（食品科学专业论文）自然发酵黄豆酱中主要微生物酶系的形成及作用.pdf

摘要 豆酱是我国传统发酵的豆制品。一直是人们的佐餐佳品。传统豆酱是通过天然接菌，自 然发酵3 4 个月而形成的，微生物及其酶系在酱曲培养和酱醪发酵中发挥了重要作用。酱曲 中鉴定出的主要微生物是真菌，如米曲霉、酱油曲霉等，这些霉菌能够利用淀粉、多糖、单 糖、有机酸、乙醇等作为碳源，以及蛋白质、氨基酸、尿素等作为氮源，同时霉菌的生长代 谢能够分泌多种酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪水解酶和其他的酶类。在酱醪发酵过程中， 微生物酶能够分解蛋白质、淀粉和脂肪，形成小分子汜合物，例如氨基酸、有机酸和其他的 小分子有机化合物。这些化合物赋予豆酱特殊的风味以及丰富的营养，同时嗜盐酵母、乳酸 菌在豆酱发酵过程中对风味的形成也起到了重要作用。 在酱曲培养阶段微生物酶系与大豆成分中的大分子化合物之间，发生了非常复杂的相互 作用，通过微生物酶系( 蛋白质、淀粉、脂肪水解酶、多酚氧化酶、乙醇脱氢酶等) 的作用， 形成了豆酱特有风味、营养和质地。本课题以典型的传统发酵黄豆酱为对象，研究酱曲培养 和酱醪发酵过程中微生物酶的活力及相应酶解产物的变化关系。 在整个酱曲培养过程中，p h 和水分含量发生了显著变化( p o 0 5 ) 。酱曲外部p h 在l 2 0 天由6 ，8 8 降至5 2 4 ，然后在2 0 - 4 5 天由5 2 4 升至7 0 4 ；酱曲内部p h 在1 2 5 天由6 8 7 降至 5 7 6 ，然后在2 5 - - 4 5 天由5 7 6 升至6 4 8 。酱醪发酵过程中p h 在l 一1 5 天发生了显著变化，由 6 9 1 降至5 4 9 ，然后变化不明显，酱曲外部水分含量由3 8 5 9 降至2 1 1 0 9 ，酱曲内部水分 由3 8 8 0 降至3 0 4 6 。 在酱曲培养过程中，蛋白酶活力逐渐上升，在第3 0 天酶活力达至最高，中性蛋白酶在酱 曲培养过程中是主要的蛋白酶，酶活力增幅显著( p ( 0 0 5 ) 。而酱醪发酵过程中，酶活力逐渐 下降，中性蛋白酶仍然是整个发酵过程中的主要蛋白酶。在整个豆酱发酵过程中，相应的蛋 白质分解物n s i 、n p n 、氨基氮和多肽氮含量逐渐上升，最终分别达到6 9 0 7 、4 2 0 7 、3 7 3 和3 8 3 4 。 a 淀粉酶，糖化酶和纤维素酶活力在整个酱曲培养过程中发生了不同的变化，酱曲外部 o 淀粉酶活力1 ，2 0 天显著上升( p ( o 0 5 ) ，然而酱曲内部1 2 5 天酶活力显著上升( p o 0 5 ) 。 酱曲外部糖化酶活力l 2 5 天显著上升( p 0 0 5 ) ，而内部l 3 0 天显著上升( p 0 0 5 ) ；酱曲 外部纤维素酶活力1 1 5 天显著上升( p o 0 5 ) ，而内部1 - 2 5 天显著上升( p 固0 5 ) ，然后三 种酶活力在酱曲培养后期逐渐下降。酱醪发酵过程中，三种酶活力都显著下降( p 0 0 5 ) ，在 整个豆酱发酵过程中纤维素和总糖逐渐下降，还原糖逐渐上升，最终产品的纤维素、总糖和 还原糖分别达到3 6 3 、1 4 3 3 , 3 1 14 8 4 。 酱曲外部脂肪水解酶活力1 - 2 5 天显著上升( p o 0 5 ) ，然后逐渐下降，酱曲内部脂肪水 解酶活力在整个酱曲培养过程中持续上升。在酱醪发酵过程中脂肪水解酶活力显著下降 ( 口 o 0 5 ) 。在整个豆酱发酵过程中，相应的脂肪分解星上升趋势，最终产品中游离脂肪酸含 量为5 2 6 ( 占脂肪) 。 多酚氧化酶活力前1 0 天发生了显著变化( p o 0 5 ) ，酱曲外部酶活力上升较快，然后第 1 5 4 5 天开始下降，内部变化趋势与外部一致。在酱醪发酵过程中多酚氧化酶活力显著下降 ( p o 0 5 ) 。酱色主要在酱曲培养阶段形成的，前1 0 天多酚氧化酶对酱色起主要作用，两后 多酚氧化酶活力逐渐下降，酱色由m a i l l a n d 反应形成，最终产品的酱色o d ( 4 2 0 n m ) 值为 0 9 7 。 酱曲培养阶段a d h 和l d h 酶活力不断上升；酱醪发酵过程中a d h 活力前1 0 天逐渐上 升，第1 5 - - , 3 5 天显著下降( p 0 0 5 ) ，l d h 活力前l o 天先上升，第1 5 3 0 天下降。摄后5 天又上升。挥发性成分由s p m e - g c - m s 检测，结果表明乙醇随着a d h 活力的升高而增加， 乳酸与l d h 活力呈正相关，乙酸的形成晚于二者。最终产品的乙醇、乳酸和乙酸含量分别 达到3 6 3 、1 4 3 3 和4 8 4 。 整个发酵过程中，酯化酶活力一直较高。酱曲培养阶段酶活力显著上升( p o 0 5 ) ，酱 醪发酵阶段逐渐下降。酱醪发酵后期仍有4 3 8 u g ( 干基) 酯化酶活力存活，所以推知继续后 发酵可以增加酯类含量，提高风味。最终产品的总酯可达o 2 4 。 关键词：黄豆酱；蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶：多酚氧化酶；a d h 和l d h ；挥发性化合物 g c - m s t h ef o r m a t i o na n df u n c t i o no f m a i n l ym i c r o b i a l e n z y m e si nn a t u r a l l yf e r m e n t e ds o y b e a n p a s t e a b s t r a c t s o y b c a np a s t ei so n eo ft h em o s tt y p i c a lk i n d so ft r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o di nc h i n xi tw a s u s e d c o n d i m e n ti nd a i l yl i f e t r a d i t i o n a ls o y b e a np a s t ei sn a t u r a l l yi n c u b a t e da n df e r m e n t e x l a b o u t3 - 4 m o n t h s m i c r o o r g a n i s ma n dt h e i rr e l a t i v em i c r o b i o l o g i c a le n z y m e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l e i nk o j ii n c u b a t i o na n dt h ep a s t ef e r m e n t a t i o n t h em i c r o o r g a n i s m sf o u n di nk o j ia l m o s ta l w a y s b e l o n gt of u n g is p e c i e s ，a s p e r g i l l u ao r y z a ea n da s p s o f i a t h ek o j im o l dh a st h ea b i l i t yt ou t i l i z e s t a r c h ，o l i g o s a c e h a r i d e s ，s i m p l es u g a r s ，o r g a n i ca c i d sa n da l c o h o h ，e t ea sc a r b o ns o u r c e s ，a n d p r o t e i na m i n oa c i d sa n du r e a , e t ca sn i t r o g e ns o u r c e s a tt h es a m et i m et h ek o j im o l ds e c r e t em a n y k i n d s e n z y m e ss u c ha sp r o t e a s e ，l i p a s e ，a m y l a s ea n do t h e r s i nt h ef e r m e n t a t i o no f t h ep a s t e ，t h e m i c r o b i o l o g i c a le n z y m e sd e c o m p o s et h ep m t e i l l s t a r c ha n df a ti n t os m a l lm o l e c u l e sc o m p o u n d s ， s u c ha sa m i n oa c i d s , o r g a n i ca c i d s ，a n ds m a l lm o l e c u l e so r g a n i cc o m p o u n d s t h e s ec o m p o u n d s c o n t r i b u t et h ep a r t i c u l a rf a v o ra n dt h ea b u n d a n tn u h i t i o no fs o y b e a np a s t e h a l o p h i l i cy e a s ta n d l a c t i ca c i db a c t e r i a la l s op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nd e v e l o p i n gf l a v o n rd u r i n gf e r m e n t a t i o no f s o y b e a np a s t e i ti sav e r yc o m p l e xp r o c e s st h a tt h ei n t e r a c t i o nb 剖h v e e nm i c r o b i o l o g i c a le n z y m e sa n d m a c r o m o l e c u l a rd u r i n gt h ek o j ii n c u b a t i o na n dp a s t ef e , a n a n t a t i o n t h ef o r m a t i o no ft h ef l a v o n u t r i t i o na n dt e x t u r ei n v o l v e ds e v e r a lm i c r o b i o l o g i c a le n z y m e s ( p r o t e a s e ，l i p a s e ，p o l y p h e n o l o x i d a s e ，a m y l a s e ，a d h a n de t c ) i nt h i sp a p e r , b a s e do nat y p i c a lt r a d i t i o n a ln a t u r a lf e r m e n t e d s o y b e a np a s t ew ef o c u so nt h ef o r m i n ga n dc h a n g e so f m i c r o b i o l o g i c a le n z y m e sa n dt h e i rr e l a t i v e l y d e c o m p o s e da n dm e t a b o l i z e dc o m p o u n d sd u r i n gt h eb o j ii n c u b a t i o na n dt h ep a s t ef e r m e n t a t i o n d u r i n gt h ee n t i r ei n c u b a t i o no ft h ek o j i ，t h ep ha n dt h em o i s t u r ec o n t e n to ft h ek o j iw e f e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) t h ep ho f t h eo u t s i d ek o j iw a sd e c r e a s e df r o m6 8 8t o5 2 4i n1 0 0 d a y s a n dt h e nt h ep hw a si n c r e a s e df r o m5 2 4t o7 0 4i n2 0 - 4 5d a y t h ep ho f t h ei n s i d ek o j iw a s d e c r e a s e df r o m6 8 7t o5 7 6i n1 - 2 5d a y s a n dt h e nt h ep hw a si n c r e a s e df r o m5 7 6t o6 4 8 i n 2 5 - - 4 5d a y t h ep ho ft h ep a s t ew a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e df r o m6 9 1t o5 4 9 i n1 1 5d a y s ( p 0 0 5 ) ，a n dt h ep ho f t h ep a s t ew a sn o tc h a n g e d t h em o i s t u r ec o n t e n to f t h eo u t s i d ek o j iw a s d e c r e a s e df r o m3 8 5 9 t o2 1 0 9 ，a n dt h em o i s t u r ec o n t e n to f t h ei n s i d ek o j iw a sd e c r e a s e df r o m 3 8 8 0 t 03 0 4 6 d u r i n gt h ei n c u b a t i o no f t h eb o j i 。t h ep r o t e a s ea c t i v i t yw a sg r a d u a l l yi n c r e a s e da n dt h eh i g h e s t a c t i v i t yw a so b t a i n e da t3 0 md a y s a n dn e u t r a lp r o t e a s ew a sp r e d o m i n a n tp r o t e a s ea n di tw a s i s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dd u r i n gt h ei n c u b a t i o no f t h ek o j i ( p o 0 5 ) h o w e v e rt h ep r o t e a s ea c t i v i t y w a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o no f t h ep a s t e ( p 0 0 5 ) ，b u tt h en e u t r a lp r o t e a s e s t i l lw a sp r e d o m i n a n tp r o t e a s ei ne n t i r ef e r m e n t a t i o n c o n c e r n i n gt h ep r o t e o l y s i s , n s i ，n p n ， a m i n o p h e n o ln i t r o g e na n dp e p t i d e sc o n c e n t r a t i o nw e r eg r a d u a l l yi n c r e a s e da n dt h e yw e r e6 9 0 7 ， 4 2 0 7 3 7 3 a n d3 8 3 4 r e s p e c t i v e l ya tt h ee n do f f e r m e n t a t i o no f t h ep a s t e t h ea c t i v i t i e so fa - a m y l a s e ，g l u c o a m y l a s ea n dc e l l u l o s eh a v ed i f f e r e n tc h a n g i n gp e r i o d sd u r i n g e n t i r ei n c u b a t i o no f t h ek o j i t h en a m y l a s ea c t i v i t yo f t h eo u t s i d ek o j iw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d f r o m l 以0d a y s ( p o 0 5 ) ，a n d t h e a c t i v i t yo f t h e i n s i d e k o j i w a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d f r o m l - 2 5 d a y s ( p 0 0 5 ) t h eg l u c o a m y l a s ea c t i v i t yo f t h eo u t s i d ek o j iw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m1 2 5 c l a y s ( p 0 0 5 ) ，a n dt h ea c t i v i t yo ft h ei n s i d ek o j iw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m1 3 0d a y s ( p 0 0 5 ) t h ec e l l u l a s ea c t i v i t y o ft h eo u t s i d ek 面ia l s ow a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m l 一1 5 d a y s ( p 0 0 5 ) ，a n dt h ea c t i v i t yo f t h ei n s i d ek o j iw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m1 2 5d a y s ( p 0 0 5 ) t h e na l lt h r e ee n z y m e sa c t i v i t i e sw e r eg r a d u a l l yd e c r e a s e da tl a t e rk o j ii n c u b a t i o n h o w e v e r , t h ea c t i v i t i e so ft h et h r e ee n z y m e sw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n o f t h ep a s t e ( p 0 0 5 ) d u r i n ge n t i r ei n c u b a t i o no f t h ek o j ia n df e r m e n t a t i o no f p a s t e , t h ec e l l u l o s e a n dt o t a ls u g a rw e r eg r a d u a l l yd e c r e a s e d ，a n dt h er e d u c i n gs u g a rw a sg r a d u a l l yi n c r e a s e d i nt h e f e r m e n t e ds o y b e a np a s t e ，t h ec e l l u l o s e ，t o t a ls u g a ra n dr e d u c i n gs u g a rw e r e3 6 3 ，1 4 _ 3 a n d 4 8 4 r e s p e c t i v e l y t h el i p a s ea c t i v i t yo f o u t s i d ek o j iw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o ml 0 5d a y s ( p 0 0 5 ) a n d t h e nt h ea c t i v i t yw a sg r a d u a l l yd e c r e a s e di n l a t e rk o j ii r 4 u b a t i o n h o w e v e r , t h el i p a s ea c t i v i t yo f i n s i d ek o j iw a sc o n t i n u o u s l yi n c r e a s e di ne n t i r ek o j ii n c u b a t i o n t h el i p a s ea c t i v i t yw a s s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o no f t h ep a s t e ( p o 0 5 ) t h el i p o l y t i cc o m p o u n d s c o r r e s p o n d e dt h el i p a s ew e r ei n c r e a s e dd u r i n gt h ee n t i r ei n c u b a t i o no f t h ek o j ia n df c r m e n t a t i o no f t h ep a s t e i nt h ef e r m e n t e ds o y b e a np a s t e ，t h ef r e ef a t t ya c i d sc o n t e n th a da r r i v e d5 2 6 ( t o t a lf 砷 t h ep o l y p h e n o lo x i d a s ea c t i v i t yo f t h eo u t s i d ek o j iw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o m1 1 0d a y s ( p d 0 5 ) ，b u ti t sa c t i v i t yg r a d u a l l yd e c r e a s e df r o m1 5 4 5d a y s a n dt h ea c t i v i t yo f t h ei n s i d ek o j i w a sg r a d u a l l yi n c r e a s e df r o m1 1 0d a y , t h e nc o n t i n u o u s l yd e c r e a s e di ne n t i r ek o j ii n c u b a t i o n t h e p o l y p h e n o lo x i d a s ea c t i v i t y w a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o no ft h e p a s t e ( p o 0 5 ) t h ed a r kr e d d i s hb r o w nw a sm a i n l yf o r m e dd u r i n gt h ek o j ii n c u b a t i o n a tt h ef i r s t1 0 d a y s ，p o l y p h e n o lo x i d a s ep l a y e di m p o r t a n tr o l ei nd a r kr e d d i s hb r o w n ，m a i l l a n dr e a c t i o np l a y e d k e yr o l ei nt h ef o l l o w i n gt i m e ，f i n a l l yt h es o y b e a np a s t eb r o w n i n gh a da r r i v e d0 9 7 ( o d 4 2 0 ) t h ea d ha n dl d ha c t i v i t yw e r ec o n t i n u o u s l yi n c r e a s e di nt h ek o j ii n c u b a t i o n t h ea d h a c t i v i t yo f t h ep a s t ew a sg r a d u a l l yi n c r e a s e df r o m1 - 1 0d a y s ，a n dt h e ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e df r o m 1 5 - 3 5 d a y s ( p d 0 5 ) t h el d ha c t i v i t yo f t h ep a s t ew a sg r a d u a l l yi n c r e a s e df r o ml l od a y s ，a n d t h e ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e df r o m1 5 3 0 d a y s ( p 0 0 5 ) ，b u tw a si n c r e a s e da tt h el a t e r5 d a y s t h e v o l a t i l i t yc o m p o u n d sw a sd c t e r m i n e db ys p m e - g c m s t h er e s u l t ss h o w e dt h ea l c o h o lc o n t e n t i n c r e a s e dw h e nt h ea d ha c t i v i t yr i s e n , a n dl a c t i ca c i dc o n t e n tw a sv a r i e dw h e nt h el d ha c t i v i t y c h a n g e d ，a n da c e t i ca c i dw a sc r e a t e dp o s t e r i o rt ot h e m ，i nt h ef e r m e n 士e c ls o y b e a np a s t e ，t h ea l c o h o l ， l a c t i ca c i da n da c e t i ca c i dc o n t e n th a da r r i v e d1 7 3 ( r a g g ) ，1 5 7 ( r a g g ) a n d0 7 0 ( r a g g ) r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ea s t e r a s ea c t i v i t yw a sa l w a y sh i g h e ri nt h ek o j ia n dp a s t e i t sa c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dd u d n gt h el 。：；ii n c u b a t i o n ( p 0 0 5 ) a n dt h e nt h ea c t i v 毋w a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d d u r i n gt h ef e r m e n t a t i o no f t h ep a s t e ( p 0 0 5 ) ，其他阶段水分变化存在显著性差异( p 0 0 5 ) 。酱曲p h 值在整 个过程变化趋势为先减少后升高，且酱曲外部p h 值下降幅度大，经过方差分析得出酱曲外 部第4 0 - - 4 5 天，酱曲内部在第1 5 天，3 0 - - 3 5 天差异不显著( 础0 5 ) ，其他阶段p h 变化存 在显著性差异( p o 0 5 ) ，内部第4 0 - 4 5 天差异不显著( p 0 0 5 ) 。 3 1 1 2 中性蛋白酶的形成过程及蛋白质的分解 中性蛋白酶的产生菌有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地曲霉、酱油曲霉、米曲霉等( 张 树政，1 9 9 8 ) ，贡汉坤分离得到的霉菌经鉴定主要为米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a c ) 、酱油曲霉 ( a s p e r g i l l u ss o j o c ) 、高大毛霉( m u c o r s p p ) 、黑曲霉( a s 等，故酱曲中以_pergillusniger) 米曲霉、酱油曲霉为主( 贡汉坤，2 0 0 3 ) 。曲霉的中性蛋白酶和碱性蛋白酶都只能将大豆蛋 白分解成可溶性的大大小小的肽段，张素云通过试验数据证明，中性和碱性蛋白酶仅能分解 大豆蛋白为可溶性氮，几乎不产生游离的自由氨基酸，必须靠曲霉中的端肽酶( 酸性蛋白酶) 才能将可溶性肽进一步分解成游离氮基酸( 张素云，1 9 8 4 ) 。 从表3 1 中可以看出，在整个发酵基质中p h 值较接近中性，故中性蛋白酶活力始终很 高( 晟高可达外部7 4 9 8 u g 干基；内部6 3 2 2u 幢干基) ，在分解蛋白质中起主导作用。随着 蛋白酶系的形成，酱曲中的蛋白质逐渐被分解。样品总氮包括酱曲中所有含氮物质一蛋白质、 氨基酸、多肽等的总量。非蛋白氮( n p n ) 主要是由氨基氮和多肽氦组成，所以可近似的 一 将多肽氮看作n p n 减去氨基氮的差。 酱曲外部中性蛋白酶活力第5 天后开始增高，第5 - 2 5 天该酶活力大幅度升高，即该阶 段米曲霉分泌此酶旺盛。同时酱曲外部水溶性氮( n s i ) 、非蛋白氮( n p n ) 也在发酵第5 天 后开始明显增加，第1 0 q 0 天n s l 、n p n 增幅显著( p 0 0 5 ) ；相应的n s | 、n 烈还在继续增加，但由于酶活力 下降故增幅减小，第4 0 q 5 天趋于平缓，最终n s l 可达5 9 1 9 、n p n 可达3 0 0 4 。m a s a s h i 等人测定味噌( 日本豆酱) 发酵一个月可溶氮达6 0 以上( m a s a s h ie ta l ，2 0 0 6 ) ，c h o u 等 人研究酱油发酵过程中原料的生物化学变化，结果表明发酵第4 5 天非蛋白氮可达3 0 以上， 均与本试验结果基本吻合( c h o u c c ，c t a l ，1 9 9 8 ) 。 酱曲内部中性蛋白酶活力低于外部，整体变化趋势与外部相同。由于内部酶活力低，分 解蛋白质能力弱，因此从表中可以看出水溶性氮( n s i ) 和非蛋白氮( n p n ) 都在发酵初期 变化很小，酱曲内部第l 1 0 天n s i 增长差异不显著( p o 0 5 ) ，第1 0 天后才开始明显增加， n p n 第1 1 0 天涨幅差异不显著( p o 0 5 ) ；随发酵时间的延长n s i 、n p n 均逐渐增加差异显 著( p o 0 5 ) 。这一原因为酱曲外部p h 值变化大，而且p h 值的升高有利于碱性蛋白酶活力升高， 内部p h 值相对升高趋势小，故内部酶活力上升缓慢差异不显著。 由于p h 是发酵过程中控制微生物生长及产酶的重要因素，而酱曲培养过程始终偏离碱 性蛋白酶的最适p h 值，故该酶活力不高，对蛋白质的酶解作用小，仅在发酵第1 - 5 天、第 4 0 4 5 天( p h 值较高) 碱性蛋白酶活力高于中性蛋白酶，此阶段该酶对n s i 、n p n 的形成贡献 较大。 综上自然发酵黄豆酱酱曲培养过程中，微生物逐渐产生并分泌了相应的蛋白酶，由于水 分含量及p h 值的变化使酶活力发生了一系列的变化，该过程中蛋白质分解，游离氨基酸、 多肽等非蛋白氮成分的含量显著增长，同时蛋白质的分解产物又导致了p h 值的变化因此 形成了环境影响蛋白酶，蛋白酶分解蛋白质，蛋白质分解又影响p h 值，三者相互制约的关 系。 3 1 2 酱醪中蛋白酶的变化过程及蛋白质的分解 酱醪的发酵过程中，蛋白酶仍然发挥着重要的作用，不断分解蛋白质形成豆酱特有的成 分和风昧。发酵过程中水分含量、p h 值仍然影响微生物产酶，并与成分的分解构成相互联系， 相互制约的关系。 传统黄豆酱的制作要先经过酱曲培养( 霉菌发酵) ，然后再添加盐水进行稀醪发酵。水 分含量是发酵中的控制微生物生长代谢的重要因素，表3 - 2 列出了酱醪发酵过程中的水分含量 变化情况。酱醪发酵过程中水分含量变化与酱曲中变化趋势相似总体呈下降趋势，发酵后期 酱粘稠，发酵初期第l l o 天下降得快，之后水分下降变缓，第3 0 - - 3 5 天水分含量变化差异不 显著( p 0 0 5 ) 。 由表3 - 2 可以看出，在酱醪发酵的过程中p h 呈现不断下降的趋势，在发酵的前1 5 天内。 酱体p h 变化较快，可降低至5 4 9 ，此后，p h 下降开始趋于平缓，第1 5 5 天变化差异不显 著( p o 0 5 ) ，经3 5 天发酵后，终点在5 4 3 左右。t a k u m i 0 等人对日本y a m a n a s h i 地区产自 然发酵黄豆酱进行研究发现其最终p h 在5 2 左右( t a k u m io ，2 0 0 3 ) 。鞠洪荣分析韩国豆酱 p h 值为5 4 2 士- 0 5 8 ，与本试验结果相似( 鞠洪荣，1 9 9 5 ) 。成品黄豆酱的最终p h 在4 ，弘5 4 之间是最适合的低于4 8 时由于豆酱中积累过多的酸性物质会导致成品酱过酸化而严重影 响风味。引起黄豆酱酱体p h 下降的原因有两点：一是由乳酸菌发酵酱醪中的碳水化合物产 生乳酸、乙酸、琥珀酸等小分子有机酸，二是由于蛋白酶分解蛋白质生成游离的氨基酸。这 其中乳酸萄对酱酸度的降低贡献最大( 贡汉坤，2 0 0 4 ) 。造成发酵后期总酸变化趋缓的原因 可能是由于乳酸等有机酸的积累对乳酸菌自身生长和产酸能力起到了一定的抑制作用，另外 酵母菌产生的醇类物质也可能与酸类结合生成中性的酯类物质( 张海，1 9 9 3 ) 。 表3 - 2 酱醪发酵过程中水分、p h 、蛋白酶活力及酶解产物的变化 ! 垫：! ：i ! 坠! 幽g ! 12 1 尘2 l 墨! 堡1 2 璺! ! 坐：p 旦：e 竺! ! 堂! 鲤i ：坐磐璺p ! ! ! 丝! 罂堡垒! ! i 翌g ! 鲢巴2 1 2 婴i 垒翟! ! 丝1 2 翌 麓豁- h 篙n s i n 。p n ，鬻嚣 注：水溶性氮( n s i ) 、非蛋白氮( n p n ) 、氨态氯，多肽氮均为占总氮的百分含量；方差分析方法同 表3 - i ，( p = 0 0 5 ，n ) ；- 表示未检测到。 由表3 - 2 可以看出，酱醪中随着水分含量、p h 值不断下降，并且由于微生物逐渐衰亡， 导致( 酸性、中性、碱性) 蛋白酶活力不断下降。其中碱性蛋白酶活力下降到几乎为0 ，将 不再对酱醪中蛋白质起分解作用；中性蛋白酶活力也大幅度下降，最终仅有微弱的酶活力残 留：酸性蛋白酶活力降幅相对是最小的，在偏酸性的酱醪环境中，发挥作用分解蛋白质、肽 类形成大量的氨基酸，对酱的风味、营养性起到举足轻重的作用。 3 1 2 1 酸性蛋白酶的变化过程及蛋白质的分解 从表3 - 2 中可以看出在整个酱醪发酵过程中酸性蛋白酶活力呈下降趋势，降幅为4 0 8u g ( 干基) ，原因是蛋白酶主要为霉菌分泌产生，酱醪发酵过程通过打耙将霉菌菌丝去除，还 有高浓度食盐含量，使酶活力下降。 由表3 - 2 还可以看出，在酱醪发酵过程中氨基酸态氮的含量不断增加，而且前2 5 天上升幅 度很大，到第3 5 天成品酱的氨态氮的含量已达到3 7 3 的生成率。主要因为酸性蛋白酶分解 大豆蛋白产生的游离氨基酸，导致氨基酸态氮的含量增加。 酱醪发酵后期第3 0 3 5 天氨态氮增幅缓慢，经方差分析差异不显著( p o 0 5 ) 。原因一是 该阶段酸性蛋白酶活力很小；二是某些细菌利用了酱醪中的氨基酸；三是m a i l l a r d 反应和 s t r e c k e r 氨基酸降解反应的发生，从而导致氨基酸态匆含量升幅不大( 章建浩，2 0 0 4 ；张海， 1 9 9 3 ) 认为酱醪中某些乳酸菌( 如一些肠球菌、乳杆菌) 或芽孢杆菌可将精氨酸、酪氨酸、 组氨酸和天冬氨酸分解，另外还对丝氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸等进行特异性脱羰基的作用， 左右着酱体的香气。 3 1 1 _ 2 中性、碱性蛋白酶的变化过程及蛋白质的分解 中性、碱性蛋白酶在酱醪发酵过程中酶活力大幅下降，在第1 2 0 天中性蛋白酶活力降 幅达到3 3 7 3u 幢( 干基) ，碱性蛋白酶活力降幅为4 3 0u g ( 干基) ，但第2 0 天碱性蛋白酶 活力仅仅为0 1 9u g ( 干基) ；之后中性蛋白酶活力略有下降，但降幅不大，而碱性蛋白酶活 力已检测不到。酶活力的降低原因，一方面是微生物菌落总数降低；另一方面是p h 值的降 低，偏离中性、碱性蛋白酶的最适p h 值范围，酶活力受到抑制；还有酱醪高盐的环境在一 定程度上抑制了酶活力。 由于各种蛋白酶活力的降低，蛋白质水解程度受到限制，n s i 、n p n 和多肽虽然都呈上 升趋势，但升幅没有酱曲中大。从第1 1 5 天各种酶解产物升幅较大，而后缓慢增长，最终 n s i 增幅为1 5 | 4 2 ( 干基) ，n p n 增加了1 3 8 7 ( 干基) ，多肽氮升高了1 0 6 2 ( 干基) 。 k i e r sj l 研究d a w a d a w a ( 非洲一种发酵豆制品) 在发酵过程中芽孢杆菌水解蛋白质，发 现形成的可溶的蛋白和肽快速升高，分子量为11 0 0 2 0 0 d 的可溶蛋白和肽类在发酵成熟时可 达6 8 ( 干基) 以上，与本试验得