（食品科学专业论文）类黄酮化合物抗氧化性能的研究.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 本论文对姜辣素和神秘果的抗氧化特性进行了研究。采用d p p h t ( - - 苯代苦味 酰基自由基1 清除法和抗油脂氧化法对姜辣素的抗氧化能力进行了考察，得出姜辣 素对d p p h 清除率在7 0 8 0 ；对油脂氧化有很好的保护作用，纯化液保护效果 最佳，证明姜辣素具有很好的抗氧化特性，佐证了姜渣吸附纯化姜辣素是一种有 效的纯化方法。采用循环伏安法和微分脉冲法对姜辣素的电化学行为进行了考察， 姜辣素在玻碳电极上表现出很强的电化学信号，其氧化曲线有两个氧化峰，通过 对比不同p h 、不同扫描次数下的氧化峰，得出低电位峰是姜烯酚的氧化峰，高电 位峰是姜酚的氧化峰；通过循环伏安扫描进步证明姜烯酚的在电极上的反应为 可逆反应，电子转移数为i ，姜辣素的电化学反应为半可逆反应。采用微分脉冲法 对p h 对姜辣素电化学行为( 抗氧化性能) 的影响进行了考察，得出随着p h 值升高， 姜辣素的反应能力逐渐增加，但反应速度逐渐降低。采用微分脉冲法对不同温度 下姜辣素的电化学行为进行了考察，得出姜辣素的电化学行为是挥发效应和动力 学效应共同作用的结果，姜烯酚比姜酚的挥发性更强。采用微分脉冲法，以芦丁 为标准品，测得姜酚的含量为0 4 1 ( 干重计) 。 对神秘果的基本成分( 灰分、酸碱度、水分、蛋白质、有效酸度、有机酸及维 生素c ) 进行了分析，测得神秘果中维生素c 含量达到4 0 3 8 m g 1 0 0 9 ，得出神秘果 是一种富含维生素c 的高碱性的保健水果。采用d p p h 法考察神秘果提取物对自 由基的清除力；同时采用b 一胡萝卜素亚油酸乳化液氧化法考察神秘果提取物对过 氧化物的清除作用，得出神秘果对d p p h 具有极强的清除力，对亚油酸氧化产生 的过氧化物的清除作用强于o 0 1 m g m l 的b h t 。证明了神秘果提取物具有很好的 抗氧化性能。同时，通过对神秘果鲜果、果锭和粉剂的横向比较，得出神秘果的 活性成分极不稳定。 关键词：姜辣素，神秘果，抗氧化性，d p p h ，b 一胡萝卜素亚油酸乳化液氧化法， 电化学 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t a n t i o x i d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fg i n g e ro l e o r e s i na n dm y s t e r i o u sf l u i th a v eb e e n s t u d i e di nt h i s p a p e rs e p a r a t e l y f i r s t , m e t h o d s o fc l e a r a n c et od p p h a n d a n t i o x i d a t i o nt or a p e s e e do i la r eu s e dt oe v a l u a t ea n t i o x i d a t i o no fg i n g e ro l e o r e s i n t h ec l e a r a n c er a t i ot od p p h i s7 0 t o8 0 ，a n dt h ep r o t e c t i v er a t i ot or a p e s e e do i li s h i 曲，t h er a t i oo fp u r i f i c a t i o ns o l u t i o ni st h eh i g h e s t i ti sv e r i f i e dt l l a tg i n g e ro l e o r e s i n h a sg o o da n t i o x i d a t i o n ，a n dt h ea d s o r p t i o np u r i f i c a t i o nm e t h o dw i t hg i n g e rd r e g si sa l l e f f e c t i v em e t h o d t h e n , m e t h o d so fc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n dd i f f e r e n t i a lp u l s e v o l t a m m e t r y ( d p v 、a r cu s e dt os t u d yt h ee l e c t r o c h e m i s t r yb e h a v i o r so fg i n g e ro l e o r e s i n ； t h e r ei ss t r o n g e re l e c t r o c h e m i s t r ys i g n a lo nt h e $ l l l f a c 宅o fg i a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ，a n d t h e r ea r et w oo x i d a t i o np e a k so nt h eo x i d a t i o nc u r v eo fg i n g e ro l e o r e s i n ，i ti sp r o v e d t h a tl o we l e c t r i cp o t e n t i a lp e a ki ss h o g a o l so x i d a t i o n , a n dt h eh i g h e ro n ei sg i n g e r o l s b ys t u d y i n gt h eo x i d a t i o np e a k so f d i f f e r e n tp ha n dd i f f e r e n ts c a n n i n gn u m b e ro f t i m e s t h es t u d yd a t ai n d i c a t e dt h a tt h er e a c t i o no fs h o g a o lo nt h ee l e c t r o d ei sr e v e r s i b l e r e a c t i o n ，t h en u m b e ro fe l e c t r o nt r a n s f e ro ft h i sr e a c t i o ni so n e ，a n dt h er e a c t i o no f g i n g e ro l e o r e s i ni sh a l fr e v e r s i b l er e a c t i o n t h em e t h o do fd p v i su s e dt os t u d yt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np ha n de l e c t r o c h e m i s t r yb e h a v i o r ( a n t i - o x i d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c ) ， i t i si n d i c a t e dt h a tt h er e a c t i o na b i l i t yi ss t r o n g e rw i t ht h ei n c r e a s eo fp h ，a n dt h e r e a c t i o nr a t ei sd e c r e a s e d m e a n w h i l e ，t h em e t h o do fd p vi sa l s ou s e dt os t u d yt h e e l e c t r o c h e m i s t r yb e h a v i o ro fg i n g e ro l e o r e s i na td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ，t h er e s u l t s r e v e a l st h a tt h eb e h a v i o ri sc a u s e db yv o l a t i l i z a t i o na n dd y n a m i c se f f e c t s ，a n dt h e s h o g a o li sm o r ev o l a t i l et h a ng i n g e r 0 1 f i n a l l y ，r u t i ni su s e da ss t a n d a r dp r e p a r a t i o nt o d e t e r m i n et h ec o n t e n to fg i n g e ro l e o r e s i nw i t ht h em c t h o do fd p v , a n dt h ec o n t e n to f g i n g e r o li s0 4 1 ( o nd r yb a s i s ) 1 1 l eb a s a lc o m p o n e n t s ( a s h , s o u ra l k a l i n i t y , m o i s t u r ec o n t e n t ，p r o t e i n ，e f f e c t i v e a c i d i t y , o r g a n i ca c i da n dv i t a m i nc ) o fm y s t e r i o u sf r u i ta r es t u d i e di nt h i sp a p e r ； e s p e c i a l l yt h ec o n t e n to fv i t a m i nc i s4 0 3 8 m gp e r1 0 0 9 i ti n d i c a t e st h a tm y s t e r i o u s f r u i ti sak i i l do fr i c hi nv i t a m i nc ，h i 班a l k a l i n i t yh e a l t hc a r ef r u i t t h e n ，m e t h o d so f c l e a r a n c et od p p h a n do x i d a t i o no fp c a r o t e n ea n dl i n o l e a t ee m u l s i f i c a t i o ns o l u t i o n a r eu s e dt oe v a l u a t ea n t i o x i d a t i o no fe x t r a c t i o no fm y s t e r i o u sf r u i t , t h er e s u l t si st h a t t h ec l e a r a n c er a t i ot od p p h 。i sh i g h e ra n dt h ec l e a r a n c ee f f e c tt op e r o x i d ei sb i g g e rt h a n 0 0 1 m g m lb h t , a n di t i sv e r i f i e dt h a tt h ee x t r a c t i o no fm y s t e r i o u sf i u i th a sg o o d n 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a n t i o x i d a t i o n f m a u y , t h es t u d yd a t ai n d i c a t e dt h a tt h ea c t i v ec o m p o n e n to f m y s t e r i o u s f r u i ti su n s t a b l eb ys t u d y i n gt h et h r e es a m p l e so ff r e s hf r u i t ，f r u i tt r o c h ea n dp o w d c r s e p e r a t l l y k e y w o r d s ：g i n g e ro l e o r e s i n , m y s t e r i o u s o x i d a t i o n o f 1 3 - c a r o t e n e e l e c t r o c h e m i s t r y f i u i t ，a n t i o x i d a t i o n , d p p h ，m e t h o d o f a n dl i n o l e a t ee m u l s i f i c a t i o ns o l u t i o n , i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重鏖太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：和饧鸭签字日期：7 年6 月8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重废太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重庞太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名：毋鹋7 签字日期：刈7 年多月8 日 导师签名：村彬 签字日期：j 0 9 f f - 月莎日 重庆大学硕士学位论文1 前言 1 前言 1 i 研究目的和意义 抗氧化剂是添加于食品中能阻止或延迟食品氧化，以提高食品的稳定性、延 长贮存期的食品添加剂。食品在贮藏过程中不仅受细菌、霉菌等作用发生腐败变 质，而且有些食品在与空气接触时发生氧化出现褪色、褐变，产生异味，有时甚 至会生成有害物质，使食品品质下降，直至不能食用。油脂食品的这种现象尤其 严重，通常称为油脂的“酸败”。酸败食品会产生难闻的哈味，油脂降解的生成物有 毒，长期摄入这种变质的油脂或富脂的食品将导致细胞功能衰竭乃至组织坏死、 诱发各种疾病。此外，蔬菜、水果的褐变，啤酒的异臭味和变色，均与氧化有关。 防止和减缓食品氧化，除了从原料、加工、保存等环节上采取相应的避光、降温、 排气、干燥、充氮、密封等措施外，适当地配合使用一些安全性高、效果明显的 抗氧化剂在防止食品氧化方面有良好的的效果( 1 】。 随着人们保健意识水平的提高，天然食品添加剂日益受到消费者喜爱。欧洲 国际市场每年仅天然食品抗氧剂的需求量就约为几十万吨，每年的增长率一般为 1 0 一1 5 ，据此分析在今后5 年内的需求量将上升到几百几万吨，年，而美国的 年需求量和增长率与欧洲市场同步。2 0 0 5 年我国食品添加剂的需求量为数千吨， 而年生产力仅能满足3 0 的需求量，其余大部分靠进口，现阶段我国的人均消费 量不足l o 年，而美国在上世纪9 0 年代就达1 0 1 5 年人，相比就足见我国的食 品添加剂市场的巨大潜力。目前，国内外可用作天然抗氧化剂的植物资源丰富， 如生姜、胡椒、八角等辛香类调味料及大豆、茶叶、报春花属、鼠尾草等植物。 据调查，国际市场上天然食品抗氧剂以维生素e 、d 一胡萝b 素及茶多酚等，而我 国尽管也有这几种天然食品添加剂，但其在整个市场中的比例太微小。 生姜具有独特风味、香型和抗氧、保健、防腐等功效。其深加工天然食品添 加剂( 姜辣素及姜精油等) 尚未在国际市场上作为大众化的食品添加剂占据应有的 地位，仅仅在调味品及化妆品等中有少量使用，对于国内市场，应用步伐就更是 缓慢【2 - 3 】。我国生姜资源丰富，原料价格低廉( 约1 8 1 0 元瓜蓟。目前世界贸易主 体仅是干姜，约为2 万吨年，其利润和附加值均很低。国际生姜深加工产品的价 格约为几百几千元k g 。国内外贸收购价约为2 0 0 元k g ，以鲜姜为原料，产品收 率约为3 4 ，折合生产其它费用，成本价约为6 0 8 0 元k g 。可见，生姜的深 加工产品具有丰厚的利润和附加值。按照国家有关规划，2 0 1 0 年，食品工业产值 为2 万亿元，相应配套添加剂约为2 8 0 - - 3 0 0 万吨，其中天然食品添加剂尤其是多 功效的药食双效类添加剂无疑将独占鳌头【4 】。本课题提出研究姜辣素的抗氧活性及 重庆大学硕士学位论文 1 前言 抗氧机理，不仅对生姜提取物作为天然食品抗氧添加剂的应用进程有积极的推动 作用，而且所获得的理论成果还可指导相关食品的生产和加工实践，同时也可丰 富和完善生姜保健功能研究的理论成果。 神秘果是一种神奇的水果，可使酸味变甜，在西非当地人常吃这种果实使略带 酸味的陈玉米面包更可口，使酸棕榈酒和啤酒更甜。早在6 0 年代许多学者就开始对 这一特性的活性成分进行提取、分离、纯化和利用等研究。神秘果因其独特的变 昧功能而颇具神秘性和趣味性，对人类探索和了解大自然的多样性和神奇性有着 强烈的吸引力，是一种有一定发展前途的热带珍稀植物，市场前景看好。神秘果 可用作食品、医药及化妆品行业的增甜剂、助食剂、食品色素、化妆品成分等， 例如，可将浓缩加工成的神秘果干粉配置成口香糖、泡泡糖、牛皮糖等大众化咀 嚼食品，为糖尿病患者开发甜味食品，以满足他们的需求。近几年来，神秘果在 我国台湾地区的种植面积曰益扩大，它的保健功能也越来越受到人们的关注。新 的应用表明，神秘果提取物具有很强的抗氧化性，但还缺乏全面系统的研究，因 此，在杨先生的大力支持下，本研究对神秘鲜果、果锭、粉剂三种样品的成分进 行分析，进而对神秘果的抗氧化性能进行进一步的研究，为神秘果作为一种具有 变味、抗氧等多种保健功能的水果在市面上的推广提供理论依据【5 “。 1 2 天然抗氧剂的研究现状 随着对各种抗氧化物质的研究越来越深入，抗氧化物质在生产和生活上的应 用也越来越广泛。然而，一些合成抗氧化剂的副作用也日益凸现，人们转而开始 研究天然提取物，发现许多天然动植物成分具有抗氧化性能，包括水果、蔬菜、 野生植物、动物产品等等【2 】，经萃取后的某些提取物的抗氧化性能十分优异，具有 良好的前景。许多天然抗氧化剂不但对油脂和含脂食品具有比合成抗氧化剂如 b h t ( 2 ，6 二叔丁基对甲酚) 、b h a ( 丁基羟基茴香醚) 等更强的抗氧化能力，同时尚 具有在人体内消除氧自由基的活性，以保护细胞组织免受氧化作用的损害，从而 起到保护心脑血管系统、抗癌和抗衰老等作用。主要的天然抗氧化剂来源大致分 为以下几类；食品类原料；香辛料；中草药；蛋白质水解物、氨基酸及美拉德反 应产物；微生物和藻类。天然蔬果是最佳的抗氧化物来源，而且种类繁多，统称 为植物性化合物，现在已经有学者把植物性化合物归为人体的第七大营养素。植 物性化合物共同组成强力的抗氧化大军，能够帮助人体抗老。近年来，对黄酮类、 酚类、萜类、多糖类化合物的研究越来越受到关注。它们的提制、抗氧化活性的 测定、活性机理的研究以及产品开发是诸多学者研究的重点【l 】。 1 2 1 黄酮类天然抗氧化剂的研究进展 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 是自然界中存在的酚类物质，亦称维生素p ，常与维 2 重庆大学硕士学位论文 1 前言 生素c 伴存，属植物次级代谢产物，至今已分离鉴定出4 0 0 0 多种。黄酮类化合物是 自然界药用植物中主要活性成分之一【7 1 。大量研究显示，黄酮类化合物具有抗菌、 抗病毒、抗发炎、抗过敏以及血管舒张作用；另外，它还能抑制脂质过氧化作用、 血小板凝聚、毛细管渗透性以及脆性，以及大量酶的活性；黄酮类化合物的此类效 果大都与它的抗氧化性相关【8 l 。 黄酮类化合物是自然界中以c 6 c 3 c 6 的方式构成的三环天然有机物，根据黄酮 类化合物的化学结构进行分类，主要有黄酮醇( f l a v o n o l s ) 、黄酮( f l a v o n e s ) 、黄烷酮 ( f l a v a n o n e s ) 、黄烷醇( f l a n a n o l s 或儿茶酚c a t e c h i n s ) 、花色苷( a n t h o e y a n i n s ) 、异黄酮 ( i s o f l a v o n e s ) 、二氢黄酮醇( d i h y d r o n a v o n o l s ) 以及查尔酮( c h a l c o n e s ) 等8 类。另外，还 有一些其它类型的黄酮类化合物，如香豆素( c o u m a r i n s ) 等。黄酮类化合物可以是配 基和糖苷型( 环上携有一个或多个糖基) ，也可以是甲脂衍生物。黄酮酵以及黄酮化合 物是最为常见的类黄酮，而黄烷酮、黄烷醇类o l 茶酚) 、二氢黄酮以及二氢查尔酮类 化合物被认为是一类微量类黄酮，因为后者在自然界分布相对有限。其中，槲皮素 ( q u 钉c 谢n ) 是研究最为透彻的一种黄酮类化合物【9 】。 黄酮类化合物的抗氧化作用是指其对单线态氧( 1 0 2 ) 和含氧自由基的清除能 力。生物体内的含氧自由基包括超氧阴离子自由基( o f ) 、羟基自由基( o h ) 和脂质 过氧化自由基( r o o ) 【1 0 1 。此类自由基可与体内大量生命所必需的分子( 如核酸、蛋 白质) 相互作用，从而对后者产生毒害作用【1 1 1 。前三种自由基是通过一系列的电子 还原机制由分子氧依次产生，脂质过氧化自由基则是由细胞膜上的多不饱和脂肪酸 通过自由基链式反应而发生的酶促及氧化脂质过氧化反应形成。单线态氧以及生 物系统中产生的自由基如超氧化物自由基和羟基自由基均可诱导脂质过氧化反 应。 黄酮类化合物作为非常强的自由基消除剂以及单线态氧消除剂，可抑制脂质的 过氧化作用。而且，黄酮类化合物与过氧化自由基相反应，还终止了自由基反应的 链式反应。b o m b a r d e l l i 和m o r a z z o n i 【1 2 1 观察到，当一种多不饱和脂肪酸产生自动氧 化时，黄酮类化合物主要通过以下几点显出它们的抗氧化作用：抗自由基活性 ( - o h ，羟基) ；抗脂质氧化活性 ，烷基；r o o ，过氧基：r o ，烷氧基) ；抗 氧活性( 0 2 ，1 0 2 ) ；抗自由基活性( 0 2 ，超氧化物) ；金属鳌合活性 1 2 2 姜辣素的研究现状 生姜( g i n g e r ) 是一种民间常用的中草药，具有解热、镇痛、抗炎的作用，并且 由于生姜香辣味独特，作为一种食品和食品添加剂深得百姓喜爱。我国传统的生 姜制品较多，如腌姜、姜丝、糖醋姜片、姜丝辣酱等，随着食品科技的发展，又 开发出以生姜为主要原料的罐头、蜜饯等制品，推动了生姜产品的发展【l “】。目 前国内外还广泛利用现代工艺技术提取生姜的有效成分，开发姜醋饮料，大大提 3 重庆大学硕士学位论文l 前言 高了生姜的利用率，但对生姜的开发还远远不够。 生姜提取物( 姜辣素及姜精油) 与黄酮类化合物具有类似的结构特征，因此也常 把它视为类黄酮化合物。其含量约为干重的1 3 ，由于这两种成分是主要风 味物质、具有良好的抗氧、抗菌及营养保健作用【4 】。所有国内外研究者均将其作为 生姜深加工产品开发的主要目标。姜精油是将生姜的水浸提液采用水蒸气蒸馏而 得到的挥发性组分，具有浓郁芳香气味的可流动的浅橘黄色液体，适宜于饮料、 调味品等的加香，是国内外市场颇受欢迎且价格高的天然香精和药用原料，但其 较强的挥发性严重影响相关产品的质量和新品种的开发。姜辣素是将生姜用有机 溶剂( 如乙醇、丙酮等) 萃取得到的初浸液经蒸馏回收溶剂后的剩余物。其特征是： 不易挥发、呈粘稠状半流动态的深棕色( 棕黑) 液体，口感芳香、辛辣，通常其中含 有少量的姜精油成分，其拥有姜作为香辛料的全部风味。值得一提的是：姜辣素 中的高沸点组分对姜油挥发分有一定的固定化作用，且可用于高温加工食品，由 此可将姜辣素视为使用广泛的天然定香剂。 近年来，许多研究表明，生姜中的辣味成分具有很强的抗氧化活性【1 5 4 7 1 。 姜辣素是生姜中主要呈味成分和药用成分，是多种物质的混合物，其组成中均含有 3 甲氧基4 羟基苯基官能团，姜酚是姜辣素中主要活性成分，也有人直接把姜辣 素称为姜酚。姜酚的化学性质极不稳定，例如，在酸性条件下，c 4 的活泼氢极易与c 5 的羟基一起脱水形成姜烯酚( 姜脑) ；在加热或碱性条件下，c 4 和c 5 间的碳碳键断裂 形成姜酮和相应的醛【4 】。姜辣素的研究是目前天然抗氧化剂中较为热门的研究，从 国内外研究现状来看，对姜辣素的提取、含量测定、抗氧化活性的测定以及产品 开发的研究较多。对于姜辣素的提取，目前主要的提取方法有：溶剂浸提法、压 榨法、液体c 0 2 浸提法和超临界c 0 2 萃取法等【l 引。其中溶剂浸提法和压榨法的优点 是工艺简单、投资小，但存在产量、纯度和收率较低的弊端。相比较而言，超临 界萃取法具有高效性、反应条件温和、无溶剂残留及选择性易于控制等特点，是 今年国际国内市场中商品姜辣素的主要提取方法之一，但本法也有以下问题亟待 解决：工艺条件对产品的组成及其功能性质的影响明显，超临界c 0 2 的相平衡和传 质性能研究及产品微胶囊化等。尤其超临界c o ：萃取设备投资大、运行成本高是阻 止产业化进程的重要因素。此外，尽管2 0 0 5 年已有报道：山东烟台环洋食品科技 开发有限公司已引进国外生物技术生产生姜深加工产品，但其可操作性及其产品 稳定性尚待验。 i 2 3 神秘果素的研究现状 神秘果( m y s t e r i o u s 觚t ) 原产西非热带地区，自然分布在西非刚果一带，现在世界 热带亚热带地区均有栽培。我国于6 0 年代引入种植，在海南、云南、广西等热带亚 热带地区生长良好。8 0 年代被引入台湾，现在台湾已形成几大种植基地。研究表 4 重庆大学硕士学位论文1 前言 明，神秘果果肉含有一种味觉修饰蛋白神秘果素，是由五种糖类及二十种人 体所需的氨基酸聚合而成的糖蛋白，可使柠檬、酸橙、葡萄柚、草莓等酸性食物 变成可口的甜味，而且还对稀释的有机酸、无机酸如柠檬酸、盐酸、乳酸、醋酸、 磷酸等变甜。一般在接触神秘果数小时内吃任何酸性食物或喝任何酸性饮料都可 感觉出愉快的甜昧，对咸味和苦味无影响。甜味的作用可存留2 h 或更长时间，它的强 度根据桨果的潜力而定，一般0 1 9 的干果相当于一个鲜果足够引起甜味反应。神秘 果本身测不出甜味，只有吃了酸性食物后才能激活，感觉出一种显著的蔗糖甜味。因 为神秘果神奇的功效，使其受到人们的重视。 神秘果鲜果的活性成分非常不稳定，几天后就可失活，必须在l 2 天内进行冷冻 处理。一般l o o g 鲜果( 种子4 0 9 ，果肉6 0 9 ) 除去种子经冻干处理可获9 1 l g 干果，将干 果贮藏在- - 2 0 的冷藏机内可保存3 个月，其稳定性良好。由于神秘果素的不稳定性， 国外许多学者早在6 0 年代就开始对其活性成分进行了提取、分离和提纯研究。 n a e 丑e a 通过水透析将5 粒冻干果肉，加水研磨，用水透析，经冻干处理后其不溶物含有 活性成分。又通过离心法将1 4 颗冻干果肉加水研磨，用5 0 0 0 r m i n 离心机离心处理， 再经冻干处理可获0 3 1 9 含有活性成分的褐色固体物，还通过溶剂依次将除去种子 的冻干果粉用石油醚一氯仿一醋酸乙醇一丙酮一无水乙醇一水( 即非极性溶剂一极 性溶剂) 提取，或用水一含水乙醇一无水乙醇一丙酮一氯仿一乙烷( 即极性溶剂一非 极性溶剂) 提取，分别获2 7 倍和4 0 倍含活性成分的浓缩物。对其稳定性的研究表明在 热水( 2 3 ) 、5 碳酸钾液、冷藏一个月活性失效，而在5 酒石酸液、5 或1 氯酸 钾液、唾液中较稳定。k u r i h a r a ，k 等首次利用离子交换色谱分离出神秘果素并表 明它是一种碱性糖蛋白。b r o u w e r 等通过葡聚糖凝胶柱过滤提纯得活性成分。在以 上研究中他们都采用碳酸盐缓冲液( p h l o 5 ) 或较高碱性化合物如鲑精蛋白和精胺 提取，采用这些方法不仅导致甜味降低，而且还能溶解各种物质包括很难除去的颜 色。s a r r o c h 等发现用0 5 m o u l n a c l 液在酸性环境中提取，可提取9 7 的神秘果素，提 纯5 4 倍。该提取液无色，p h 4 ，在酸性环境中非常稳定，如在醋酸盐缓冲液( p h 4 ) ，5 中， 至少6 个月其活性没有改变。通过硫酸铵分馏、离子交换色谱和亲和色谱法进一步 提纯，纯度可达4 0 0 多倍，用反相高效液相色谱分析可获单一锐峰，表明纯度较高。2 0 9 冻干果可获3 6 m g 的纯神秘果素【”9 1 。 近年来，由于神秘果在台湾的大量种植，对它的提取物研究也进一步深入， 初步证明了神秘果提取物具有很强的抗氧化能力，这与黄酮类化合物具有相似的 性质，因此，本研究把神秘果的抗氧化性的研究归结到类黄酮化合物抗氧化性的 研究中。同时，这一特性又增加了这种神奇水果的神秘性，拓宽了神秘果的应用 领域，因而，对神秘果抗氧化性能的研究值得进一步的深入。 5 重庆大学硕士学位论文1 前言 1 3 天然抗氧化剂抗氧化性能的测定方法 对于抗氧化剂抗氧化性能的测定仍然没有精确、简单的方法，甚至还没有一 个统一的标准。要全面评价一个抗氧化剂的抗氧化活性，必须同时作各种不同条 件下抗氧化活性的研究。因此，如何测定样品的总抗氧化能力( t o t a la n t i o x i d a n t c a p a c i t y , t a c ) 或总清除自由基抗氧化力( t o t a lr a d i c a l t r a p p i n ga n t i o x i d a t i v e c a p a c i t y , t r a c ) 激起了许多学者的兴趣。目前常用的方法主要基于两类：通过测 定样品抑制脂类物质氧化的能力来评定被测物的抗氧化能力；用样品对人工生 成的自由基的清除能力来反映待测物的抗氧化活性。对于抗脂类物质过氧化法， 常选用以下几种底物：食用油脂和富含油脂的食物；亚油酸及甲基亚油酸；低密 度脂蛋白及极低密度脂蛋白。另一类方法一般是人工建立活性氧或自由基的发生 体系，然后检测其中产生的自由基及抗氧剂或自由基清除剂对所产生自由基的抑 制清除行为。常用测定方法有：羟自由基( o h ) 清除法；超氧阴离子自由基( 0 。2 ) 清除法；a b t s ( 2 ，2 - 联氮一双一( 3 乙基苯并噻唑啉6 磺酸) ) 法；d p p h - ( - - 苯代苦味酰 基自由基) 自由基清除法；f r a p ( - - 价铁离子) 法it b a s ( 硫代巴比妥酸) 法等【拈2 3 1 。 目前常用的测定天然抗氧化剂的抗氧化能力的方法主要有以下几种： 1 3 1d p p h 法。叫 d p p h 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在5 1 7 r i m 有强吸收。有自 由基清除剂存在时，d p p h 的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的 吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的。因此， 在次波长处的吸收可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能 力。d p p h 法具有快速、简便、灵敏和直接可行的优点，因此目前国内外广泛将 d p p h 法用于抗氧化能力的测定。 1 3 2p 一胡萝i 、素一亚油酸乳化液氧化法 6 一胡萝b 素是一种多烯色素，易被氧化而褪去黄色。在反应介质溶液中，由 亚油酸氧化产生的过氧化物等能使b 一胡萝h 素漂白，随时间的延长吸光度越来越 小。当以吸光度对时间作图时可得到一条下降曲线。不同原料的溶剂提取物，按 其抗氧化活性的大小不同而使b 一胡萝h 素漂白的速度各异。抗氧化能力越强，吸 光度下降越慢。因而不同的曲线有不同的斜率。抗氧化能力越强的，曲线斜率绝 对值越小。是目前测定t a c 较常用的一种方法，尤其在比较果蔬抗氧化活性时。其 优点是可以直观目睹底物的氧化，可用比色法来准确地测定底物的氧化情况，操作 简单快速，成本底。但是由于胡萝卜素的加入，它本身有抗氧化活性或氧化催化作用， 对抗氧化剂的抗氧化活性的测定有一定的干扰作用。 1 3 3 表观羟基自由基清除法 在生命活动的代谢氧化代谢过程中不断产生各种自由基，其中羟基自由基( o h ) 6 重庆大学硕士学位论文1 前言 是体内最活泼的活性氧，可导致许多病理变化。因此羟基自由基的检测对自由基 的生物作用研究具有重要意义。表观羟自由基清除率也是表征抗氧化剂抗氧化性 能的指标之一。一般使用f e n t r o n 体系或是光照过氧化氢产生羟基自由基，使用邻 二氮菲作为显色剂，检测抗氧化剂抑制羟基自由基把f e 2 + 氧化为f c 3 + 的能力。 1 3 4 a b t s 法 a b t s 法最先由m i l l e r 等人开创，用于测定生物样品的抗氧化能力。a b t s 经活 性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基a b t s 斗，向其中加入被测物质，如果该 物质中存在抗氧化成分，则该物质会与a b t s + 发生反应而使反应体系褪色，然后在 a b t s + 这种自由基的最大吸光波长下( 一般选择7 3 4 n m ) 检测吸光度的变化。 a b t s 法这种体外测定方法花费的时间短，经费少，所需仪器设备简单。与其他几种 总抗氧化能力体外测定法相比，a b t s 法快速、简便、与抗氧化剂的生物活性相关 性强，因而较为广泛地应用于包括血清在内的生物样品、果蔬类和一些纯物质的抗 氧化能力的测定。 1 3 5 t b a s 法 硫代巴比妥酸反应物( t b a s ) 值法】是评价油脂的氧化程度最常用的方法。氧化 的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸( t b a ) 作用生成 有色化合物，该有色化合物在5 3 0 n m 左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来 评价油脂的氧化程度，也可测定抗氧化剂活性。 1 3 6 f r a p 法 f r a p 原理为f e 3 + 一三吡啶三吖嗪( t r i p y r i d y l - t r i a z i n e ，t p t z ) 可被样品中还原物 质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于5 9 3 n m 处具有最大光吸收，根据吸光度 大小计算样品抗氧化活性的强弱。 1 4 电化学方法在天然抗氧化剂领域的应用 上述研究方法都是从化学反应的角度来检测抗氧化剂的抗氧化活性，从抗氧 化剂的作用机理可以看出，抗氧化剂发生作用时，实际上是发生了氧化还原反应， 与电极上发生的氧化还原过程类似，可以认为抗氧化活性实质上是一种电化学性 质。因此，用电化学方法来研究天然抗氧化剂的抗氧活性是可行的。近十几年来， 从国内外的研究资料显示，电化学方法在天然抗氧化剂领域的研究已有了初步的 应用，主要表现在以下几个方面：电化学检测和抗氧活性评价、利用电化学方法 进行动力学探讨以及抗氧化剂与d n a 之间的相互作用。在研究过程中，简单的电 化学参数尤其是氧化波的半波电位e l 2 或氧化波峰电位石，常常作为衡量黄酮类化 合物抗氧化性的指标，即其氧化电位局2 或e 越低，还原能力越强，则抗氧化能力也 越强 7 重庆大学硕士学位论文1 前言 1 4 1 常用的电化学方法 微分脉冲法：应用恒电流仪使加在研究电极上的电位从实验开始时的初始 电位突跃到一定的电压，并保持一定的突跃值。这种电化学方法称为微分脉冲法。 循环伏安法：控制电极电势按恒定速度( 8 e 1 8 0 ，从起始的电势e 。变到另一 终止的电位取，然后立即按相同的速度再从e 猡e 到e i ，或在e i 和e 应间多次往复循 环扫描，记录电极电势的同时记录相应的响应电流，这种包含正反向电势扫描的 测试技术称作循环伏安法。 椭圆偏振法：椭偏技术基本上是应用光束偏振态的来进行测量的。它是研 究表面和薄膜的一种光学技术。这一技术被广泛应用于物理学、化学、材料、生 物、电子、机械、冶金和生物医学等领域【l ”。 1 4 2 电化学检测和抗氧活性评价 循环伏安法( c 作为一种简便快速的电化学方法，已经得到了广泛的应用，微分 脉冲伏安法、示波极谱法、流动注射安培法也得到了一定的应用。同时这些方法 也用来评价抗氧化剂的抗氧化活性，抗氧活性评价一般是通过测量电化学参数， 或测量抗氧化剂的添加对活性氧体系电流信号的削弱程度来实现的。对于这方面 的研究是电化学研究抗氧化剂的基础研究，它相对于其它方法而言具有简便快速 的优点，因此，国内外这方面的研究都较多。 c h e v i o n 【2 5 】等用c v 法测定几种病人血浆中低分子抗氧化剂的浓度，证明了常 食果蔬可以很好的预防癌症和心血管疾病的发生。杨春海【2 6 】等以辣椒碱为标准品 做标准曲线，测定出生姜中姜辣素的含量。马志茹 2 7 1 等在邻苯三酚自氧化体系中 用单扫示波极谱法进行检测，证明槲皮素与芦丁都能有效地清除超氧阴离子自由 基( 0 2 ) ，但芦丁的清除作用比槲皮素要弱些，它们的i c 5 0 值分别为1 7 8 m 0 1 ld 和 1 6 3 n 0 1 l 一。李启隆【2 8 1 等对葛根苷元用示波极谱法，检测限可达到3 o x l 0 7 m 0 1 l ，用吸附伏安法检测限可达至u 5 x l o o m 0 1 l 。y a i l g 等【2 9 1 用直通式柱电解法测 得2 9 种类黄酮化合物的氧化电位e 和失电子数e ，并用紫外一可见分光光度仪测定 了其抑制脂质过氧化作用的i c 5 0 值将二者联系在一起，得到了黄酮化合物氧化电 位与抗氧化活性之间的规律。同时，电化学方法也可以结合其他的研究手段进行 新的探索，r u b e n s 【3 5 】等用电化学方法结合化学合成和光谱法，证明了类黄酮金属 离子复合物的抗氧化性能要明显优于单一的黄酮化合物。 1 4 3 电化学方法探讨类黄酮的动力学特征 运用电化学方法得到的数据可以推导反应的可逆性，求得电子转移数、速率常 数、传递系数、交换电流密度等表观动力学参数，结合中间粒子和生成物的检测，我 们可以得出反应的历程以及细节变化，推测反应机理，并可以对化合物的结构进 行研究和验证。就目前的研究状况来看，这方面还比较薄弱，专门针对动力学的 8 重庆大学硕士学位论文1 前言 研究较少，一般都是在其他研究的基础上附带考察动力学参数。 综述国内外的研究状况，董社英等【3 0 】采用线性扫描伏安法、循环伏安法和常 规脉冲伏安法详细研究了改性药物3 - 大豆甙元磺酸钠( d s s ) 在p h l o 6 2 的水溶液 中的电化学行为在不同p h 范围内得到了d s s 的三个还原波研究证实，在p h 3 2 条件下所获得的p c l ，p e a 波分别为质子化的d s s 的单电子不可逆吸附还原波及还原中 间体自由基的单电子、单质子不可逆吸附还原波；在3 2 纯化液体系。氧化1 2 h 后，加纯化液、初浸液的体系和 空白体系的p o 、，值分别达至1 j 3 8 6 8 、4 0 3 6 和4 2 8 3 。以上实验证明了姜辣素对油脂的 1 6 重庆大学硕士学位论文 2 姜辣素抗氧化性实验研究 氧化具有保护作用，且姜辣素纯化液的抗氧化效果更好，说明纯化液中姜辣素含 量高，杂质少，证明了用姜渣精制纯化姜辣素是一种有效的精制方法。 表2 6 菜籽油的过氧化值( 6 0 c ) t a b 2 6p o v o f r a p e s e e do i la t6 0 c 表2 6 中： v t 一未加姜辣素的油样体系消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，m l ： v ”掭加生姜初浸液的油样保护体系消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，m l ； vp 冁加纯化姜辣素的油样保护体系消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积删； 4 5 4 1 3 7 3 3 2 9 2 5 o24681 01 2 时间( h ) 图2 7 不同油样体系的过氧化值 f i g 2 7p o v o f d i f f e r e n ts y s t e mo f o i ls a m p l e 2 3 姜辣素电化学行为的研究 2 3 1 试剂、仪器及溶液配制 1 7 一f鬓一ol 重庆大学硕士学位论文2 姜辣素抗氧化性实验研究 电化学工作站 电子天平 c h i7 6 0 b k y b i o a 型 上海辰华仪器公司 上海科析实验仪器厂 酸度计p h s 3 c上海大中分析仪器厂 磷酸 冰醋酸 硼酸 浓硫酸 铁氰化钾 氯化钾 氢氧化钠 乙醇 8 5 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 9 5 成都市金山化工试剂厂 重庆川东化学有限公司化学试厂 重庆川东化学有限公司化学试厂 重庆川东化学有限公司化学试厂 西安化学试剂厂 上海化学试剂总厂 北京化工厂 重庆市普康消毒用品有限公司 溶液的配制： b r 缓冲液：准确量取1 3 5 5 m l8 5 的磷酸溶液和1 1 8 0 m l 冰醋酸，并准确称取 1 2 5 5 9 硼酸，用蒸馏水溶解定容至1 0 0 0 m l ，摇匀备用。此时的b r 缓冲液的p h 值约为2 ，使用时取一部分用4 m o u l 的n a o h 溶液调节至所需的p h 值。 2 3 2 电极的选择 实验内容 实验用电极( 三电极体系) ：工