（发酵工程专业论文）高温放线菌纤维素酶的研究.pdf

亡重盘芏塑生焦亟圭壶墨蕉塑蓝茎笙盔釜盟壁宝皇全盘堂皇蕉查芏匿 高温放线菌纤维素酶的研究 摘要 纤维素是自然界中存在最广泛的一类有机化合物，也是地球上储量最 大的可再生资源。目前，自然界中的纤维素资源只有很少一部分得到了有 效利用，绝大多数被浪费掉，并在一定程度上造成了环境污染。 本实验采用高温培养，从牛粪和堆肥中筛选到5 株产高温纤维素酶的 微生物。选择其中一株在伽c 平板上生长较好，且产酶较高的菌株作为实 验菌株，命名为g p l l 。g p l l 是一株g + 好氧放线菌。经1 6 sr d n a 分子鉴定 和生理生化特征鉴定，g p l l 属于t h e r m o b i f i d af u s c a 种，与t h e r m o b i f i d a f u s c ay x 亲缘关系最近，初步命名为t h e r m o b i f i d af u s c ag p l i 。 t h e r m o b i w d af u s c ag p l i 所产纤维素酶具有c x 酶、c 1 酶和b 一葡萄 糖苷酶活性。为了提高t h e r m o b i f i d af u s c ag p l1 的产酶能力，本实验对 g p l ，产纤维素酶的产酶培养基和发酵产酶条件进行了优化，通过优化， t h e r m o b i f i d af u s c ag p l i 产纤维素酶的最适培养基为： 蔗渣粉1 3 酵母膏3 0 9 6 n a c l0 8 m g s o 0 0 5 k h 。p 0 4 06 c a c iz0 0 1 p h7 5 。 最佳发酵条件为： 装液量6 0 1 1 1 1 2 5 0 m l ( 或1 2 0 m l 5 0 0 i i i i i ) ，接种量1 2 _ 1 6 ，6 5 ，2 0 0r m i n ， 发酵5 0h 。 在该条件下所产纤维素酶的酶活为：c x 酶，1 0 1i u m l ；c 1 酶，0 0 5 6 r 亡壹墨生塑圭茎焦逢蛊壶墨垫璺堇红箜盘薹鳢壁裳垒全盘堂盏塾查芏堕 i u b l ；b 一葡萄糖苷酶，0 6 0i u m l 。 通过对t h e r m o b i f i d af u s c ao p l ，所产纤维素酶的酶学性质的研究可 知，其最适作用温度和p h 分别为：c x 酶，t 。= 6 5 ，p h i = 6 5 ；c 1 酶， t o 。= 6 0 ，p h i = 7 0 ；b 一葡萄糖苷酶，t m = 7 0 ，p h t = 5 5 。上述结 果表明，t h e r m o b i f i d af u $ c ab p l ，所产纤维素酶是高温纤维素酶。 纤维素资源的有效降解是一个迫切需要解决的世界性问题，此问题的解 决将会推动纤维素资源利用的可持续发展。现在，对于纤维素的微生物降 解，微生物所产纤维素酶量还远远不够，需要进一步研究。 关键词：高温纤维素酶高温放线菌酶学特性发酵优化正交试验 s t u d yo fc e l l i a s ep r o d u c r e db y c e ii u i o s ei st h om o s ta b u n d a n to r g a n i5t h om o s tr o n o w a b i ei e s o u r c ot h a ti sa v a i o n i ya f e w c o ii u l 0 s 8 l i f ou t iii z e de f f e c t i v e t h oe n vif o n m e n t c1 s wm a t e ri a l0 1 3 t h ee a t o h a n di t a b i ei ni a r g oq u a n t i t i e s p r e s e n t i y y 。m o s to ft h e ma r ew a s t e da n dp o ii u t e i nt h i sp a p e r f i v q1 1 1 i c r o o t g l l n is i m so r o d u e i n gt h o r m 0 1 ) h iii cc e ii u i l i s ow 8 5 5 c t e e r l o df r o mi l l a n u i - oo fe a t l ：ie c o m o o s ta n d5 0 i o n oo ft h e m ，w hie hc a r lg r o w b e t t o ra n dp r o d u e oi n o r ( c ei iuia s o0 1 3c _ cpia t oiss elo e t o df o rf u r l ：h e rr e s o l l c h a n dn m o dg p l l 6 p l li 5ag r a mo o s i t i v 6a o r o b i ca c t i n o m y c o t o 1 h e6 p l lw 8 5 i d e n t i f i e da c c o r d i n g c o t h ei d h y s i o l o g i c a ia n db i o e h o m i c a io r o l d o r t i e s a n dt h e 1 6 5r 1 ) l t s e c i t l e n c ea n ds y s l ：e n u t t i e8 r i l l l y s i 5 i ty i i sm o s ts ir n ii a r c ot h o r m o b i f i d a 枷蹦a n dw a si n i t i a i | yd o f i n e d8 st h o r m o b i f i d a 觚甜( i p l ， t h ec e il l j i a s eo r o d u c e d5 y7 h o r n o b i f i d a ，h s g p i _ ，c 0 1 1 $ i s t e do fc x 0 1a n d 1 3 - g l u c o s i d a s e i no r d e r t oi m o r o v et h ec o i i u i a s ep r o d u c t i o no f7 加r m o b i f i d a 借c 萱l ，t h er n o dii i i i ic o l n p o n e n t sa n df e r m o n t a ti0 1 3c o n ditio i l so ft h ol ：h r e e o n z y r n e sw t j t 8o p c i m i z o d a f t e ro p t ir n i z a t i o r l t h eo p t i m a in e d i i j n $ i s ： s u g a r c a n eb a g a s s oo o w d 6 r1 3 y e a s to x t r a c t3 0 n a c l0 蹦m g $ 0 40 0 5 k h 2 p o 0 6 c a c i2o 0 1 p h7 5 。 l h oo l ， c i w if e r r n o n t a t i 0 1 1c o n d i t i o i l si s ： l i a u i dv o i u 咐6 0m l 2 5 0m l ( o r1 2 0m l 5 0 0m 1 ) ，i i n o c l i i a t i o r l1 2 ，6 5 ， 2 0 0r r n i n ，5 0h ： t h eo r z y m ea c t i v i l ：ya p t o ro p t i m i z a t i o na r e c h a t ：c x ，1 0 1i i i , 1 1 ：c 1 0 0 5 8 亡重盘堂亟茎焦熊塞焘垦蕉璧董笠箜盘蔓鱼壁塞生全盘茎兰选垄茎堕 i u m i ：b g i u c o s i d a s e 0 6 0i u m i a c c o r d i n gt ot h es t u d i e so ft h e ire n z y m e i o g yp r o p e r t i e s t h e iro p t i m a i t e m p e r a t u r ea n do p t i m a lp hw e r e ：c x t m = 6 5 p h m = 6 5 ：c l ，t o n = 6 0 p h m = 7 0 ：b g l u c o s i d a s e t = 7 0 ，p hm = 5 5 t h er e s u i t ss h o w e dt h a tt h e c e ii u i a s ap r o d u c e db yt h e r m o b i f i d ef u s e eg p l ，w e r et h e r m o p h iii cc a i l u i a s e t h ee f f e c t i v ed e g r a d s t i o no fc o ii u i o s eisaw o r i dp r o b i 鲫n e e dt ob es o i v e d i t ss o i u t i o r ) c a np r o m o t et h ed o v e i o p m e n to fs u s t a i n a b i ad e v e i o p m e n t p r e s e n t i y ， t h ep r o d u c t i o no fc e ii u i a s ep r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m si sf a rm o r ea b u n d a n t a c c o r d i n gt ot h ec c ii u i o s e a n dt h i sn e e dt ob es t u d i e df u r t h e r k e yw o r d s ：t h e r m o p h i l i cc e l l u l a s e ；t h e r m o a c t i n o m y c e s ；e n z y m o l o g yp r o p e r t i e s ； f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ；o r t h o g o n a lt e s t 亡重盎堂塑茔焦煎盍壶墨塾垡苴堑笙盍箜鳢盟宝垒全盘茔量基盔堂基 第一章前言 1 引言 纤维素是地球上由植物光合作用产生的含量最多的多糖类物质，是自然界中储量 最丰富的天然物质。纤维素类资源具有来源丰富，品种多，再生时间短等优点。我国纤 维素类可再生资源非常丰富，但是除部分用于造纸、建筑、纺织等行业外，大部分未能 被有效利用，有些还造成环境污染。 纤维素的化学结构早在1 9 3 0 年已经清楚。它是由b d - 葡萄糖以b 1 , 4 糖苷键连接 而成的直链状大分子，不形成螺旋构象，没有分支结构，易形成晶体。其分子聚合度变 化很大，一般在8 0 0 0 - - , 1 0 0 0 0 个葡萄糖残基左右。纤维素占植物含碳量的5 0 以上，是 地球上最丰富的有机化合物【1 】。纤维素分子间氢键和非共价键连接构成许多微纤丝，微 纤丝的排列是平行有序的，有一定规律性。纤维素是无色、无味的白色丝状物，不溶于 水、稀酸和有机溶剂1 2 1 。 纤维素比较稳定，不溶于水，但能够在产纤维素酶的微生物的作用下，被分解成 容易被有机体利用的，结构较为简单的糖类。因此，对纤维素的合理利用将有效地实现 资源再生，可以为农业、畜牧业、发酵工业及化学工业提供持续廉价的原料，同时可有 效的防治环境的污染，建立良性的生态系统，缓解资源危机，推动可持续发展【3 】。 2 纤维素酶的性质 2 1 纤维景酶的来源 纤维素酶是能够降解植物多糖一纤维素，生成小分子葡萄糖的一类酶的总称【4 ，5 1 。 纤维素酶来源广泛，原生动物、节肢动物、软体动物和昆虫等均能产生纤维素酶， 动物的瘤胃中有共生的纤维素分解菌和原生动物。在高等植物中也有纤维素酶，其作用 是使细胞壁松弛，与种子发芽、细胞生长有关。在微生物方面，细菌产生的纤维素酶的 量较低，主要是e g ，少数细菌能分泌外切葡聚糖酶，而且这些酶主要是胞内酶或是吸 附于细胞壁上，很少能分泌到胞外，增加了提纯的难度，在工业上很少采用。目前研究 】 亡鲎盘茔亟主茔焦鲎塞矗墨蕉塞苴堑箜盍蔓鳢叠塞垒全盘堂量蒸垄生匿 较多的是纤维素粘菌属、生孢纤维粘菌属、纤维杆菌和芽孢杆菌属。放线菌中的分枝杆 菌和原放线菌几乎不产纤维素酶或产量极低。产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌 ( a c t i n o m y c e sm e l a n o c y c l u s ) 、玫瑰色放线菌( a c t i n o m y c e sr o s e o d i a s t a t i c u s ) 和纤维放线菌 ( a c t i n o m y c e sc e l l u l o s a e ) 。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有 木霉属( t r i c h o d e m a ) 、曲霉属( a s p e r 副t t u s ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、p e l l i e n l a l i a 属和枝 顶孢霉属( 4 c r e m o n i u m ) 的菌株。其中尤以木霉属的产量居多里氏木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e l f ) 、康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 和绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 等是木霉属 中产酶酶活性较高的菌种，特别是绿色木霉及其近缘的菌株。真菌能够产生三类纤维素 酶，能分泌到菌体外，一般不聚集成多酶复合体，但相互发生强烈的协同作用。酵母虽 然不产纤维素酶，但可以利用酵母表达系统表达纤维素酶基因，其产物高度糖基化，经 正确加工修饰后可直接分泌到培养基，表达水平高。如酵母表达的c h b i i 、e gi 的产 量可达l o o m e c l 以上，并具有正常的生物学活性睁1 4 1 。表1 - 1 是常见的可降解纤维素的 微生物。 表1 - 1 常见的可降解纤维素的微生物类群 g r o u pm i c r o o r g a n i s m g r o u p m i c r o o r g a n i s m f u n g if u n g i t r i c h o d e r m ar e e s e i r h i z o p u s j a v a n i c u s t v i r i d e p y r i c u l a r i ao r y z a e t - k o n i n g i i c o r i o l u sv c r s i c o l o r t p s e u d o k o n i n g i i f o m e sf o m e n t a r i s t - h a f z i a n l l m h u m i i e o t ag r i s e a t 1 i g n o r u n p l e u r o t u so s t r e a t u s t 1 0 n g i b r a c h i a t u m p h y s a r u mp o l y c e h a l u m p e n i c i l l i u mc i t r i n u mp h o m ah i b e m i c a p f u n i c u l o s u mf u s a r i u mm o n i l i f o r m e p i r e n s i s h y p o c o p m m e r d a r i a p j a n t h i n e l l u mm y r o t h e e i u mv e r r u c a r i a p n o t a t u mb a c t e r i a p v a r i a b i l ac l o u s t r i d u ma e e t o b u t y l i u m 2 g r o u pm i c r o o r g a n i s mg r o u pm i c r o o r g a n i s m p v e r m c u l o s u mc 1 0 c h h e a d i i a s p e r g i l l u sn i g e rc 1 0 n g i s p o r u m a f l a v u s c t h e r m o c e l l u l m a f o e f i d u s c t h c r m o m o n o s p o m a f u m i g a t u s c t h e r m o c e l l u l a s e u m a o r y z a e c s t e r c o r a i u r n a s a i t o ip s c u d o m o n a sf l u o r e s c e n s a s o j a e r u m i n o c o e ) c u sa l b u s a t g r r e u sr f l a v e f a c i e n s a a c u l e a l u s c e l l v i b r i of u l v u s n e u r o s p o r ac u d s s ac g i l v u s h u m i c o l ai n s o l e a n s c v u l g a r i s m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a a c f i n o m y c e t e s m a c r o p h o m i n ap h a s e o l i n at h e r m o m o n o s p o r af h s c a m y c e l i o p h t o r ac e l l u l o p h i l u mt h e r m o m o n o s p o r ac u r v a t a p h a n c r o c h a c t ce h r y s o s p r o i u m m i e r o b i s p o r ab i s p o r a s c l a i z o p h y l l u mc o n l n l r l l es l r e p t o m y c e sv i r i d o s p o r u s s e l e r o t i n u mr o l f s i i 2 2 纤维素的降解 自然界中，纤维素能被许多真菌、细菌和放线菌等微生物降解。微生物破坏纤维素 有两种可能的方式，一种是先外部，再逐渐向内发展；另一种是由内向外破坏【1 6 1 。 细菌一般是粘在纤维素纤维上，从纤维的表面向内部增生，在接触点处纤维素被溶 解，使纤维表面呈锯齿蚀痕，被细菌破坏后的纤维，如果被某种溶液溶涨，则外观为伸 直纤维，很容易被分解。 霉菌对纤维素纤维的降解集中在纤维的端部，并不断生长，由内向外消化纤维素， 使纤维逐渐被分解破坏。 微生物降解纤维素释放出酶，再引起纤维素的酶降解。 3 亡受盘茎塑堂垡盈塞高墨蕉垡苴红箜盘蔓盟盟塞生全盘堂皇垫盔生堕 天然纤维素结构极其复杂，其分解是一个复杂的酶学过程。纤维素酶分解天然纤维 的先决条件需要酶与纤维素底物相互接触形成复合物，才能进一步发生酶解作用。天然 纤维以棉花和木纤维为典型，占主要成分的纤维素与其它细胞壁成分一起构成难溶于水 的紧密复杂的空间结构。这些细长的束状结构通过纤维素分子间的氢键相互作用，形成 次生壁当中的超分子微纤维。微纤维中纤维素分子之间呈不同平行程度的排列，有排列 整齐的结晶区和排列无规则的无定形区之分，这种结晶性是决定纤维素酶作用敏感性的 关键因素之一【1 7 , 1 5 。非结晶态纤维素分子由于氢键极少，酶易侵入，因而易水解；而晶 体状态的纤维素分子内及分子间的氢键极多，酶只能作用于微纤维的表面，且具有高度 的立体专一性，因而需要多种酶的参与。 2 3 纤维素酶的组成 国内外众多文献研究的纤维素酶主要是以霉菌产生的为主，对其中的酶组分、性质 结构以及作用机理探讨得比较清楚。已探明天然纤维素的降解是通过纤维素酶各组分的 协同作用来完成的，这些协同作用的纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶1 争蚓： ( 1 ) 内切葡聚糖酶( e n d o - 1 ，4 - 1 3 - d g l u c a n a 跎，e g ) 系统命名为1 , 4 - 1 3 d 葡聚糖葡聚糖水解酶( e c3 2 1 4 ) 。亦称内切纤维素酶、c x 酶 或c m c 酶。它优先水解底物的较小部分( 溶剂化的疏松末端) ，产生大量的低聚合度的 产物。同时e g 随机作用于纤维素分子的非结晶区，作用于较长的纤维素链，随机水解 b 1 , 4 糖苷键，将长链纤维素分子切短，产生大量具有非还原末端的小分子纤维素，为 c b h 提供新的作用区。e g 对末端键的敏感性比中间键小，主要产物是纤维糊精。能水 解溶解的纤维衍生物或酸膨胀和部分降解的纤维素，但不能单独作用于结晶的纤维素。 ( 2 ) 外切葡聚糖酶( e x o - 1 ，4 - b - d - g l u c a n a s c ，c b 均 存在比较广泛的为1 , 4 6 - d 葡聚糖纤维二糖水解酶( e c3 2 1 9 1 ) ，简称为纤维二糖 水解酶( c b h ) 、外切纤维素酶、c 1 酶。c b h 能从纤维素链的非还原端( 如里氏木霉的 c b h i i ) 或者还原端( 如里氏木霉的c b hi ) 一个一个地依次切下纤维二糖单位。单独 作用于天然结晶纤维素时酶活力比较低，但能同内切葡聚糖酶协同作用，彻底水解结晶 纤维素。 ( 3 ) b 葡聚糖苷酶( b - 1 , 4 - g l u c o s i d a ，b g ) 1 3 葡聚糖苷酶亦称纤维二糖酶( e c3 2 1 2 1 ) ，它能水解纤维二糖和短链地纤维寡糖 生成葡萄糖。纤维二糖和纤维三糖对c b h 与e g 由强烈地抑制作用，b g 将纤维二糖和 4 亡重盘茔塑堂焦盈童高墨蕉垡董堑箜盍蔓煎盈壅垒全盘茎盏垫垄壁堕 纤维三糖水解成葡萄糖，减弱抑制。b g 对纤维二糖和纤维三糖地水解很快，随着葡萄 糖聚合度的增加，水解速度下降，此酶专一性比较差。 这三类酶的协同作用，能将具有很强化学与生物抗性的天然纤维素大分子降解成简 单的葡萄糖。纤维素酶系的这种多组分协同效应与同样水解高分子多糖类底物的木质素 酶、溶菌酶等具有相似之处捌。 2 4 不同微生物来源纤维素酶的性质 不同来源的纤维素酶分子特征和催化活性都不尽相同。细菌产生的纤维素酶量少， 主要是内切酶，大多数多结晶纤维素没有活性，多数不能分泌到细菌细胞外，常常聚集 形成多酶复合体。真菌产生大量的纤维素酶，酶系全面，能分泌到菌体外，一般不聚集 成多酶复合体。纤维素酶分子的大小因来源不同而有明显差异，其变化范围很广。内切 酶分子量介于2 3 1 4 6k d a 之间，外切酶3 8 - 1 1 8k d a ，1 3 - 葡萄糖苷酶9 0 , - - 1 0 0k d a ( 胞 内酶) 和4 7 7 6k d a ( 胞外酶) 。但纤维粘菌内切型酶分子量小至6 3k d a ，蚕豆腐皮镰 胞的1 3 葡萄糖苷酶高达4 0 0k d a t 2 5 , 2 6 1 。 多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化。糖基与蛋白之间可以共价键结合，或 呈可解离的络合状态【2 刀。所含碳水化合物的比率不同很大程度上决定了酶的多形性，根 本上表现为分子量的差别。许多纤维素酶可在体内或体外被蛋白酶部分水解，有的水解 产物仍保持对可溶性底物的活性，但对结晶底物的活性明显下降或完全丧失。糖基化作 用对酶免受蛋白酶水解有一定的保护作用嗍。 2 5 纤维素酶的分子结构 1 9 8 6 年，嘣蝉【2 9 】用木瓜蛋白酶有限酶切t r i c h o d e r m ar e e s e i 的c b h1 分子得到 具有独立活性的两个结构域：一个是具有催化功能的催化域( c a t a l y t i cd o m a i n , c d ) ，另 一个是具有结合纤维素功能的纤维素结合( 吸附) 区( c e u u l a s eb i n d i n gd o m a i n , c b d ) ， 之后用类似的方法在多种细菌和真菌的纤维素酶中发现类似的结构。c b d 在纤维素酶 中位于氨基端或羧基端，它通过一段高度糖基化的l i n k e r 与催化区相连。纤维素酶分子 的结构模型见图1 1 。 5 图卜1 纤维素酶分子的结构模型o ” f i g l - it h em o d l eo f c e l l u l a s em o l e c u l e 整个酶分子呈楔形，球状核区表示了包含催化位点和底物结合位点的催化结构域( c a t a l y t i c d o m a i n ，c d ) ：a 代表纤维素结合结构域( c e ll u l a s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) ；b 代表了高度糖基化的 连接桥( l i n k e r ) 。 2 5 1 催化域的结构 尽管不同来源的纤维素酶分子量大小差别很大，但它们的催化区大小却基本一致， 催化域体现了催化活性及对特定水溶性底物的特异性。 里氏木霉的c b h i i 的催化域的三维结构表明，该催化域的活性部位是一个封闭的隧 道结构，仅能通过一个纤维素分子。有的纤维素酶不止有一个催化域。如来源于解糖热 解纤维菌( c a l d o c e l l u ms a c c h a r o l y h c a n ) 的c e l b ，在n 端有一个外切酶的催化域，在c 端有一个内切酶的催化域，而且，这两个催化域属于不同的属3 “。 2 5 2 结合区结构域 大多数c b d 位于酶蛋白的c 末端或n 末端，其主要功能是将酶分子连接到纤维素 上。c b d 的作用机理还不清楚，有人认为，c b d 是通过氢键稳定结合结晶底物的【3 2 j 3 1 。 2 5 3 连接区( l i n k e rd o m a i n l d ) 连接区主要是保持c d 和c b d 之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为 稳定的聚集体。由于纤维素酶全酶分子呈蝌蚪状，其连接区高度糖基化且具有较强的柔 韧性，所以很难得到结晶。 2 5 4 纤维素酶的三级结构 纤维素酶结晶结构的证据表明，同一族的酶分子遵循相同的机制，即水解葡萄糖苷 键通过一般的酸催化机制。与此相反，不同族的酶分子可能有不同的机制，并且可能有 不同的折叠模型酬。人们又根据同源性将纤维素酶分成九个族( a j ) t 3 5 1 。目前，已将 a - f 族的酶分子结晶结构进行了分析，它们的活性位点具有相似的拓扑结构性质跚，其 模型见图1 2 。 6 图1 - 2 卜f 旗纤维素酶分子折叠模型“。 f i 9 1 - 2t h ec e l t u l a s eo l e c u l ef o l d i n gc o n f i g u r a t i o no f a ff a m i l i e s 3 纤维素酶的应用 纤维素酶熊将纤维素转化为能够被直接利用的碳源釉能源，纤维素酶在医药、纺织、 莲震筵工、造纸、食鑫发簿、工黢洗涤、矮摹、石溪嚣采、凌拳处理及键辩笛壤壤都寿 应用，且其前浆十分广阔，专家预测，对纤维素酶的研究、开发、最l 用是研发可再生性 资源的关键，对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题都具肖十分重要的 意义。 3 。1 在食品中工数疑发簿蘸造串的应用 纤维素酶凌食晶工韭串应焉最梵广泛，禳秘毪农棒产菇是食晶麓王中靛主要原料， 恰当处理，可以达到提高细胞内禽物的提取率，改善食品质量，简化加工工艺和难度等 目的【3 7 3 引。 3 1 1 果蔬加工巾的应用 在采蔬攘王过程孛燕入终缝豢酶骰逶多处理，霉激搜毽壤缓织软强，羧喾溜感，餐 化工艺。当用纤维素酶处理菜些食物，如胡萝卜，甘兰、洋葱、马铃薯、海带等时，加 以缓慢的搅拌和振荡，许多植物性食物被显著地软化。纤维素酶可以用来敞化纤维质的 细胞壁，如酶处理过的胡萝卜在做胡萝h 浓汤时无需谶筛。酶处理期间，蔬菜的颜色不 了 亡重盘茔塑茔焦煎塞高墨蕉垡董筮箜盘箜煎盟塞生金盘堂皇垫查堂睦 变，而且浓汤的量有明显的增加 3 9 1 。 3 1 2 在发酵中的应用 纤维素酶可将纤维素降解生成可发酵性糖，因此，纤维素酶可在以粮食为原料的食 品发酵中广泛应用。发酵过程中所使用的酵母、细菌等微生物，许多不能直接利用纤维 素原料进行发酵，用纤维素酶对纤维素原料进行水解，得到的可发酵性糖可被微生物直 接发酵。 纤维素酶运用于制酒工业，可提高酒精和白酒的出酒率，在酒精工业上还可以降低 醪液的粘度。在以纤维素为原料进行酒精酿造时，先用纤维素酶处理原料生产葡萄糖， 再接种酿酒酵母进行发酵生产酒精，能大大促进纤维素的糖化，提高酒精产量。 k a t z 4 0 等利用纤维素酶处理纤维素得到3 0 的葡萄糖。g h o s e 4 1 1 等设计的纤维素酶 处理木质纤维素连续糖化法，能够直接得到浓度大于1 0 的葡萄糖液。 3 1 3 在活性物质提取中的应用 在提取蛋白质、淀粉、活性多糖等物质时，通过对植物细胞壁的水解作用，改变细 胞壁的通透性，提高了植物细胞内含物可消化性蛋白质、果汁及芳香油的提取率，并有 利于从海藻中提取琼脂；用纤维素酶处理大豆，可促使其脱皮，增加大豆蛋白质提取率， 亦可回收大豆渣中的蛋白质和油脂，用于淀粉制造，可缩短时间，增加得率h 2 】；用于柑 桔果汁加工，可促进汁液的提取和澄清；用于酱油酿造，可改善酱油质量，缩短生产周 期。 3 2 在饲料工业中的应用 在青贮饲料中添加纤维素酶制剂，使青贮饲料中纤维素、半纤维素和果胶等含量发 生变化，从而提高青贮饲料的营养价值。纤维素酶用作饲料添加剂，明显提高饲料消化 率和利用率，促进动物生长 4 3 , 4 4 。 纤维素酶作为饲料添加剂应用于养殖业，它的使用方法有体外酶解法和体内酶解法 两种。前者因为费工费时和成本较高的缺点而研究较少。后者相对简单易行，目前正被 研究者普遍采用，并先后对反刍兽、单胃动物( 肉鸡、蛋鸡、猪等) 进行了饲喂试验【4 5 1 。 有报导，在鸡饲料中添加0 2 的纤维素酶，可使鸡肉增重5 1 0 ，饲料效果改善3 - 7 4 6 。 3 3 在纺织工业中的应用 用于纺织工业中的商业纤维素酶通常是粗酶液，含有多种纤维素降解酶。商业纤维 素酶主要是由里氏木霉等真菌产生。 8 亡量盘茔塑茔焦盈叁壶墨筮垡蓝茎笙盘蔓鲍盟塞生全盘空墨蕉垄茎蹩 纤维素酶在纺织工业中的最广泛用途是用来代替水磨洗过程中的浮石，使牛仔服饰 具有仿旧的外观。纤维素酶通过去除织物表面的纤绒和毛球，降低起球倾向，增强柔软 度，也可用来改善纤维素织物的外观，纤维素酶也逐渐应用在家用洗涤产品上m 。 3 4 在洗涤剂工业中的应用 一般洗涤剂大多是碱性，近年来，碱性纤维素酶在洗涤剂工业上的应用改变了传统 的去污机制，在洗涤剂工业上得到了很好的评价，被认为是洗涤剂工业上的一次革命。 碱性纤维素酶可选择性地吸附在棉纤维地非结晶区，使棉纤维蓬松，水合纤维素分解， 胶状污垢脱落。由纤维绒毛所组成地非结晶区也是造成棉织物褪色、板结地原因，因此， 加有纤维素酶地洗涤剂不仅去污，还能起到使棉织物颜色鲜明和柔软的效果【4 8 】。 3 5 在环境保护和处理纤维废料中的应用 在工业、农业和生活废品中，纤维素所占比重很大。造纸、制糖等轻工业对环境污 染比较大。其废料经理化处理后易被酶解，利用纤维素酶处理这些废料可防治污染，又 可为其它行业提供原料。此外，利用纤维素酶水解秸秆、蔗渣等废料，能够生产乙醇、 甲醇等可燃性有机物，并可替代不可再生的石油等，解决能源问题，缓解环境危机【4 9 l 。 3 6 在地质钻井中的应用 纤维素酶在地质钻井中应用主要是在洗井上。旧的洗井方法需要专用设备，成本高， 费工费时，且不能彻底消除黏土对岩层的淤塞。 新的洗井方法是首先采用能起到与泥浆相似护壁的魔芋无黏土冲洗液钻井，然后， 将预溶的纤维素酶注入井内，经自然浸泡，在静压力下使淤塞在井壁内冲洗液中的魔芋 聚糖催化为单糖，快速恢复岩层的透水性能，从而完成洗井。 3 7 在植物体细胞杂交育种上的应用 植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素，用纤维素酶水解植物体细胞的细胞壁，制成 植物细胞原生质体，可增加其对外源遗传物质、细胞器、病毒、细菌等微生物的摄取， 为研究高等植物遗传转化和育种提供了较好的材料和实验系统。 4 课题研究意义 放线菌和细菌同属于原核微生物，但对其纤维素酶的研究还很少。 已知的纤维素酶其最适作用温度大多是在中温条件下，然而在高温条件下，酶促反 9 应相对低温较快，但也更容易使酶变性失活，高温纤维素酶可较好的解决酶在高温下剧 烈变性的问题，而且相对于中温酶，酶促反应较快，还可解决工业生产能耗大的问题， 从而为纤维素降解工业带来光明的前景。 5 课题研究内容 本文的研究主要包括一下几方面内容： 1 高温纤维素酶产生菌株的选育； 2 菌株生理生化和1 6 5r d n a 鉴定； 3 产酶培养基成分研究和发酵条件优化 4 粗酶液酶学性质研究 1 0 1 实验材料 第二章高温纤维素酶产生菌的筛选 1 1 菌种来源 广西大学农场牛粪堆肥和田土 1 2 试剂和药品 羧甲基纤维素钠( c m c - n a ) c p 、酵母膏b r 、牛肉膏b r 、蛋白胨b r 、 m g s 0 4 。7 h 2 0 a r 、n a c l a r 、k i - 1 2 p 0 4 a r 、n a 2 h p 0 4 a r 、n a o h a r 、结晶酚a r 、 酒石酸钾钠a r 、n a h s 0 3a r 3 ，5 二硝基水杨酸 国药集团化学试剂有限公司 琼脂粉 广东环凯微生物科技公司 刚果红 上海三爱思试剂有限公司 1 3 主要仪器和设备 ( 1 ) 隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂 ( 2 ) 7 2 1 型分光光度计上海第三分析仪器厂 ( 3 ) h s l 电热恒温水浴锅 上海医疗器械五厂 ( 4 ) y x q g 0 2 型电热式蒸汽灭菌器 山东新华医疗器械厂 ( 5 ) c s l 0 1 - 2 型电热鼓风干燥机 重庆实验设备厂 ( 6 ) 梅特勒电子天平 上海精密科学仪器有限公司 ( 7 ) d l - 8 r 冷冻离心机上海市离心机械研究所 ( 8 ) m o d e lj 2 - 2 1c e n t r i f u g eb e c k m a n 公司 ( 9 ) s w - c j - 1 f 超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 ( 1 0 ) p h s - - 2 5 型p h 计上海雷磁仪器厂 ( 11 ) r e - 5 2 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 ( 1 2 ) w - c j - i f 超净工作台 苏净集团安泰公司 ( 1 3 ) 超低温冰箱e l t - 1 3 u 8 5 v 2 9 ( 1 4 ) 3 2 0p hm e t e rm e t t l e rt o l e d o 1 1 ( 1 5 ) 高温摇床 2 方法与步骤 上海实验室设备有限公司 2 1 培养基 ( 1 ) 筛选培养基： k h 2 p 0 4o 5g ，m g s 0 40 0 5g ，c m c - n ao 5g ，酵母浸膏o 5g ，琼脂1 2g ，水1 0 0 0 n l l 。 ( 2 ) 分纯培养基： c m c - n a 2 0 9 ，蛋白胨5g ，酵母膏o 5g ，n a c l5g ，琼脂1 5g ，水1 0 0 0 “，p h 7 2 。 ( 3 ) 斜面培养基 c m c - n a l o g ，蛋白胨l og ，酵母膏5g ，牛肉膏5g ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 。 ( 4 ) 种子培养基： 蛋白胨1 0 9 ，酵母膏5g ，牛肉膏5g ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 。 ( 5 ) 发酵培养基： c m c - n a 2 0 9 ，蛋白胨1 0 9 ，酵母膏5g ，牛肉膏5g ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 。 培养基采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌条件为1 2 1 ，2 0r a i n 。 2 2 菌株的初筛 取土样1 0g ，加水1 0 0m l ，充分摇匀，将土样液稀释涂平板，于6 0 培养箱培养9 6 h 。平板用0 1 刚果红染液1 0m l 染色3 0m i l l ，再用蒸馏水洗涤2 次，最后用1m o v ln a c l 溶液1 0m l 脱色两次，每次2 0 r a i n ，挑取透明圈直径和菌体直径比值较大的菌分纯，作为 复筛出发菌株。 2 3 菌株的复筛 将出发菌株在斜面培养基中活化三天，接种于种子培养基中，6 0 ，2 0 0r r a i n 培 养3 0 h 后，以1 0 接种量接于发酵培养基中，6 0 发酵5 0 h 。发酵液在4 ，8 0 0 0r m i n 离心，除去菌体。所得粗酶液用d n s 法测酶活，将酶活较高的菌作为目的实验菌。 2 4 酶活测定方法3 5 - - 硝基水杨酸( d ) 比色定糖法 本实验采用酶将底物还原成葡萄糖，通过d n s 比色定糖法【5 川测定葡萄糖量，从而 测定酶活。 】2 亡受盘堂塑堂焦逢塞高墨蕉垡苴堑笙盘堕鲍叠宝皇全盘堂盏垫垄堂匿 2 4 1 原理 3 ，5 一二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基。当3 ，5 二硝 基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和 棕红色物质颜色深浅的程度呈一定比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。该方法 为半微量测糖法，操作简便，快速、杂质干扰少。 纤维素酶将纤维素水解成简单的还原糖，通过d n s 法测定还原糖的量，通过标准曲 线比对，所得还原糖量与酶活性成正比。 2 4 2 葡萄糖标准曲线的制定 葡萄糖标准液的配制：准确称取1 0 0m g 分析纯的无水葡萄糖( 预先在1 0 5 干燥 至恒重) ，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到1 0 0m l 容量瓶中，再定容到刻度，摇匀， 浓度为1 m g n d 。 取9 支洗净烘干的2 5m l 具塞刻度试管，编号后按表2 - 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏 水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后向各试管中加入1 5n dd n s 溶液， 摇匀后沸水浴5m i n ，取出冷却后用蒸馏水定容至2 5m l ，充分混匀。在5 2 0n l n 波长下， 以1 号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。 表2 - 1d n s 定糖法步骤 葡萄糖标准液( r i d ) 0 0 20 4 0 60 81 01 21 41 6 相当于葡萄糖量( r a g ) 0 0 2o 40 60 81 01 21 41 6 蒸馏水 2 01 81 61 4 1 21 0 0 8 0 6 0 4 将各管混合均匀，在沸水浴中加热5m i l l ，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每 管加入2 1 5m l 蒸馏水，摇匀。于5 2 0m 波长处测o d 值，见表2 2 。以葡萄糖毫克数 为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，所得葡萄糖标准曲线见图2 1 。 表2 - 2 d n s 定糖法结果 1 2 l 曼0 8 高0 6 誉0 4 o 0 2 o 00 2o 40 60 811 21 4 1 6 1 8 葡萄糖量( n a g ) 图2 - 1d n s 定糖法测定的葡萄糖标准曲线 f i 9 2 1s t a n d a r dc u r v eo f a b s o r b a n c et os u g a rc o n c e n t r a t i o n 该标准曲线的回归方程为：y = 0 6 4 4 9 x 0 0 3 9 1 ，相关系数r 2 = 0 9 9 9 3 2 5 纤维素酶活测定即酶活力计算 2 5 1 纤维素酶活测定方法 ( 1 ) 内切葡聚糖酶( c x ) 活性测定 以n a 2 h p 0 4 - k h 2 p 0 4 缓冲液( 1 1 5m o l l ，p h6 5 ) 配制1 o 的羧甲基纤维素( c m c - n a ) 底物溶液，取0 5n l l 适当稀释的粗酶液与2 0m l 底物溶液，7 0 保温3 0r a i n ，用d n s 法测 定反应后还原糖含量，同时做空白对照扣除本底。 酶活力单位定义为上述条件下