 g s h 丁嘎 s hs h r s 刚 ，h s s f i g4 p r o p o s e dm e c h a n i s m sf o rt h ep e r o x i d a s er e a c t i o no fi n d i v i d u a li s o f o r m s s h ， s o h ，a n ds - si n d i c a t es u l f h y d r y l ，s u l f e n i ca c i da n dd i s u l f i d er e s i d u e so ft h ep r o t e i n s ， r e s p e c t i v e l y na n dcr e p r e s e n tn - a n dc - t e r m i n a lo ft h em o l e c u l e ，r e s p e c t i v e l y s h r - s hi n d i c a t e sd i t h i o lc o m p o u n d ss u c ha st r x x hm e a n sa nu n k n o w ne l e c t r o n d o n o r t h er e a c t i o ns c h e m e sw e r ea d o p t e df r o mr e f e r e n c e 【5 7 ( 七) p r x 家族成员的基因功能及属性 除p e r o x i d a s e 酶活性外，p r x 的成员还具有其他不同的细胞功能及属性特征。 1 、p r x l 和p r x l l 由于p r x i 与p r x l l 同源性非常高( 人的p r x l 与p r x l i 一致性高达8 8 ) ，而且两 者基因结构相同，都由6 个外显子和5 个内含子组成，且其外显子与内含子的界 限相似 6 4 ，6 5 1 ，因此有学者推测两个基因可能来自同一个祖先基因，通过基因复 制后演化而来。由于p r x i 和p r x l i 在大多数组织中的表达都很高，这引起人们的 普遍重视，并由此开展了许多比较两者功能异同的研究【3 6 】。 8 除p e r o x i d a s e 酶活性外，p r x l 还参与众多的功能：1 、与增殖分化有关。p r x i 也被称为增殖相关蛋i 兰i ( p r o l i f e r a t i o na s s o c i a t e dp r o t e i n ，p a g ) ，在血清刺激下，人 乳腺上皮细胞系h b l l 0 0 细胞内p a g 的表达升高，在早幼粒细胞白血病h l 6 0 细 胞被诱导分化时，细胞增殖停止，而该基因的表达也相应降低【6 6 】。此外p r x i 蛋 白也被称为造骨细胞特异因子( o s t e o b l a s ts p e c i f i cf a c t o r , o s f 2 3 ) ，它能促进骨细胞 的增殖，提示p r x i 与细胞的增殖分化密切相关2 、具有结合血红素的功能，其 结合能力强于其他的已知蛋白，但具体的机制不详【4 7 】。3 、具有结合a b ls h 3 结构域的功能，因此p r x i 是c a b l 酪氨酸激酶的抑制剂【6 7 】。4 、具有能增强n k 细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，并被命名为自然杀伤细胞增强因子( n a t u r a l k i l l e r c e l l e n h a n c i n gf a c t o ra ，n k e f - a ) 【6 8 。5 、其表达受外界胁迫影响。过氧化氢能诱导 小鼠巨噬细胞p r x i 表达的升高；小鼠经全身辐射后，受损的小肠上皮细胞中p r x i 含量出现代偿性增加，且该基因的表达也增强，表明该蛋白与辐射损伤后的修复 密切相关；p r x i 和p r x l i 在大鼠甲状腺细胞f r l t - 5 内组成性表达，但在促甲状腺 激素( t s h ) 和h 2 0 2 作用下，仅p r x i 能被诱导表达上调，而p r x l i 则不能【6 9 】。6 、 具有抗氧化及自由基清除功能，能增强细胞和机体对外界胁迫的抵抗能力在 f r l t - 5 过表达p r x i 能增强消除因t s h 引起的h 2 0 2 的能力，可能在保护甲状腺 细胞免受t s h 引起的h 2 0 2 的伤害中发挥重要的作用 6 9 】；将p r x i 和p r x l l 转染大 鼠淋巴细胞w e h t 7 2 后均可以抑制h 2 0 2 诱导的细胞凋亡，且p r x l i 消除h 2 0 2 的能力比含硒g p x 要强【7 0 】；将p r x l 和i i 转染入n i h 3 t 3 后也能增强细胞抵抗氧 化# j ( t - b u t y h y d r o p e r o x i d e ) i 起的细胞凋亡，暗示p r x 家族在提高器官移植成功率 上发挥重要的功能 7 l 】；转染p r x i 的细胞能降低过氧化氢诱导引起的凋亡率【3 9 】。 7 、具有稳定染色体的功能，而p r x l i 则不具备【7 2 】。8 、参与细胞的信号转导( 见 p r x l l 部分) 。 p r x l i 通常又被称为t h i 0 1 s p e c i f i ca n t i o x i d a n t ( t s a ) ，也被命名为n a t u r a lk i l l e r e n h a n c i n gf a c t o rbt n k e f b ) ，但不具有增强n k 细胞毒效应的能力【3 6 。蛋白序 列分析p r x i i 与t o r i n b a n d 8 的序列完全相同，而后者是一个十聚体蛋白【7 3 ，后期 研究显示p r x l i 既可以形成二聚体，也可以形成十聚体。p r x l l 的功能包括：1 、具 有抗氧化及自由基清除功能，能增强细胞和机体对外界胁迫的抵抗能力p r x l i 蛋白能将过氧化氢还原成水，它在氧化应激条件下表达上调，以清除胞内过多的 9 r o s ；p r x l i 能增强细胞对e i s p l a t i n ( 一种抗癌药) 的抗性 7 4 】；p r x i i 具有抗凋亡作 用，且其抗凋亡机制不同于b c l 2 1 7 5 1 ；电离辐射可以使细胞产生大量的自由基， 破坏细胞内大分子结构，最终导致细胞凋亡或坏死，而向u m s c c 。i l a 细胞内转 染p r x l i 基因则可以部分抑制电离辐射引起的细胞凋亡，而通过反义核酸技术抑 制该基因的表达则可增强辐射诱导的细胞凋亡，提示p r x l i 的反义核酸可以作为 辐射增敏剂【7 6 1 ，可用于肿瘤的放射治疗；在p r x l i 转染的白血病细胞系m o l t - 4 中，血清饥饿、神经酰胺和依托泊甙诱导的细胞凋亡也被明显抑制，线粒体细胞 色素c 的释放也被抑制【7 5 】；p r x i i 缺陷的小鼠虽然可以正常发育，但其外周血中 可以检测到海因茨小体，红细胞生成素增多，红细胞中异常形态细胞数量增加， r o s 含量也增加【7 7 】，这从反面也证实了该基因的抗氧化作用；此外，在甲状腺 细胞系f r t l 5 中，甲状腺激素可以诱导产生过氧化氢，从而导致细胞凋亡，但 p r x l i 的高表达可以减轻这种凋亡【6 9 】。2 、其表达受外界因素影响。过氧化氢能 诱导小鼠巨噬细胞p r x l i 表达的升高；且在大鼠睾丸中，p r x l i 的表达和p r x i 一样， 也受到辐射的诱导升高，为辐射敏感基因。u l t r a v i o l e tb ( u v b ) 能强烈地诱导大鼠 皮肤p r x l i 基因的表达 7 8 1 。3 、参- 9 细胞的增殖、分化与凋亡。研究表明，p r x l i 缺陷小鼠的胚胎成胶原细胞的细胞周期大多停留在g 2 m 期，且m e f 的凋亡加速 【7 9 】；p r x l l 缺陷的小鼠可以正常发育成熟，但其胸腺与野生型小鼠相比明显增大， 这种增大是由于胸腺细胞的数量增多引起的，并且胸腺中s p 与d p 的比例也低于 野生型小g 8 0 ，表明p r x l i 基因与细胞的增殖和分化密切相关4 、参与细胞的 信号转导。过氧化氢作为胞内的第二信使，其在真核细胞内的浓度受到严格调控。 作为胞内信号分子，它可以与信号通路中的蛋白质的巯基反应，使之活化或失活， 从而参与信号传导【8 1 】。p i i 及其家族成员均可以调控过氧化氢水平，研究显示， 胞内p r x i 和i i 的瞬间高表达可以清除由生长因子诱导产生的过氧化氢，且由过氧 化氢和t n f a 诱导的n f r , b 的活化也可被高表达的p r x l i 抑制，表明p r x i 和p r x l i 可以通过调节细胞内过氧化氢的浓度来参与生长因子和n f r , b 的信号传导级联 反应【6 1 】。c h o e 等研究发现，p r x l i 是血小板源性生长因子( p d g f ) 介导信号通路 的调节因子，p d g f 通过h 2 0 2 的浓度高低来使多种信号分子的酪氨酸残基磷酸 化，从而使之失活或活化。p r x l i 基因缺陷会导致体内p d g f 介导的生理功能如细 胞的增殖、迁移等能力增强 8 2 1 。 1 0 2 ，p r x i i i p r x l l l 定位在线粒体中，它在内质网中合成后经过线粒体定位信号而转运至 线粒体【4 1 】。p r x l i i 也称m e r 5 、s p - 2 2 和a o p 1 ，由鼠红白血病细胞系m e l 中 克隆到，研究提示该基因与m e l 细胞的早期分化事件相关 8 3 1 。p r x i i i 在线粒体内 受到a t p 依赖性蛋白酶的调控，是该蛋白酶的敏感型底物。c y c l o p h i l i n1 8 和p r x l i i 结合并激活该酶【8 4 】。然而由