（食品科学专业论文）磁性高分子微球的制备、保护及荧光化.pdf

浙江1 二商大学硕士学位论文 磁性高分子微球的制备、保护及荧光化 摘要 磁性高分子微球( m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e s ) 是由磁性物质 和高分子材料组成的一种微球，因其具有较大的比表面积、超顺磁性 以及表面含有丰富的s 活性官能团等特点，引起了人们的极大关注。 磁性高分子微球可以通过包埋法，单体聚合法，原位沉淀法，层层自 组装法等多种方法制备，同时可以通过共聚、表面修饰等赋予微球表 面多种反应性功能基团( 如氨基、羟基、醛基、羧基等) 又可以通过 共价键来结合酶、蛋白质、细胞、抗体等生物活性物质，在j i - d h 磁场 下，能进行快速运动或分离。因此，口前磁性微球主要应用丁蛋白质 纯化、细胞分离、酶固定、环境食品微生物检测等领域。另外，还 可将磁性高分子微球进行表面荧光化，实现磁性分离技术与荧光标记 联用，在分离同时具有荧光示踪标记功能。 目前磁性载体的制备和应用研究主要还局限径：实验室分析和医 疗诊断规模，将其发展到大规模应用还面临着许多问题和挑战，集中 体现狗：如何制备性能优良的磁性载体，实现规模化生产，降低生产成 本；如何提高磁性微球的比饱和磁化强度和磁性微球的稳定性等方 面。针对上述问题，本文开展了磁性载体的制备、保护及荧光化方面 的研究工作。主要实验结果如下： 1 、采用静电层层a 组装技术制备复合磁性微球。聚正电解质重 浙江工商大学硕士学位论文 氮树脂( d r ) 和纳米f e ，0 4 通过静电作用层层自组装到聚合物微球上， d r 的重氮基( - n 2 + - ) 与f e 3 0 4 之间的离子键可通过紫外处理转变成稳 定的共价键，使磁性高分子微球在酸、碱和有机溶剂稳定性好。通过 s e m 表征发现随着包裹层数增加，微球磁性材料增多。通过静电吸附 羧甲基纤维素钠，使微球表面带有羧基，经测定微球表面羧基的含量 为0 3 4 m m o l g 。 2 、采用原位生成法制备高分子磁性微球，并用s e m 、f t i r 、 v s m 对样品进行了表征，结果显示所制高分子微球粒径分布均匀， 为球形；形貌规整，具超顺磁性，比饱和磁化强度为2 0 9 e u m g 。 3 、磁性高分子微球表面包裹上s i 0 2 提高磁性高分子微球的稳定 性。经过s e m 表征，硅包裹没有对磁性微球的形态产生影响，没有 产生杂质。通过v s m 测定随着包裹层数增加，饱和比磁化强度逐步 减少，但在包裹三次仍u j 达到1 0 0 e u m g 。通过耐酸性测定，磁性高 分子微球具有高度耐酸性。 4 、采用共价交联法制备磁性荧光磁微球，比饱和磁化强度在 8 0 e u m g 以上，微球的荧光强度均匀，满足应用所需荧光强度。 关键讧i ：磁性微球；层层白组装：原位生成；荧光 i i 浙江工商大学硕士学位论文 p r e p a r a t i o na n d p r o t e c t i o no fm a g n e t i cp o l y m e r m i c r o s p h e r e s w i t hf l u o r e s c e n c e a bs t r a c t m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sc o m p o s e d o f m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sa n dp o l y m e rh a v eb e e na t t r a c t i n gm u c ha t t e n t i o nf o rt h e i r b i gs u r f a c ea r e a ，s u p e r p a r a m a g n e t i ca n da b u n d a n tb i o c h e m i s t r ya c t i v i t y o ff u n c t i o n a l g r o u p m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sc a nb ee a s i l y p r e p a r e d a n db ef u r t h e rp r o c e s s e dt oi n t r o d u c ev a r i o u sf u n c t i o n a l g r o u p s ( s u c ha s - n h 2 ，一o h ，一c h o ，一c o o h ) o n t o i t ss u r f a c ea r e aa n db e c o m b i n e dt h r o u g hc o v a l e n tb o n do fe n z y m ef u r t h e r , e n z y m e ，p r o t e i n ，c e l l a n da n t i b o d y ，e ta 1 i tw i l lq u i c k l ym o v eo rs e p a r a t ei ne x t e r n a lm a g n e t i c f i e l d ，t h e r e f o r em a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e ss h o wi m p o r t a n tp r a c t i c a l a p p l i c a t i o n s i n f i e l d so fp r o t e i np u r i f i c a t i o n ，c e l l s e p a r a t i o n ，e n z y m e i m m o b i l i z a t i o na n dm i c r o b eo fe n v i r o n m e n t f o o d t e s t i n g ，e t a 1 i n a d d i t i o n ，t h em a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sc a na l s ob ec a r r i e do u to n t h es u r f a c ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s i tc a r r i e do u tt h ec o m b i n a t i o no f i 浙江工商大学硕士学位论文 m a g n e t i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g ya n df l u o r e s c e n tt a g s h o w e v e r , u n t i ln o wt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fm a g n e t i c m i c r o s p h e r e ss t i l la r el i m i t e d t ol a b o r a t o r ya n dm e d i c a ld i a g n o s t i cs c a l e t od e v e l o pt h i st e c h n o l o g yi nl a r g e s c a l ea p p l i c a t i o n ，t h e r es t i l le x i s t l o t so fc h a l l e n g e s ，e g ，d e v e l o p i n gt h et e c h n o l o g ys u i t a b l ef o rt h e m a s s i v ep r o d u c t i o no fh i g hq u a l i t ym a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw i t hl o w p r i c e ； i m p r o v i n gt h es a t u r a t i o nm a g n e t i z a t i o na n dt h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e s s t a b i l i t y t om e e tt h e s ec h a l l e n g e s ，s y s t e m a t i c a ls t u d yh a sb e e nc a r r i e d o u to nt h ep r e p a r a t i o n ，p r o t e c t i o na n df l u o r e s c e n c ei nt h i sp a p e r t h e m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 t h em a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sw e r es y n t h e s i z e db yt h e e l e c t r o s t a t i cl a y e r - b y l a y e rs e l f - a s s e m b l yt e c h n o l o g y t h es a m p l e sw e r e c h a r a c t e r i z e db yse ma n df t i r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o n t e n to f m a g n e t i c m a t e r i a l si nt h e m i c r o s p h e r e s e n h a n c e dw i t h i n c r e a s i n g e n w r a p p e dl a y e r s m a g n e t i cm i c r o s p h e r e sh a v eag o o ds t a b i li t y a f t e r o 1m o l lh c ii m m e r s i n g2 4 h m a g n e t i cm a t e r i a l so fm a g n e t i cp o l y m e r m i c r o s p h e r e sw e r en o tl o s t t h ec a r b o x y lc o n t e n to ft h em i c r o s p h e r e s s u r f a c ei so 3 4m m o l g 2 t h em a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sw e r e s y n t h e s i z e db yt h e i n s i t up r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y t h es a m p l e sw e r ec h a r a c t e r i z e db ys e m ， f t i ra n dm p m s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea s p r e p a r e dm i c r o s p h e r e s w e r er e g u l a rs p h e r i c a l m a g n e t i cp r o p e r t ym e a s u r e m e n ts h o w e dt h a t i v 浙江工商人学硕士学位论文 s a t u r a t e d m a g n e t i z a t i o n o f m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r s w a s 2 0 9 e m u g 3 i no r d e rt oi m p r o v et h es t a b i l i t yo ft h em a g n e t i c p o l y m e r m i c r o s p h e r e s ，i tw a sp r o t e c t e dv i as o l - g e la p p r o a c h t h es a m p l e sw e r e c h a r a c t e r i z e db ys e m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h i so p e r a t i o nd i dn o t a f f e c tt h es h a p eo ft h em a g n e t i cp o l y m e r s p h e r e sa n dd i dn o tb r i n g i m p u r i t i e s m e a s u r e m e n to fm a g n e t i cp r o p e r t ys h o w e dt h a t s a t u r a t e d m a g n e t i z a t i o no fm a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r sw a sd e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gs i 0 2l a y e r s t h es a t u r a t e dm a g n e t i z a t i o no fe n w r a p p e dt h r e e l a y e r ss i 0 2m i c r o s p h e r si s1 0 0 e u m g t h i se n w r a p p e dt h r e el a y e r ss i 0 2 m i c r o s p h e r sw e r es t a b l e t h ef l u o r e s c e n tm a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sw e r es y n t h e s i z e d b yc o v a l e n tc r o s s l i n k i n gm e t h o d t h es a t u r a t e dm a g n e t i z a t i o nw a sa b o v e 8 。e u m 培t h ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sh a dh o m o g e n e o u sf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y k e y w o r d s ：m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ；p r e p a r a t i o n ；l a y e r - b y l a y e r s e l f - a s s e m b l y ；i n s i t up r e c i p i t a t i o n ；p r o t e c t i o n ；f i u o r e s c e n c e v 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名：雍盛整 日期：沙吵年夕月罗日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：毖盛监 导师签 日期： 浙江丁商大学硕士学位论文 第一章综述 磁性高分子聚合微球( 简称磁性微球) 是通过适当的化学方法使有机高分子 材料与无机磁性材料结合而形成的具有一定磁性及特殊结构的一种功能材料。磁 性高分子微球的研究开始于2 0 世纪7 0 年代末，u g c l s t a d 首先成功合成尺度均一 的单分散的聚苯乙烯磁性微球，冈磁性微球的顺磁性，可借助外磁场实现快速分 离，这给分离纯化带来了革命性发展，也为实现靶向给药增加了可能性。因此， 磁性微球受到人们的广泛的关注和研裂1 ，2 1 。 由于磁性高分子微球既具有有机高分子材料的易加工和柔韧性，又具有无 机材料的高密度和高力学性能和生产成本低、能耗少、无污染等优点。通过化学 修饰在其表面接上o h 、- c o o h 、- c h o 、- n h 2 、s h 等官能团，还可以实现进 一步的表面接枝共聚。加上纳米范畴的磁性微球，具有大的比表面积和显著的界 面效应和量子尺寸效应，因此，磁性微球具有广泛的应用前景。目前，研究的磁 性微球主要用于蛋白质纯化、细胞分离及环境、食品微生物检测等领域f 3 刁】。将 磁性高分子微球表面荧光化后，还可作为磁性分离技术与荧光标记联用，在分离 同时兼具有荧光示踪功能。本文就近年来磁。陀微球的r f 能、制备、应用及微球的 荧光化进行做一简要综述。 1 1 磁性高分子微球的制备 磁。阡高分子微球根据结构不同可分为三类：a 核( 磁性材料) 壳( 高分子材料) 式结构；b 核( 高分子材料) 壳( 磁性材料) 式结构；c 核( 高分子材料) 壳( 磁性材料) 壳( 高分子材料) 结构，上述三类结构的示意图如图1 i 所示。作为核或壳的高分 子材料可以是复合结构或均相结构，如作为核的高分了材料本身既具有核壳形 结构，而作为壳的高分子材料还可以是多层结构。以磁。陀材料为核的磁。| ， 高分子 微球其核也可以是复合结构。以磁r e 材料为壳的磁陀高分子微球，冈制备条件不 同，磁性材料在高分子材料的表面分布有不同的状态，如：有均匀分布、非均匀 分布。 磁性高分子微球制备方法主要有包埋法、单体聚合法、原位沉淀法、层层自 组装法等。 浙江工商大学硕十学位论文 聚合物 无机材料 图1 1 磁性高分子微球的结构分类示意图 f i g 1 - 1t h ec l a s s i f i c a t i o no ft y p e so fm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s 1 1 1 包埋法 包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀悬浮于高分子溶液 中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段制得磁性高分子微球。磁性粒子表面与 亲水性高分子之间存在一定的亲和力，所以若把磁性粒子浸泡于这些高分子的溶 液中，再经过乳化等处理过程，就可以在磁性粒子表面形成高分子壳层。为了增 加微球的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层进行稳定化处理。天然高分子磁性 微球均采用这种方法制备。邱广亮【8 i 等以明胶包埋磁性氧化铁制备出稳定的磁性 明胶复合微球，又考察了磁性酶最适合温度、p h 值等，指出磁r e 酶比自由酶的 稳定性显著提高。 包埋法制备磁性高分子微球所需的条件简单，易于进行，但制得的磁性粒子 粒径分布宽，形状小规则，粒径f i 易控制，壳层中难免会有些诸如乳化剂之类 的杂质，用于免疫测定、细胞分离等领域会受到很大限制。同时山于磁性材料一 般为亲水性颗粒，所以包埋的高分子一般也要为亲水性分子，否则很难将磁一陆微 粒完伞包裹。这在一定程度上进一步限制了包埋法的应用【9 1 。 1 1 2 单体聚合法 目前制备磁陀复合微球的方法主要是单体聚合法。单体聚合法是先将磁。陀粒 子、单体、引发剂、稳定剂等的混合液通过均化器分散均匀，再在适当的条件下 进行聚合以制符核壳式磁性高分了微球。单体聚合法得到的载体粒径较大，固 载母小，但作为i 占1 定化酶的载体，有利于保持酶的活性，而日磁性也较强。 聚合方法主要有：悬浮聚合1 1 0 , 1 1 i 、乳液聚合1 2 , 1 3 1 、分散聚合1 1 4 - 1 7 1 、可控自由 基聚合等方法。由于用悬浮聚合法制得的磁性微球在粒径分析j 、磁含量方面均不 理想，给固定化酶的分离带来影响。目前大都采用乳液聚合法和分散聚合法制备 的磁性微球担当i 占1 定化酶的载体。利用乳液聚合技术难以得剑粒径大于1 u m 的 浙江工商人学硕士学位论文 磁性微球，当磁性高分子微球用于细胞分离、固定化载体的领域时，为了能在磁 场下快速分离，多希望利用大于l l u r l 的磁性高分子微球。而分散聚合对于合成 大粒径、单分散的磁性高分子微球具有得天独厚的优势，因此用分散聚合法合成 的磁性高分子微球很受欢迎1 1 8 】。很多有机单体疏水性很强，难以与磁核的亲水 表面紧密结合，所以往往要对磁微球表面进行预处理，使其表面具有一定的疏水 性，或者适当改变聚合体系的有机组成，以利于聚合的进行。n o g u c h i f l 9 1 等用乳 液聚合法制备了磁性高分子微球，讨论了影响颗粒大小的因素及磁微球完全被包 裹的条件。邱广明报道了磁性聚苯乙烯微球的合成，得到了稳定性好、单分散的 磁性微球。该方法克服了传统的乳液聚合法难以找到的引发点，形成理想的合成 聚合场所的优点。 1 1 3 原位生成法 原位法是u g e l s t a d 2 0 】等发明的一种与众不同的制备单分散超顺磁性复合微 球的方法，并用该方法丌发了系列商业化产品，著名的d y n a b e a d s 囊。该产品已成 功地心用于微生物学、分子生物学、免疫学等领域。 原位生成法是通过先制备适当的聚合物，然后通过聚合物提供受控环境通过 化学反应存聚合物表面生成纳米级的磁性材料，从而实现无机纳米复合材料的的 制街。可实现这种反应的模板了聚合物的表面均带有强极性的基团，如磺酸皋、 羧基、羟基，胺基、腈基。这些强极性基团可与强极性的无机纳米颗粒巾的金属 离子之间形成离子键、络合配位键等强烈的相互作用，从而降低微粒问的相互碰 撞几率同时聚合物链可以阻止颗粒的过度聚集，有利于形成纳米颗粒。z h i y a m a , y u e p i n gg u a n ，h u i z h o ul i u 2 1 l 等先制得单分散的聚甲基内烯酸缩水甘油酯 ( p g m a ) ，并用乙二胺对其化学改性制成含氨基的模板，然后注入f e 2 + 、f e 3 + 的混 合液使其与模板卜的氨基键合，最后加入氨水产生纳米f e 3 0 4 颗粒。将所得产物 用s e m 、t e m 、f t i r 、m 和v s m 进行了表征，结果表明所得产物为单分散的 粒径甲均人d , 2 6 9 m 超顺磁。r l i 的聚合物颗粒，其中f e 3 0 4 的含量为2 4 3 ，比饱和 磁化强度为l6 3 e m u g 。 浙江工商大学硕士学位论文 一o o 贮兰一。卜钭呲 h oh 浙江i 商大学硕十学位论女 匀纳米颗粒，这种尺寸大小可控的磁性微球具有广阔的应用 竿棼半眷 p o i y e l e c t r o l y t e ( 3 ) 图l o 层层自组装磁性微球示意图0 2 2 1 f i gl _ 3s c h e m a l i c i l l u s w a t i o n o f m a g n e t i c m i c r o s p h e r e $ t h o u g h l a y e r - b y - l a y e rs e l f - a a s e m b l e f r a n k c a r u s o l 2 3 i 等通过层问自组装制得r 复合磁性壳核颗粒，其壳由多层 f e 3 0 4 纳米颗柑聚合电解质( p d a d m a c 或p a h ) 组成，核是p s 胶粒，、f 均粒径 1 0 - 1 5 n m f f j f e 3 0 4 纳米颗粒和聚台电解质( p d a d m a c 或p a h ) 交替地沉积在6 4 0 r i m 的p s 胶粒t 。 1 1 5 界面沉淀法 通常是先分别制取聚合物胶体粒了和无机物粒了，通过加入电解质、调节p h 值或其他方式使聚合物胶体粒子和磁性粒子袁面带p 相反性质的电荷，由于静电 作用，两者混合后磁性粒子被吸附在聚合物胶体粒子表面形成包覆层的一种方 法。ap i c h 等叫j 利用无乳聚合先制得粒径均匀可控的高分子微球p s a a e m ，以 此为模板，加入合成磁粉的原料，控制反应介质f l o j p h 等使新生成的磁粉聚沉在 高分子的表面，得到a 型磁性微球。h u id u l 2 s 1 等用s a ，a a ( 质母比6 ，2 ，2 1 共聚制 得带负电荷的胶体粒子与制得的带正电荷的f e z n 胶体粒子界面# t 秋，得到f e 2 0 3 包覆的复合粒子，再以该粒子为种子加入s t b a a a ( 质量比6 2 2 1 、乳化剂 s d s o p ( i i6 7 ) 、引发剂k s p 进行聚合，制得了夹心式结构的磁性高分子微球。 如剀所示： 浙江t 商上学碰十学位论文 n e g a t i v ei a t e x 、j i 一? = “= 仁“” _ i 毒一蝌。兰1 鬲| ll 二jl j ab a m p h i p h i l i c e n c a p s u l a t e dp a r t i c l e 罔1 4 界面沉淀法制各磁性微球示意圈 f i g1 4 t h ep r o c e s s o f p r e p “d n go f m a g n i e t i e p o l y e r m i e r o s p h e r e s t h o u g h i n t e f f a c i a l p r e e i p i t a n o n 12 磁性高分子微球的应用 1 2l 磁性高分子微球在生物技术中的应用 磁f f ：载体在生物技术的许多领域都得到，广泛的应用，具体体现在固定化 酶、细胞分离和提纯、蛋白质的分离和纯化、棱酸的分离与提纯等多个方面。 1 2 1 1 固定化酶 磁性微球瑚定化酶具有以下优点：( 1 1 有利于i 圳定化酶从反应体系叶1 分离和 叫收，操作简单，降低成本；( 2 ) 磁性载体载酶放入磁场稳定的流化床反应嚣 中，可以减少连续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作：( 3 ) 利用外音| j 磁场可以控制磁性载体崮定化酶的运动方式昶i 方向，替代传统的机械搅拌方式， 提高酶的催化效率；( 4 ) 可以改善酶的生物栩容惟、免疫活悱、亲疏水。陀等：( 5 ) 若将多种酶结合存载体上，还可进行多酶反应。 牛物酶小仅具有非常高的催化反应活性，j 司时酶催化底物有非常好的专性 和选择性，是种非常理想的催化剂。但是，生物晦小能人上合成，其提取过程 也复杂，这就造成臆通常有非常高的成本。此，利用生物酶进行催化时往往需 要将酶固定化。酶的田定化使用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内。仍能进 行其特有的催化反应、并可叫收发蒂复使用的技术。山于乍物高分了具有很多色 新 i 商大学碗学位皓立 能团，如- h , 难1 2 、- o h 、- c o o h 、- c h o 等，酶分子可通过物理吸附、交联、共价 偶合等方式固定在磁微球表面。生物高分子磁微球固定化酶的优点是：易于将酶 与底物和产物分离 操作简单，成本低。z u z a n ab 等“i 用磁性p ( h e m a e d m a l 微球的酰肼衍生物同定中乳糖氧化酶，被定向固定的酶表现出很高的存储活性和 对环境的低敏感性。目前己研究过的磁性载体崮定化酶有：脂肪酶2 7 “i 、转化 酵素b q 、乳糖酶p q 、纤维素酶p 1 慷凝乳蛋白酶吲葡精氧化酶葡槠淀粉酶剐胰 蛋白酶删、尿激酶删、木瓜蛋白酶( 3 7 1 、乙酵脱氢酶m i 、脱氧核精核酸酶等5 圳。 1 2 1 2 蛋白质的分离与提纯 通过对磁性微球表面政性引入能被目标蛋白质识别和可逆结台的配基，磁 性微球可使特定的蛋白质吸附在袁面，外加磁场即可将吸附蛋白质后的磁性微球 与其它杂质蛋白分丌，然后将磁性微球上的目标蛋白洗脱下来即可。与传统分离 方法相比具打快速、高纯、高收率等优点。r 海交大的w e i m i n gz h o n g 等通过微 乳液法制得了表面带有羧基的磁性高分子微球，取2 0 r a g 用c d i 活化，经过c d i 活化的带羧摹的高分予雨与老鼠的免瞳蛋白质进行偶联反应。结果显示，免疫球 蛋白确实键台存磁微球表面，并日将所分离的老鼠免疫球蛋白沈脱下米后还展示 r 良好的活州删。 皇) j 1 c 7 ：， 口+ 裂兰2c 卜 一0 u 9 m i m m 。o d b e “” b p 。r o h d ”“t w 。p 。o d u 。c t a b s o f o e d d p l o d 躲? 图i - 5 磁性亲和分高原理不意图 f i g1 - 5s c h e m e f o r p r i n c i p l e o f m a g n e t i ca f f i a i t ys e p a r a t i o n 1 2 i 3 细胞分离 采用包台有磁性物质的高分了微球作为载体，存其表面定上具有生物活性 的吸附剂或其它配体( 如抗体、荧光物质、外源凝结素1 ，利用它们与指定细胞的 特异性结台，在外加磁场的作用下将细胞分离、分类以及对其种类、数龋分巾进 行研究。红细胞需从血液l 1 分离，以便对白细胞进行化疗。目前，细胞的分离依 浙江工商人学硕士学位论文 赖离心技术。通过离心分离，红细胞通常占整个血液的4 5 ，同时夹杂一定的白 细胞。一般说来，离心分离的效率大约是5 0 。某些癌症的治疗需要将白细胞从 血液中彻底分离。一种利用磁导向原理的设备正被研制用于从整个血液中持续地 分离红细胞1 4 1 1 。 1 2 1 4 核酸分离 传统的核酸分离技术包含沉淀，离心等过程，这些纯化方法的步骤繁杂、费 时长、收率低，接触有毒试剂，很难实现自动化操作；而采用磁性载体微球分离 技术就能很好地克服这些缺点，实现样品地快速、高效制备，是未来核酸纯化方 法发展的一个莺要方向。 o s t e r 等【4 2 1 报道了采用聚乙烯醇磁性微球( m p v a ) 快速、高效地分离特定和 非特定序列的核酸，成功地从不同地血样中提取基冈组d n a ，与商业化的d n a 提取试剂盒和传统方法相比，显示出快速、高得率和高纯度等特点；他还采用了 碳二亚胺活化反应使表面带羧基的m p v a 共价结合寡核苷酸链，将其用于杂交检 测或者包含特定碱基序列的核酸的分离。x i e 等【4 3 1 将表面带羧皋的超顺磁性纳米 粒子，应用于从人全血分离皋囚组d n a ，效果良好，产量高，损失小，而日不 需要离心过程和使用有毒试剂，极具发展前景。另# b t 44 l ，他还研发了，一种以羧 基修饰的磁性纳米粒子作为固相载体，从样品中富集靶细胞和从细胞裂解液中吸 附d n a 的方法。采用这种方法，吸附在纳米磁珠表面，卜的d n a 不用洗脱就可 以直接作为靶基因用作p c r 扩增的模板，从而大大简化了从靶细胞富集到靶基 因扩增的全过程。该方法快速简便，小使用有毒试剂和离心操作，便于用来构建 快速、高通量核酸制备的生物芯片。 1 2 1 5 环境食品微生物检测 以磁陀微球为基础的免疫磁性分离( i m s ) 对环境中水体和食品中各种微生物 进行检测的技术快速r 高效。免疫磁分离的技术原理是在聚合物磁性微球表面接 枝定向吸附于细菌抗体，并利用它与原液混和、沉降，存磁场作用下分离、提纯， 得到吸附于磁球卜的活菌。通常采集到到的检测水体或食品巾微生物含量撤离法 都需要将采集到的样品进行预处理，除去样品中的种悬浮物及杂质。此法耗时且 样品中待检测的组分会随着预处理过程部分丧失，使最终检测结果发生偏差。 s k j e r v e 等报道j ，用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门 浙江工商人学硕士学位论文 氏菌，其检测限为每克l x l 0 2 个细菌【4 5 1 。免疫磁分离技术可快速将目标微生物从 样品中分离出来，如果和其它检验方法，如酶联免疫吸附分析( e l i s a ) ，多聚酶 链式反应( p c r ) ，荧光免疫分析( f i a ) ，电子化学发光( e c l ) 相结合，则可数倍地 提高分离效率和检测极限。b r u n o 等利用以免疫磁性微球为固相载体的e c l 技 术探测土壤中的b a n t h r a c i s 抱子l 矧。y u 等利用i m s f i a 技术，不进行过滤等预 处理，直接对环境水样本进行检测。用该方法能快速有效地探测环境中水的 s e b ( 1 0 n g m l ) 和e c d 肋1 5 7 ：h 7 ( 2 x 1 0 3 个细胞m l ) ，其分析灵敏度为 8 4 0 8 7 0 t 4 7 1 。s y l v i 等利用i m s p c r 法，可在7 h 内检测5 i o o l 样本中少奄一 个的c p a r v u m 卵囊【4 8 1 。该方法的快速性和灵敏性足以使其胜任饮用水中污染的 常规检测。目前，磁性高分子微球的研究多限于实验室阶段和初步的应用研究， 但其中仍有一些成功应用的例子。如挪威的d y n a l 公司开发了一系列的商品化磁 性高分子微球d y n a b e a d s 。该公司的系列产品己经成功的应用于微生物学、免疫 学、分子生物学、痛症研究等领域，同时还在美、英、德、口、澳等同建立了分 支机构。另据报道，澳大利亚联邦科学与工业研究组织( c s | r o ) f i j i e s u j 成功粒径为 1 0 0 p m 的磁性离子交换树脂珠粒，用于除去饮用水巾的有机物。该产品即将实现 商业化。 1 2 2 磁性高分子微球在医学工程中的应用 。 啦 将高分予材料用不同方法制成f 同尺寸、不同表面结构和形态的微球，可以 在医学领域满足不同的应用。 1 2 2 1 靶向药物 为了提高药物的效用，减少其毒昌l j l z f 用，靶向药物正成为当今的热门研究课 题。所谓靶向药物就是利用药物载体的p h 敏感、热敏感、磁性等特点，在外部 环境的作用下，对病变组织实现定向给药。早在1 9 0 6 年，e h r l i c h 就提 l ；了靶向 给约的设想，随着生物医学的发展，这一设想逐渐成为现实。将约物与微球载体 连接制备药物的载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释 给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。靶向药物，常被喻为“q i 物导弹”， 是药物剂型发展的高级阶段。靶向药物技术是指利用对某些病变组织细胞具有特 殊亲和力的分予作载体，将药物包埋在微球微囊内或利用高分了的各种皋团将药 物负载在表面，在外加的磁性导向系统f ，将药物输送到特定的病变部位释放， 9 浙江t 商人学硕士学位论文 将其定向输送到作用的靶器官病变部位，增强疗效、减少药物对人体正常组织的 副作用。 磁性粒子载体使用最多的是f e 3 0 4 和 t - f e 2 0 3 。骨架材料应是生物相容性好、 可生物降解的高分子材料，包括白蛋白、壳聚糖、淀粉、葡聚糖、p e g p v a 、聚 乳酸等i 删。目前己制各成磁性微球的药物有盐酸阿霉素、丝裂霉素c 、放射菌素 d 、氟尿嘧啶、肝素、葡萄球菌蛋白a 、两性霉素b 、白介素2 、博莱霉素、胰 岛素以及一些诊断剂等。为了提高磁性药物微球的靶向作用实现双重靶向，可以 在磁性微球的表面偶联抗体、凝集素等各种配体。影响磁性微球靶向治疗的因素 很多，如磁性微球的大小、释药速率、磁场强度、磁场梯度和磁场使用时间、肿 瘤部位的血管分布、通过性、肿瘤部位离磁场的距离等。磁性微球对于治疗离表 皮较近的痛症，如乳腺痛、食管癌、膀胱痛、皮肤癌等，已经表现出了较大优势。 目前，磁性载体的靶向治疗人多数还是停留在实验室阶段，可以相信，在不久的 将来，磁陀靶向治疗将在临床上得到广泛应用。 1 2 2 2 医学检验诊断 抗体是一种特殊蛋白质，当外源“抗原进入生物体内f i 寸，淋巴细胞就产牛 抗体与抗原结合以捕获或分解抗体，从而达到防止抗原侵犯机体的目的。冈此， 抗体能够高选择性地和抗原结合，形成特异的复合体。利用抗原抗体f u j 的特异 性结合，临床上常用来诊断疾病，利用磁微球可以更快速、更直观、更方便地达 到诊断的目的。 1 3 荧光微球的制备与应用 1 3 1 荧光微球的制备方法 1 3 1 1 吸附法( 染色法) 此方法利用有机荧光材料和微球的疏水性，通过物理吸附制备有机有机荧 光微球。将不非水溶性的荧光材料溶于有丙酮等机溶剂中，再将其与载体的水分 散体系混合，荧光材料会被析山并被吸附到载体上，如美国专利u s p a t ，5 7 2 3 2 1 8 即采用这种方法1 5 0 i 。 l o 浙n i 商大学硬学位论女 o + f i u o r 1 l 一一 图l 吸附法荧光徽球制备示意图 f i g1 - 6s c h e m e f o ra d s o f p f i o n f l u o m s c e n t m i c r o s p h c r c s p r e p a r a o n l 1 2 包覆法 通过此种方法，可以制各无栅有机荧光微球及有机，有机姨光微球。其基本 原理是将荧光材料均匀分散在介质中，利用聚合反应或分予自组装方法制备出荧 光微球。制各出的荧光微球几乎都具有明显的核，壳结构。 朱以华等 5 1 悃聚合物微球或二氧化硅为核，采用层层自组装技术，在微球 表面交替组装络合有镉离子或锌离子的多层聚电解质，而后引入硫离子、硒离子 或碲离子，原位反应得到荧光纳米粒微球，这种方法可制备出荧光粒吸附量大、 分布均匀、且标有多种粒子的荧光微球。 f l u o p o l y e l e c l y o l y t e 图l - 7 层层自组装法制蔷荧光徽球听菲幽 f i gh 7s c h e m e f o rp r e p a r a t i o no f l a y e r - b y l a y e rs e l f - a s s e m b l e d f l u o r c s c c n l m i c r o s p h e r e s 1 3 1 3 共聚法 此法是特指带有可聚合官能团的荧光物质与可聚合官能团的有机单体进行 聚合所制备的均结构的尖光微球。r c m b a u 一”l 以带可自由基聚台官能团的荧 光物质( 结构为f - a b 4 ) ，其中f 为发色基，0 为毅键，a ，b 为可丰1 1 互缩合的官 能团) 与带活性官能团( 如- o h 、- c o o h 、- n h z 、一o 0 的丙烯酸类单体进行水丰 【悬 浮聚台，并用变联剂变联得到高光节了、高稳定性日巾物相容的聚台物荧光微球。 浙江工商大学硕十学位论文 其平均直径为1 7 t m 。将其标记细胞膜，可探测膜上受体的性质、数量及分布情 况。 m o n o m e r + f l u o 图l - 8 共聚法制备荧光微球7 j i 恿图 f i g 1 - 8s c h e m ef o rp r e p a r a t i o nc o p o l y m e r i z a t i o nf l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s 1 3 2 荧光微球的应用 1 3 2 i 在高通量药物筛选中的应用 所谓高通龟药物筛选( h t s ) ，是使用机器人和自动化系统，从大量的样本中 鉴别出对确定的分予靶标有相且作用的少量活性化合物的一种现代药物筛选技 术。它是利用已有的化合物进行筛选，是一种人规模、高效率、高灵敏度的筛选 方法【5 3 1 。荧光微球表面连接可与待测物结合的受体，将待测物( 配体) 进行放射性 同位素标记。二者混合后，能与微球结合的待测物的放射性能激发荧光物质产生 荧光：而1 、= 能与微球结合的待测物，由于距离微球较远，其放射能在水r f l 湮火， 不能激发荧光。邻近闪烁分析通常在常规的分析缓冲液中即可进行，分析的物质 包括：表面物理吸附或化学键合抗体或受体分子的荧光微球；可发射低能辐射的 i 一位素标记的抗原或配体。它是高通量药物筛选的重要筛选模型，无须射游离和 结合的标记物进行分离，操作自动化，大大缩短检测时间、节省人力物力【5 4 】。 因此，活性分予仅以荧光强度分析而没有任何额外步骤就被简单地筛选出来。 1 3 2 2 高通量免疫分析 人们将光学编码技术、免疫分析技术及图像学技术等结合在一起，实现厂高 通量分析 l 测目的。这是建立在编码微球、免疫荧光和流式细胞术等实验技术基 础，上的一种新型免疫分析方法【5 5 】。y a nx 等人使用两种不同的类似的荧光编码微 球方法，实现j ，a 型和b 型流感病毒的同时检测，熏复性好、敏感度高、试剂 耗墙小、实验成本低【5 6 1 。 1 4 研究的目的与意义 浙江- t 商大学硕士学位论文 磁性生物分离在细胞分离、靶向药物、核酸纯化、固定化酶、食品微生物检 测等生物医学和生物工程领域得到了广泛的研究并展现出广阔而诱人的应用前 景，目前磁性分离在生物检测、癌症的早期诊断和