（食品科学专业论文）青春双歧杆菌高密度培养方法及冻干工艺的研究.pdf

青春双歧杆菌高密度培养方法及冻干工艺的研究 摘要 双歧杆菌是人体肠道内重要的生理性细菌，具有防治肠道感染、调节人体免疫功 能、抗肿瘤作用等多种生物学功能，它的存在直接影响消化道的健康状况，有潜在预 防和治疗疾病作用，因此双歧杆菌广泛用于食品和微生态制药方面。但是，双歧杆菌 是专性厌氧菌，体外培养很难达到较高的活菌数，限制j ，双歧孝t 菌制品的开发和应用。 本文研究了补料高密度培养青春双歧杆菌的工艺，得到了高密度双歧杆菌培养物，同 时筛选出双歧杆菌冻干菌粉制备的工艺条件，主要内容和结论如下： l 通过对青春双歧杆菌进行补料高密度培养达到了较高的活菌数 在青春双歧杆菌液体分批培养研究的基础上，通过补加碱液调整发酵过程中培 养基p h 值，补加葡萄糖消除碳源减少对双歧杆菌增殖的抑制，延长了发酵过程的对 数生长期，提高了最大活菌数，实现青春双歧杆菌的高密度培养。发酵罐高密度培养 对数生长期由6 h 提高到1 4 h ，延长8 h ，最大活菌数从39 1 0 8c f u m l 提高n 4 6 x 1 0 9 c f u m l ，提高1 0 8 倍。 2 确定了1 0 l 发酵罐高密度培养青春双歧杆菌的工艺条件 在研究了青春双歧杆菌发酵罐分批培养和盐水瓶补料高密度培养的基础上，确 定发酵罐高密度培养的工艺条件：1 0 l 发酵罐中培养基灭菌后为8 l 。初始p h 值70 ， 通入氮气保持压力，压力为0 i m p a ，接种量5 ，3 7 。c 搅拌培养，转速8 0 r r a i n 。培养 6 h 后发酵液p h 值降至5 7 6 ，从发酵罐补料口滴加碱液保持p h 值= 6 ；葡蕴糖浓度1 2 h 降至4 e e l ，此时开始补糖，使糖浓度保持在4 6 e j l 。6 - 2 0 h 为菌体生长的对数期，在对 数生长期末期放罐，此时发酵液o d 值达到23 。 3 筛选得到了青春双歧杆菌真空冷冻干燥的最佳工艺条件 选择对数生长期末期发酵罐补料高密度培养的青春双歧杆菌发酵液作为制备冻 干菌粉的菌种来源，在无菌条件下6 0 0 0r r a i n 离，i l , 1 0 m i n ，弃上清液，在菌泥中添加发 酵液体积1 0 的保护剂，充分混匀，制成菌悬液，保护剂配方为2 0 脱脂乳和1 蔗 糖+ 4 甘露醇。真空冷冻干燥的工艺参数为：真空压力1 5 p a ，冷阱温度为一4 5 。0 ，加 热方式为搁板导热，升华热控制在一54 c 以下，解析热控制在2 0 。c 以下。冻干温度为 一3 0 。c 、装液厚度为1 0 m m 。菌体的冻干存活率为7 3 ，活菌数达n 32 x 1 0 ”c f u g ， 冻干后样品复水性好，且冻干样品含水量可达到2 以下。 关键词：青春双歧杆菌，高密度培养，冻千 s t u d i e so nh i g h - - d e n s i t yc u l t i v a t i o na n df r e e z e - - d r y i n gp r o c e s so f a b s t r a c t b 胡d o b a c t e t 4 i w ni sak i n do fi m p o r t a n ti n h a b i t a n tb a c t e r i ai ni n t e s t i n a lt r a c t so fh u m a n i th a sa 1 0 to fb i o l o g i c a lf u n c t i o ns u c ha s p r e v e n t i n ga n dc u r i n gi n t e s t i n ei l f f c c t i o n m o d u l a t i o no ft h e i m m u n o l o g i c a lr e s p o n s ee n da n t i t u m o u r i th a sd i r e c tb e n e f i c i a le f f e c t so ni n t e s t i n a lh e a l t h 占驴d o b a c t e r i u mi sw i d e l yu s e do nf o o d sa n dm i c r o e c o l o g i e a lm e d i c i n e s h o w e v e r ，b 咖d o b a c t e r i u m i sak i n do fs t r i c te n a e r o b i cb a c t e r i aa n dn e e d sr i g o r o u sc u l t u r ec o n d i t i o n i ti sh a r dt og e th i g hv i a b l e c o u n td u r i n gf e r m e n t a t i o nw h i c hr e s t r i c t st h ee x p l o i t u r ea n da p p l i c a t i o no f b i f i d o b a c t e r i ap r o d u c t i o n ， a tt h i sr e s e a r c h ，h i g hd e n s i t yc e i l sw a sg o tv i af e d - b a t c hc u l t i v a t i o na n dt h ef r e e z e d r y i n gt e c h n o l o g i c c o n d i t i o nw a ss c f e e n 。do u t t h em a 西c o n t e n t sa n dc o n c l u d e s ；a sf o l l o w s ： l h i g h e rl i v i n gc e l l sa m o u n tw a sg o tv i a 曰斫d o b a c t e r i aa d o l e s c e n t i sf e d - b a t c hh i g hd e n s i t y c u l t u r e o nf i l eb a s eo fs t u d y i n gb i f i d o b a c t e r i aa d o l e s c e n t i sb a t c hc u l t u r e ，f e r m e n t a t i o nb r o t hp hv a l u e w a sm o d u l a t e db ya d d i n gl y ea n dg l u c o s ew a sa d d e di n t of e r m e n t a t i o nb r o t hi no r d e rt oe l i m i n a t et h e r e s t r a i no fc a r b o ns 0 1 u c es c a r c i t yw h i c hp r o l o n g e dl o g a r i t h m i cp h a g ea n di n c r e a s e dm a xv i a b l ec o u r t c e l lc o n c e n t r a t i o nc a m et ot h em a x i m u ma n db t f i d o b a c t e t i aa d o l e s c e n t i sh i g h - d e n s i t yc u l t u r ec a m e t r u el o g a r i t h m i cp h a s eo fh i g h d e n s i t yc u l t u r ep r o l o n g e d8h o u r sf r o m6t o1 4m a xv i a b l ec o u n t i n c r e a s e df r o m39 x1 0 8c f u m lt o4 6 x 1 0 9 c f t t m l m o r et h a n1 08t i m e s 2t h et e c h n o l o g i cc o n d i t i o no fb i f i d o b a c t e r i aa d o l e s c e n t , sf e n u e n t e rl f i g h d e n s i t yc u l t u r ew a s a s o ：r t a i n e d 1 1 1 et e c h n o l o g i cc o n d i t i o no fb 沪d o b a c t e r mf e r m e n t e rh i g i l - d e n s i t yc u l t u r ew a sa s c e r t a i n e do n t h eb a s eo fs t u d y i n gf e r m e n t e rb a t c hc u l t u r ea n db o r i cf e d - b a t c hh i g h - d e n s i t yc u l t u r e t h e t e c h n o l o g i cc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w m e d i u mi n1 0l i t e rf b r m e n t e ra f t e rs t e r i l i z a t i o nw a s8l i t e r t h e o r i g i n a lp hv a l u ew a s7 0 n i t r o g e nw a su s e dt ok e e pt h ef e r m e n t e rp r e s s u r ea n dp r e s s u r ev a l u ew a s 0lm p at h ci n o c u h i ms i z ew a s5 a n dc u l t u r a lt e m p e r a t u r ew a s3 7 c h u r n n i n gr a t ew a s8 0 r m i n l y ew a sa d d e di n t of e r m e n t e rw h e np hv a l u ed r o p p e dt o57 6a f t e r6h o u r s c 山t i v a f i o nt h ep hv a l u e w a sk e p ta t6g l u c o s ew a sa d d e di n t of e r m e n t c rw h e nr e d u c i n gg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nd r o pt o4 ；l a f t e r1 0h o u r s c u l t i v a t i o n t h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a sk e p ta t4 - 6 9 ，l 6 2 0h o u r sw a s b i f i d o b a c t e r m sl o g a r i t h m i cp h a s e s t o p p i n gc u l t i v a t i o na tt h ee n do fl o g a r i f l u n i cp h a s ew h e nt h eo d v a l u eo f f e r m e n t a t i o nb r o t he a m et o23 3s e l e c tt h eb e s tt e c h n o l o g i cc o n d i t i o no ff r e e z e - f r e db i f i d o b a c t e r i aa d o l e s c e n t i s f e r m e n t a t i m tb r o t ha tt h ee n dl e g a r i f l n n i cp h a s ew a ss e l e c t e da sf e r t n e nr a t i o nb r o d it l t a tw a s u s e dt om a k ef r e e z e d r i e db i f i d o b a c t e r i a p o w d e r c e n t f i f u g a l ec o n d i t i o nw a s6 0 0 0 r m i na n d c e n h i f u g a t ct i m ew a s1 0m i n u t e s s u p e r n a t ew a sa b a n d o n e d2 0 n f mm a d1 s u g a ra n d4 m a m f i t o w a sa d d e dt ot h er e s tp a r to f c e n a f f u g a t ef e r m e n t a t i o nb r o t ht l em i x t u r ew a sp r e p a r i n gf o r f r e e z e - d r y i n gt h e t e c h n o l o g i cc o n d i t i o no f f r e e z e - d r y i n g w e r ea s f o l l o w sv a c u u m p r e s s u r e w a sl5 p a a n dc o l d t r a pt e m p e r a t u r ew a s 一4 59 c h e a t i n gm e t h o d w a ss h e l fh e a tc o n d u c t i o nh e a to f s a b l i m a t i m _ 1w a sc o n t r o l l e du n d e r 一5 a n dh e a to fr e s o l u t i o nw a se o n t r o l l e du u d e r2 0 p r e f r e e z e d r y i n gt e m p e r a t u r ew a s 一3 0 ca n dl i q u i dt h i c k n e s sw a s1 0 m mf r e e z e d r y i n gs u r v i v a l r a t ew a s7 3 a n dv i a b l ec o u n tw a s32 x 1 0 ”e f u gf r e e z e d r i e ds a m p l ew a se a s yt og e tw a t e ra n d w a t e rc o n t c u tw a sl e s st h a n2 k e yw o r d s ：b i f i d o b a e t e r i aa d o l e s c e n t l s ，h i g h - d e n s i t yc u l t u r e ，f r e e z e - d r y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也小包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：自吏签字目期：瑚6 年6 月馏日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用1 i 同方式在d - ；n 媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名白吏 铷躲t 舻魄 签字日期：功d 6 年f 月r 8 f t 签宁日期：柚川侈年矽月毯勺 ， 吉林农业大学硕士学位论文 青春双歧杆菌高密度培养方法及璩干：1 - 艺的碍r 究 1 1 双歧杆菌概述 1 前言 双歧杆菌( b 咖d o b a c t e r i u m ) 是1 8 9 9 年在法国巴斯德研究所由帝赛( t i s s e r h ) 博士首次从健康的母乳哺育婴儿的粪便中发现并分离出来，并：命名为b a c i l l u s b i f i d u sc o m m u i s ；1 9 1 9 年奥拉詹森( o f l a e n s e n ) 把它归到杆菌属，改为b a c t e r i u m b i f i d u m ；1 9 5 8 年日本的光冈知足等人口1 从双歧的形态和培养性状上提议独立设双歧 杆菌属；1 9 7 4 年正式确立了双歧杆菌属的分类体系。迄今为止已发现的双歧杆菌 有3 2 种1 3 1 ，其中分离自人体的有1 2 个种当前能够应用于益生菌制品生产的有5 个 种分别为婴儿双歧杆菌 i n y a n t i s ) 、短双歧杆菌佃b r e v e ) 、长双歧杆菌1 0 n g u m ) 、 青春双歧扦菌( b a d o l e s c e n t i s ) i 两歧双歧杆菌隰b f f i d u m ) 1 4 1 。 双歧杆菌细胞呈多样形态：y 字形、v 字形、弯曲状、刮勺状典型形态为分 叉杆菌，因而取名b i f i d u s ( 拉丁语原是分开、裂开之意) 1 5 i 。革兰氏染色阳性，亚甲 基蓝染色菌体着色不规则。无芽孢、鞭毛和荚膜，不运动。菌落光滑、凸圆、边缘 完整、乳白或白色并具有柔软的质地。营养要求苛刻，生长繁殖需多种双歧因子。 发酵葡萄糖通过果糖。6 磷酸支路生成摩尔比1 ：1 5 的乳酸和乙酸及少量甲酸，能 利用铵盐作为氮源，不还原硝酸盐。专性厌氧，在好氧条件下他们不能在平板培养 基上生k ，某些菌种在c o ：存在时能够增强对氧气的耐受性。过氧化氢酶反应阴性， 对氧的敏感性存在不同菌种或菌株的差异。最适生长温度3 5 4 1 ，最低生长温度 2 5 2 8 ，最高生长温度4 3 4 5 。起始生长最适p h 值65 70 ，p h 值4 5 以下或85 以上不生长，酸性环境( p h 55 ) 对菌体存活不利【6j 。d n a 的g + c 含量为摩尔分数 5 5 一6 7 f c r o c i a n i 等( 1 9 9 6 ) 报道的异形双歧杆菌i n o p i n a t u m ) 除外， 为 ( 4 5 土1 ) 1 。 1 2 双歧杆菌对人体生理功能 双歧杆菌是人体肠道内1 0 0 多种细菌中典型的对人体有益无害细菌，它与人的 生始终保持着和谐的共生关系，是健康个体肠道中的优势菌，其促进人体健康的 有益作用远远超过其它乳酸菌7 1 。婴儿出生后母乳喂养一周左右，肠道中双歧杆菌 占细菌总数9 2 ，非母乳喂养婴儿的只占2 0 以下。健康成年人肠道细菌_ 从中双歧 杆菌仅占i o 有【1 0 】。目前，尽管对双歧杆菌促进人体健康的功能性及其微生态调 吉林农业大学硕士学位论文 青春双歧轩苗高密度培养方法及冻二f 工艺的研究 节机制尚不完全r 解，但该菌的生物化学屏障、抑制致病菌和腐败菌、提供营养、 提高免疫力、抗肿瘤功能及其某些临床功效已充分肯定“1 。 12 1 生物与化学屏障功能 双歧杆菌在人体肠道中通过细胞壁磷壁酸与肠粘膜i ：皮细胞相互作用密切结合， 与其它厌氧菌一起有序地定植在肠粘膜表面，形成生物屏障，而其代谢产物一有机酸 和抗菌物质形成化学屏障，这在肠道微生态空间上构成定植阻力( 生物拮抗作用) ，阻 止r 致病菌和条件致病菌的定植和入侵。 双歧杆菌的代谢产物对致病菌具有很强的拮抗作用。体外试验表明，双歧杆菌可 抑制致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿浓杆菌、 变形杆菌及白色假丝酵母1 2 。13 1 “】。动物试验和临床观察也证实，双歧杆菌具有抑制 肠道腐败菌的作用【”。1 “。应用双歧杆菌制剂治疗急慢性腹泄、便秘、痢疾、肠炎等 肠道疾病已有许多成功的例证【1 21 6 。2 “。双歧杆菌可将i m o l 葡萄糖经果糖6 、磷酸支路 降解为1 m o i 乳酸和l5 m o l 乙酸及少量甲酸，通过产酸代谢，降低了环境p h 值，从而抑 制r 肠道中致病菌和腐败菌的生长1 7 “2 _ 4 16 】。各种有机酸的抑菌强度也存在很大差 异，如沙门氏菌生长的最低p h 值是：乙酸54 ，乳酸4 4 ，柠檬酸40 5 t ”i ，可见乙酸的 抑菌作用最强，乳酸次之。正是由j ：双歧杆菌能在人体肠道定植，而且其代谢产物乙 酸比乳酸抑菌效果更强，所以。目前普遍认为双歧杆菌比其它乳酸菌对促进人体健康 更为有益。 有些双歧杆菌菌种( 株) 可产生抗蘸物质。a n a n d 等( 1 9 8 3 ) 1 1 j 从两歧双歧杆菌的代 谢产物中分离出了称为“b i f i d i n ”的抗菌物质，可抑制金黄色葡萄球菌及黄色微球菌。 k a n g 等( 1 9 8 9 ) i 埔】从长双歧杆菌代谢产物中又分离出了称为“b i f i l o n g 的抗菌物质，对 大肠杆菌、沙门氏菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌均表现出抑菌活性。 双歧杆菌还可将胆囊分泌的结合态胆酸降解为游离态胆酸，增强了胆酸的抑菌效 果。而其它肠道正常菌群则无此功能p 。9 1 此外，双歧杆菌产生的胞夕 糖苷酶可降解肠粘膜上皮细胞的杂多糖，防 了潜在 的致病菌和细菌毒索与杂多糖结合而吸附于肠粘膜上，从而对宿主起到保护作用【9 1 。 122 营养功能 1 2 、2l 改善蛋白质代谢 n i s h i z a w a 等”1 研究发现，双歧杆菌产生的磷蛋白磷酸酶可将乳中a 酪蛋白降 解，有益于乳蛋白的吸收。另外，双歧杆菌对腐败菌的抑制作用，防止了因腐败菌分 吉林农业大学硕士学位论文青春双歧杆菌高密度培养方法及冻干工艺的目；究 解蛋白质、氨基酸生成氨、胺类、酚类、吲哚及硫化物等有害物质的可能，问接起到 阻止营养损失的作用。试验表明，肠道中双歧杆菌占优势时，粪氨浓度降低【i ”。肝病 患者生理上往往表现为血清中酚、胺、吲哚以及粪氨等内毒索含量高于正常人。临床 研究表明，患者服用双歧杆菌制剂后，可降低m 清中内毒素含量，恢复肝功指标，并 可预防内毒素协症和肝脑综合症的发生【2 1 l 。 1222 促进乳糖的消化吸收 乳中乳糖含量很商，为了能在肠道中有效地被吸收，乳糖需要在乳糖酶的作用下 水解成葡萄糖和半乳糖。几乎所有婴儿肠道内乳糖酶的活性都很高，然而大多数人在 3 5 岁之后乳糖酶活性降低9 0 一9 5 e ”。由于成年人肠道内缺乏乳糖酶，使乳糖在肠 道中积累，成为腐败菌的发酵基质，引起腹泄、腹胀、腹痛等症状，称为乳糖不耐症。 服用双歧杆菌制剂可明显改善乳糖不耐症l ”1 。目前认为，人体肠道内乳糖酶活性降低 由一个隐性基因控制，是人类生理中的止常模式。双歧杆菌在人体肠道内可产生乳糖 酶一1 3 半乳糖苷酶，促进机体对乳糖的消化吸收1 2 。 12 23 提供维生素 研究表明，每克双歧杆菌干细胞含v b i1 0 0m g 、v b 225 m g ；每升培养液中其胞 外代谢物含v b l2 5 2 5 0 r a g 、v b 2 1 0r a g 、v b 61 0 0 m g 、v b l 20 , 0 6 b g 、尼克酸4 0 0 “g 、叶 酸2 5 9 9 ”j 。可以想象， 双歧杆菌在肠道定植以后如同无数个微小的生物工厂，源源 不断地为人体制造m 必需的b 族及其它维生素。成人肠道中硫氨素裂解杆菌( b a c i l l u s t h i a m i n o l y t i c u s ) 可分解v b l 丽引起人体v b l 缺乏症，口服v b l 无效，但双歧杆菌可抑 制此菌生长，而且所产生的v b l 能有效地被人体利用【l 。 1 2 24 促进钙、铁离子及v d 的吸收 双歧杆菌在人体肠道中产生的有机酸司降低环境p n 值平1 e h 值，有利于二价钙、 铁离了及v d 的吸收。无菌动物试验表明，其肠道中p h 值和e h 值较高，f e ”易氧化为 f e 3 + ， 很容易发生低血色素性贫血【9 】。 1 23 提高免疫力，增强抗肿瘤、抗衰老功能 动物试验证实，摄入双歧杆菌制剂，方面可激活血清中超氧化物歧化酶 ( s o d ) ，消除氧化自由基【2 4 】：另一方面可提高机体抗体水平，激活巨噬细胞吞噬活 性，提高机体抗感染能力幢2 1 。这对于预防、抑制、杀灭肿瘤细胞和延缓机体衰 老具有重要作用。 机体正常情况下吸入的氧9 8 通过氧化产乍能源供体，但有2 的氧通过单价还 原产生超氧离子自由基。f 1 前，普遍认为，自由基通过细胞膜多不饱和脂肪酸、d n a 核苷酸和蛋白质的巯键反虑，引起组织受损，导致机体衰老和癌基因表达。体内消除 吉林农业大学硕士学位论文 青春双歧杆菌商密度培养方法及冻干工艺的研究 自由基的抗氧化剂有2 大类：一类是预防性抗氧化剂，包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、 过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - - p x ) n 谷咣甘肽转移酶：另类是裂解 性抗氧化剂，包括谷胱甘肽( g s h ) 、v c 、辅酶q 、b 一胡萝h 素、一生育酚等。最近 的项动物试验表明，小鼠内服双歧杆菌u 服液后，血清中s o d 活性显著提高，自由 基的分解产物丙二醛浓度明显下降 2 。 应用动物模型研究双歧杆菌抑制肿瘤细胞的报道已有很多，然而人体临床治疗力 面的研究尚未报道。关于双歧杆菌的抗癌机理，一些学者进行了积极的探索，但仍术 形成定论。康自【”i 、段伟力1 2 6 i 研究发现，双歧杆菌表现抑制癌细胞的同时，被试小 鼠腹腔巨噬细胞活性明显提高。郑仁恕等证实i j ， 小鼠腹腔巨噬细胞内重要的融酶 体酶一酸性磷酸酶含量提高显著， 而酸性磷酸酶是巨噬细胞激活的客观指标。金世 琳则指出f ”i ，双歧杆菌细胞壁肽聚糖在适宜条件下呈现免疫原性，增强了体液性免 疫应答，提高了机体的抗体水平，激活了巨噬细胞吞噬活性，从而可抑制肿瘤细胞 的增殖。 双歧杆菌通过抑制产致癌因子的腐败菡，对于预防肿瘤发生具有重要作用。肠 杆菌、拟杆菌、梭菌产生的脱氨酶可使氨基酸脱氨，当肠道中芳香族氨基酸( 如苯丙 氨酸、酪氨酸) 过多时，则为芳香亚硝胺生成提供了前体物质：由上述3 种细菌产生的 b 半乳糖苷酶则是许多致癌物生成的关键酶【1 9 1 。卵磷脂i 州生梭菌，如丁酸梭菌、副 腐败梭菌具有环上脱氢作用，这是胆酸转化为致癌物的重要反应，如果过多摄入脂 肪则刺激胆囊分泌较多胆酸【。尽管如此， 当肠道中双歧卡f 菌占优势时，这些致癌 因子可被消除。b e n n o 等1 1 6 1 临床试验表明，受试者每日e l 服长双歧杆菌制剂3 次，每 次l g ( 22 1 0 95 0 1 0 9c t u g ) ，5 周后其粪便中卵磷脂阴性梭菌和拟杆菌活菌数以及p h 值、氨浓度、o 一半乳糖苷酶活性均显著降低。 1 3 双歧杆菌微生态制品开发应用现状 基于双歧杆菌的重要生理功能和人体健康的关系，国内外研究者相继开发出多种 双歧杆菌食品和微生态药品用于保健功能和治疗各种因素引起的肠道菌群失调【2 “ 3 0 1 。 1 3 1 双歧杆菌在功能性食品中的应用 双歧杆菌住食品中的应用很大程度上趋向r 具有保健效果的食物和饮料。基r 商 、i k 需求，各种昧美可口的双歧杆菌产品大帚诞生，随着双歧杆菌产品口趋增多的益生 作用的报道，产品越来越多，大多数产品都是双歧杆菌和其它乳酸菌的混合培养物。 4 吉林农业大学硕士学位论文 青春双歧杆菌高密度培养方法1 ：蹙球干工艺的研究 最早的双歧杆菌产品是双歧乳，另外还包括酸性稀奶油、酪乳、酸奶、奶粉、以及冷 冻甜点等 3 i l 。 在f _ i 本，第一个双歧杆菌制品是由m o r i n a g em i l ki n d u s t r y 公司于1 9 7 1 年开发 的，此产晶是一种发酵乳制品，含有长双歧杆菌和嗜热链球菌，产品的全面开发始 于1 9 7 7 年，m o r i n a g e 丌发了家庭型双歧村菌乳，这种，。品是低脂鲜牛乳制品，含 有1 07 c f u m l 的长双歧杆蒲和1 07 c f u m l 的嗜酸乳杆菌。1 9 7 8 年，y a k u l t 公司开发 了双歧杆菌液体酸奶，称作m i l ，m i l t ”，双歧杆菌含量为1 0 6 c f u m l ，在市场上被称 为“智慧酸奶”。所用的菌株包括短双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌。第二年 m o r i n a g e 又开发了凝同型双歧杆菌酸奶。目前，在日本含双歧杆菌的制品非常盛行， 所有大的乳品企业都销售这样的产品。日本1 9 9 0 年酸奶的销售量几乎是过去十年 的两倍，含有双歧杆菌的酸奶大约占整个酸奶的三分之一f 2 】。在欧美等国，双歧杆 荫乳制品同样占有相当多的市场。美国所生产的益生菌产品含有嗜酸乳杆菌、双歧 杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等菌种。 在我国，虽然对双歧秆菌的研究比较热，但产品开发却不多，我国双歧杆菌乳 制品的发展相对缓慢，9 0 年代才开始双歧杆菌酸奶的研究，丰要是普通双歧杆菌酸 奶和特色双歧杆菌酸奶i ”3 ”。最近几年，我国乳品行业迅速发展，发酵乳制品的绝 对产量也相应提高，目前我国的酸奶市场占整个乳制品市场份额的1 5 左右，其中 使用包括双歧杆菌在内的“益生菌”的乳饮品将近5 。其中，伊利集团推出了含有 双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的“a b ”系列优品酪乳酸牛奶、大果粒酸奶和各种原味、果粒 酸乳。：i = 元集团也推出了“益菌多酸牛奶”，蒙牛集团称其使用的菌种是由丹麦科汉 森有限公司专门针对中国人的饮食和体质特点研发、并授予蒙牛独家使用的“l a b s 益生菌群”。光明乳业公司也称其“e + 益生菌酸牛奶”是与丹麦丹尼斯克集团合作的 产品，具有“菌株纯正、活性强、更健康”的特点。各家乳品巨头推出的“益生菌”酸 牛奶是在传统的酸奶( 菌种为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌) 基础上，多添加了另 外两种菌类嗜酸乳杆菌和双歧杆菌，这两种酸奶的产品种类、营养成分、产品标准 号均完全相同。由此可见，双歧杆菌在发酵乳制品中的添加和应用的比例将逐渐增 加。中国奶业协会有关统计数据显示，我国益生酸奶目前正以每年2 5 的速度递增， 可以预见的是，未来5 年内还将保持高速发展的势头。 生产高质量的双歧杆菌酸奶，不仅仅是风味和感官性状问题，最重要和关键的是 双歧杆菌的生长和存活。在日本，发酵乳和乳酸菌饮料委员会己经制定了标准，根据 这t 标准，1 0 7 c f u m l 是评定此类产+ 品的最低标准。影响其生长和存活的因素包括：乳 同体含量、p h 值、氧气、贮存温度、糖的存在及含量、培养条件、产品的生产条件 等。这使得在生产此类产品时，需要技术、知谚 和高级工艺的密切配合才能达到生产： 吉林农业大学硕士学位论文 青春双歧杆菌高密度培希方法及j 末彳工艺的母| 究 高质量产品的目的。目前我国在这方面的技术与发达国家相比，还有一定差距，凶此 使得这种产品与幽外同类产品相比，仍处于落后地位。由此可咀看出，理论上让各种 加工条件刈其生长和存活的影响，技术j 二寻求新的突破口是十分重要的。 】32 双歧杆菌在微生态制剂中的应用 双歧杆菌微生态制剂方面，从广义上讲可为三类，一类是益生菌制剂。双歧杆 菌活菌制剂又可分为单( 丽珠肠乐、回春生) 及复合( 培菲康、金双歧等) 2 种类型 i 3 4 j ，丽珠肠乐活菌为青春双歧杆菌。每粒o3 5 9 ，活菌数l ，4 1 0 c f i j g ；培菲康由双 歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌三种对人体有益的肠道f 司有菌群组成；金双歧，以长 双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌制成片剂，每片0 5 9 ，长双歧杆菌活菌1 1 0 8 c f u ，g ，保j j n 平| j 业乳杆菌和嗜热链球菌活菌均不应低于l 1 0 7 c f u 幢。复合双歧杆菌微 生态制荆中除了占主导的双歧杆菌外，还含有其他一些人体有益菌，例乳酸杆菌、 肠球菌、酵母菌等口”。生产、销售复合双歧杆菌微生态制剂目的主要源自于2 个方面， 、足复合菌种在人体微生态环境中具有较大的缓冲能力和环境适应能力，可以帮助双 歧杆菌迅速在肠道中定殖发挥生理作用。同时，利用各组成菌的不同生理、生化特 性，可使复合微生态制剂在减少肠内有毒物质的积累、补充营养成份、促进人体消 化等方面发挥协同作用：二是利用菌间的互生作用，使双歧杆菌制品的生产过程易 卜进行，产品风味得以提高1 3 。 另一类是益生素制剂，含有能促进入体肠道内双歧杆菌生长物质郎所谓“双歧因 子”的产品双歧凶子制剂由于不含双歧杆菌活菌，其生产、保藏、运输、销售等过 程均无特殊严格要求，而且成本低廉，但应用效果必须是在人体肠道中具有一定数 罱的双歧杆菌的基础上才能显示出来。 第三类为合生元制剂，这类产品中含有活性益生菌和增殖因子，例如广州合生元 生物制品有限公司推出的“法国合生元益生菌”，所含活菌为嗜酸乳杆菌、婴儿双歧 杆菌、两歧双歧杆菌，增殖因子为低聚果糖，另外添加麦芽糊精和香兰素，活菌含量 33 1 0 f u g ；肠内革命牌裂歧益生菌片，主要成分为低聚异麦芽糖、长双歧杆菌、 脱脂奶粉。双歧杆菌活菌制剂做为对人体肠道双歧杆菌的直接补充， 比单纯服用双 歧因子制剂效果更加显著。 双歧杆菌具有对营养要求苛刻、专性厌氧、对酸敏感等特殊的生物学性状， 其 活菌制剂的保藏极为困难，保藏期太短，尤其是液态制剂。如国内外大部分双歧 t 菌液态制剂，在不采取仟何技术措施的条件下，活菌保藏期( 活菌数l 1 0 6c f u m l l l 2 1 ) 只有7 d 左右，所以，延长活菌保藏期是目前双歧杆菌活菌制剂研制与开 发的技术关键问题。，舣歧杆菌活菌制剂的保藏技术，只前已丌始受到关注并取搿可喜 6 吉林农业大学硕士学位论文青春双歧杆菌高密度培养方法及球干工艺的研究 进展，但基础研究工作仍很薄弱，某些研究领域刚刚起步，有待深入和完善。 1 4 双岐杆菌生长特性及高密度培养技术研究 14 1 双歧杆菌培养特性 舣歧杆菌是严格厌氧菌，生长培养条件苛刻，营养要求严格，菌体生长过程受 较多因素影响，主要有氧气、p h 值、培养基成分、代谢产物等。 141 1 厌氧的特性 动物体内分离得到的双歧杆菌是专性厌氧菌，经过耐氧驯化可以变得微需氧1 3 “ 3 9 1 。氧气的存在4 i 利于于双歧杆菌生长，但厌氧机理仍未有完全的定论”，但 b a l l o n g u e 【4 ”研究的厌氧机理能比较正确的反映双歧杆菌厌氧机理，该结论主要是双 歧杆菌杆菌细胞内缺乏超氧化歧化酶( s o d ) 和过氧化氢酶( c a t ) ，在有氧条件下无法 把代谢产生的过氧化氢分解为水，而过氧化氢对碳水化合物代谢体系中的f 6 p p k 的 活性有不可逆的抑制作用。解除氧气的抑制作用主要是厌氧培养技术的改进和对降低 培养基氧化还原电位的研究，y o l a n d a n e b r a 对l 半胱氨酸和亚硫酸盐研究表明，在 培养綦巾添加这些物质可以降低氧气的抑制作用1 4 ”。 l4i2 代谢产酸对自身生长的抑制 双歧杆菌发酵葡萄糖通过果糖一6 磷酸支路生成摩尔l h l ：15 的乳酸和乙酸及少 量甲酸，随着产物中h + 浓度增加，p h 值逐渐降低，细胞生长速度变缓或停止。培养 基中h + 的积累会在细胞膜内外形成质子传递链，而质子传递是消耗能量的，厌氧菌 本身就比好氧菌难取得能量，所以h 十积累不利于菌体生长；质子传递还会导致有机酸 在细胞内积累，也不利于生长。在p h 对菌体细胞生长影响的研究过程中，还提出了 细胞内p h ( p h i n ) 对菌体生长影响的理论【4 3 i 。p h i n 改变是菌特有的性质，环境p h 降 低，细胞内p h 也快速下降，即环境p h 降低对微生物生长影响激烈，生长速度大，对 酸耐受性也大。反之，对酸耐受性小。双歧杆菌生长过程中，p h i n 是细胞生长关键， 凼为双歧杆菌生长代谢关键酶f 6 p p k 最适p h 值为6 0 【4 4 “4 6 。而且质子传递到细胞 膜外最小p h 值为40 ，p h i n 缓慢变化有利于二茵体生妖。所以，h + 是抑制菌体生长的主 要原因，胞内p h 的变化速度反映菌的耐酸性，虽然环境p h 变化对于菌体生长影响不 显著，但环境d h 的变化会引起p n i n 变化，而p h i n 构微小变化就会导致大多数代谢反 腑速度发生显著变化1 4 。同时营养成分的运输和代谢、蛋白质的合成、糖的分解、核 酸的合成可能郜受p h i n 的控制和影响h 。 1 4 1 3 双岐杆菌对培养基中营养成分的需求 培养基成分对双歧杆菌生长影响的较大，这方i 酬研究比较成熟，特男4 是对碳源和 7 吉林农业大学硕士学位论文青春双歧杆菌高密度培养方法及冻干1 艺的研究 氮源的优化。目前双歧杆菌扛要培养基中碳源一般由葡萄糖提供，氮源一般有胰蛋门 胨、蛋白胨、酵母抽提物提供。对双歧杆菌在不同糖源下生长特性的研究中发现i ”l ： 在葡萄糖为碳源的培养基中比生长速二# 、细胞浓度和产物都很高，而培养基碳源为乳 糖时，菌体生长速度和细胞浓度都较低。z a o l a t 5 0 l 刘- f 氐浓度下，碳源和氮源是否是生 长限制性因了进行了研究，结果表明，葡萄糖不是生k 限制性因子，而氮源，特别是 酵母抽提物是生长限制性因子。邹芳勤1 5 1 i 在剥双歧杆菌抑制因素研究中发现，双歧杆 菌进入死亡期胰蛋白胨、葡萄糖、酵母抽提物浓度分别大于4m g m l 、4 m g m l 、3 m g 堋l ，不是双歧杆菌生长抑制因素。培养基中酵母抽提物和l 半胱氨酸盐酸是双 歧杆菌生长最显著影响因素，胰蛋白胨和吐温一8 0 也是显著影响因素。但在双歧杆菌 生长过程中，l 一半胱氨酸盐酸盐、吐温8 0 不是底物，所以其浓度变化不大，只要保 证其初始浓度对双歧杆菌生长最好即可。 l41 3 生长因子对双歧杆菌的促生长作用 双歧杆菌生长促进因子，是一大类结构和性质各不相同的、能够促进双歧杆菌增 殖的物质。殿歧因子制品的生产、保藏、运输、销售等过程均无特殊严格要求，而且 成本低廉，但其应用效果必须在人体肠道中具有一定数量的双歧杆菌的基础上，才能 表现出来脚1 。 ( 1 ) 低聚糖类双歧因子 在双歧因子中，低聚糖类物质占主要部分，也是目前研究开发的重点。多数低聚 糖不被消化道吸收，直至大肠才被双歧杆菌及某些乳酸杆菌利用，因而具有独特的生 理功能。目前生要有低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、菊糖低聚糖、低聚异麦芽 糖、低聚木糖、低聚龙胆糖、低聚葡萄糖、魔芋低聚糖、琼脂低聚糖、乳果糖、甲壳 质低聚糖、帕拉金糖等，共2 0 余种【”1 。s a k a i 等发现，双歧杆菌在豆奶培养基中生长 时，水苏糖和蜜二糖优于蔗糖被消化吸收，而水苏糖和蜜二糖正是大豆低聚糖的主要 成分。英国剑桥临床营养中心的研究发现，通过菊糖低聚糖的体外发酵能力与一系列 参考的碳水化合物如葡萄糖等相比，以菊糖低聚糖为碳源对双歧杆菌有明显的促进作 用。 ( 2 ) 蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质 已知有许多能促进双歧杆菌生长的蛋白质水解产物及些蛋白质类物质，如乳清 蛋白、乳铁蛋白、胃黏膜蛋白水解物、酪蛋白水解产物等1 5 3 “l 。在商业上，较便宜 的有酵母提取液、牛肉浸液、大豆胰蛋白酶水解产物等，其中酵母提取液最好。有研 究发现，从甜乳清水制备的糖多肽能促进双歧杆菌的生长。尤论是哪种蛋白水解物类， 它们均具有一个共同成分，即含硫的肽，如果它们的二：硫键被还原或烷基化则失去活 性。所以，这些物质对坝歧杆菌的生长促进活性与二硫键密切相关。 吉林农业大学硕士掌位论文青春烈歧杆菌高密度培养力法及冻干工艺的研究 ( 3 ) 多糖类双歧因子 双歧因子中的多糖类物质有菊糖、云芝多糖、褐藻硫酸多糖、胡萝h 中的含氮多 糖等【”i 。s h i nh s 等5 6 1 研究了两个商业双歧杆菌菌株( b f i 军 i b f 一2 ) 在含有低聚果糖、 低聚半乳糖和菊糖的复原脱脂乳中的生长。结果显小，当b f 1 和b f 2 在低聚果糖存在 时，生长促进和活性保存最大，其次是低聚半乳糖和菊糖。随着碳水化合物浓度的增 加，促进效果增加，在5 时虽高。 ( 4 ) 天然植物及中草药提取物类 在人们研究过的天然植物及其提取物中，茶叶中的茶多酚、人参中的人参皂苷、 五加科植物的提取物、魔芋水解液”7 1 、螺旋藻f 5 钔、海带等被证实有促进双歧杆菌 生长的作用。田洪涛等研究发现，在培养基中加入1 魔芋水解液，两歧双歧杆菌经 3 7 。c 培养1 8 h 后，活菌数量增殖了1 7 81 0 倍，而对照培养基只增殖了2 2 1 4 倍，活菌增 殖量较对照提高了78 5 倍。 ( 5 ) 短链脂肪酸类和其它类 短链脂肪酸类物质有费氏丙酸杆菌产生的丙酸盐( 酯) 等，其它的还有n 乙酰葡 萄糖胺及其糖类、泛酰巯基乙胺等。 14 2 双歧杆菌高密度培养技术研究 高密度培养技术( h i g hc e l l d e n s i t yc u l t u r e ) ，也就是高密度发酵技术，由于各个菌 种所能达到的最高菌体浓度相差较大，目前的文献中并没有对高密度培养有确切的定 义。一般来说，高密度培养是指应用一定的