（细胞生物学专业论文）sry核酸免疫对小鼠性别决定的影响.pdf

摘要 哺乳动物的性别发育过程分为两步：第一步“性别决定”，由基因决定原始性腺发育成 睾丸或者卵巢；第二步“陛别分化”，在睾丸或卵巢产生的不同激素作用下最终形成雄性 或雌性表现型。性别决定是性别分化和继续发育的前提，受睾丸决定因子s r y s r y 的启动， 小鼠的性别决定发生在交配后的1 0 5d 1 2 5d ，s t y 恰好只在此时表达。但是性别决定 是一个短时而复杂的过程，还需要其它基因( 矿”、s 产j 、s o x 3 、s o x 9 ，e l l s 和删卜j 等) 的参与，s r y s r y 在其中处于核心地位，因为它对性别决定起到开关作用。 现已有很多实验室都通过不同的转基因技术得到了s t yx x 雄性转基因小鼠，本实验室 也曾采用精子介导技术实现了外源s t y 基因向胚胎的导入，并得到子代性别比例向雄性的 显著偏移。同时也有研究通过基因敲除或在s t yh m g 盒中制造点突变实现x y 雌性的性反 转，证实了s r y 基因在性别决定中的关键作用。然而，以上技术距离生产实践的应用还有 相当长的距离，截至目前尚未见到使用核酸免疫学方法控制哺乳动物性别发育的研究，本 课题则创新性地利用核酸免疫技术遏制了胚胎时期s t y 的作用途径，成功地获得了x y 雌 性性反转个体。 首先构建并检测重组的真核表达载体p c r 3 1 一s t y ，大量提取该质粒制备核酸疫苗并控 制其浓度和纯度，通过肌肉注射免疫性成熟的母鼠，使母体产生抗s r y 蛋白的抗体并穿过 胎盘屏障影响其胚胎，抗s r y 蛋白的抗体有效的结合了胚胎期表达的s r y 从而阻遏其对下 游基因应有的作用，最终切断中性性腺脊向雄性的发育通路，实现了x y 雌性的性别反转。 免疫后的母鼠共有1 5 只生仔，子代小鼠的性别比例( 6 ：早) 为1 ：1 1 1 ( p o 0 5 ) ，发 生了性比向雌性的偏移；使用p c r 技术特异性的扩增& ：y 序列检测到了基因型为x y 而表 型为雌性的性反转仔鼠，其中有些个体具有f 常的性周期并且可以成功受孕。采用相同的 技术手段和路线大量提取p c r 3 1 空质粒以肌肉注射的形式免疫母鼠，其子代小鼠的性别 比例( 1 ：1 ) 完全正常，而且p c r 检测没有发现性反转的雌性个体。 本课题首次利用核酸免疫的技术和机制成功地实现了x y 个体向雌性的性别反转，为在 分子牛物学水平进一步研究雄性生物学以及发育生物学提供了重要的研究平台；为性别控 制的动物学生产实践提供了低成本、易操作、高效率的崭新技术手段；拓展了核酸免疫技 术的应用范围，提高了其技术价值；为相关疾病的病理学研究和临床基因治疗提供参考， 并且对于深入研究勋，下游途径和揭秘性别决定机制具有重要的学术意义。 关键宁 哺乳动物性别决定，肼脚基因，核酸免疫 a b s t r a c t i nm a m m a l 。s e xd e v e l o p m e n tc a nb ed i v i d e di n t ot w os t e p s + t h ef i r s ts t e p i ss e x d e t e r m i n a t i o n - i ti st h ec o n s e q u e n c eo ft h ei n t e r a c t i o n so fm a n yg e n e sw h i c hc a nc a u s e d i f f e r e n t i a t i o no fg o n a d sa st e s t i so ro v a r y ；t h es e c o n ds t e pi ss e xd i f f e r e n t i a t i o n - - i tr e l i e so n h o r m o n e ss e c r e t e df r o md i f f e r e n t i a t e dg o n a d s ，w h i c hu l t i m a t e l yr e s u l t si nt h ee s t a b l i s h m e n to f p h e n o t y p i cs e x m a l eo rf e m a l e s e xd e t e r m i n a t i o ni s t h ep r e m i s eo fs e xd i f f e r e n t i a t i o na n d f o l l o w i n gd e v e l o p m e n t 。t h es e xd e t e m f i n a t i o ni ss t a r t e db yg e n es r y s r y ，w h i c hh a p p e n s b e t w e e ni 0 5d pc a n d1 2 5d p ，c 。a n ds r e s t ys y n c h r o n o u s l yp r e s e n t sa tt h i st i m e 。s e x d e t e r m i n a t i o ni sab r i e fb u tc o m p l i c a t e dp r o c e s s a l lr e l a t i v er e s e a r c h e sh a v es h o w nt h ek e yr o l e o f s r y t s r y i ns e xd e t e r m i n a t i o ni nm a m m a la n i m a l s ， n o ws e v e r a ll a b o r a t o r i e sh a v eg o tx xm a l er e v e r s a lm i c eb yt r a n s g e n i n g 跚o u rs t u d yh a s i l l u m i n a t e dt h a tx xe m b r y oc o u l db er e v e r s e l yd e v e l o p e di n t om a l ei n d i v i d u a lb yt r a n s g e n i n g s 吩b ys p e r m s * m e d i a t e dt r a n s g e n i ct e c h n i q u e s o m eo t h e rr e s e a r c h e sa l s og o tx yf e m a l em i c e b yk n o c k i n go u ts t yg e n eo rm a k i n gap o i n tm u t a t i o ni n 跚h m g b o x t h ep r e s e n tr e s e a r c h ，f o r t h ef i r s tt i m e ，i sd e s i g n e dt os u p p r e s st h ep a t h w a yo f 跚d u r i n ge m b r y os e xd e t e r m i n a t i o n t h r o u g hd n ai m m u n i z i n ga n dh a sg o tx y f e m a l er e v e r s a lm i c e 。 f i r s t l y ，t h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o n p l a s m i dp c r 3 1 一s r yw a sr e c o m b i n e da n d l a r g e l y e x t r a c t e da sn u c l e i ca c i dv a c c i n e n e x t ，t h i sv a c c i n ea tc e r t a i nc o n c e n t r a t i o na n dp u r i t yw a s i n j e c t e d i n t ot h el e gm u s c l eo fm a t u r ef e m a l em i c e 。r e s p o n s et ot h ed n av a c c i n e ，t h e i m m u n i z e dm i c ew i l lp r o d u c ea n t i - s r ya n t i b o d yw h i c hc a np a s sp l a c e n t ab a r r i e ra n di n t e r a c t e d w i t hs r y p r o t e i ne x p r e s s e di nt h e i re m b r y o a n t i - s r ya n t i b o d yc o u l de f f e c t i v e l yr e c o g n i z et h e s r yp r o t e i ni n e m b r y o ，c o n s e q u e n t l yr e s t r a i nt h ef u n c t i o no fs r y ，f i n a l l ys h u to f ft h e d i f f e r e n t i a t i o no fu n d i f f e r e n t i a t e dg o n a d si n t ot e s t i sa n dt h e r e f o r e ，x yf e m a l er e v e r s a lm i c e a p p e a r e d i no u rr e s e a r c h ，a f t e ri m m u n i z i n g ，15p r e g n a n tf e m a l em i c eg a v eb i r t hi na 1 1 t h e n u m b e ro f t h et o t a lo f f s p r i n gi s9 7 ，a n ds e xr a t i o ( s ：霉) s h i f tf r o mn o r m a ll ：ii n t o1 ：l 。1 1 ( p 型蛋岛$ h w t l ( 一k t s ) 黧蛋宣。缀多磷究显示：w t l ( - k t s ) 黧獭岛霹敷簿菇瓣结 合富禽g c 停3 d n a 模块“1 ：w r l 上存在两种功能区，现在可以糕本确定位于8 5 1 2 4 的抑制区和 位于i 8 l 一2 5 0 豹激滔区o “，两个区域的幸# 用是各自独立的；孵l 的d n a 结合活性可能熙通过 锌携结梅束实现熊；w t l ( + k t s ) 型蛋自可懿与某些m r n a 萃蟊赘接因子缩合，提示它可能参 与基因转录后水平的调节；+ k t s 年i - k t s 型w t l 强白的比例谯人、小鼠和大鼠的发育过程中 基本保持在1 ：l ，隧卷比例失调将会出现发窘髯鬻。 嗣酊已经发琥了多个。陡剐发育的关键基因受瓣w t l 的调控，包括s r y s r y 0 s e x d e t e r m i n i n gr e g jo no n 、g e n e 、s f l s f l t t h eg e n ee n c o d i n gs t e r o i d o g e n i c f a c t o r 1 ) 、m t s m i s ( m u l l e r i a n i n h i b i t i n gs u b s t a n c e ) 和删舅1 d 墨x 一( d s s d o s a g e s e n s i t i v e s e xr e v e r s a l 一a h c a d r e n a l h y p o p l a s i ac o n g e n i t a 】c r i t i c a l r e g i o no nxc h r o m o s o m eg e n e1 ) 。 4 。l ，2 s f _ 1 ( s e r t o i d o f e n i cf a c t o r - 1 ) s f - i 是一种孤核受体蛋白，内分泌发育的介导者，此家族可介导甾类激素、甲状腺豢、 维生黎d 、视黄酸的作用，在肾上腺、性腺等合成甾体激素的组织中均肖表达。 影。聪e 性豫中瓣表达具有性刚二态性，当，i 、鼠中疑瑟形残晷殖窦霹( 受精蜃9 9 。5 天) ，s f - 1 就开始在两性胚胎中表达，在e 1 2 5 2 _ 前，箕液达水平在两性之间没有明最差 异。当雄性小鼠的曲细精管开始分化时，即1 2 5 1 5 ，5 r 一在s e r t o l i 细胞中表达达到瀚峰， 焉戆鼹爨巢中剩醛低。这静翼寸闼秘往弱上匏表达差异与m i s 袭这( 雄性生建鸯e i i 。5 开始， 而雌性卵泡出生后才表达) 及缪勒式管的退化一致。基因敲除的小鼠缺乏性腺、肾上腺， 却有输卵管、子宫、阴道等缪勒氏管演化器官。这表明s p l 的胚胎早期维持性腺形成，随 磊调节攀丸藏墨豹表达”。 s f l 蛋自在体外能与m i s 基因的上游序列相结合，并且在共转染分析中活跃转录，近来 发现s f 1 也结合d a x 一1 基因的扁动子，诱导其转录。人类的萨j ( 位于染色体9 q 3 3 ) 突 变至今还没有礤究，毽因为夫熬s f - i 与鼠s 产j 毒广泛戆嚣滚淫显表达豹缝绥分毒鞠阉， 故推测人剐_ 的功能可能与小鼠5 产，相似。 4 2 在性别决定时期作用的基因 4 。2 1 ，s o x a n s o x 9 人类及小鼠中已发现的s o x 綦阑多达2 4 种“，其中s o x 3 楚唯一一个位于x 染色体的s o x 家 旅基因，与s r y 的同源性最商。”1 ；s o x g - 与性别决定直接相关，可能魁s r y 的下游基因。 s o x 3 ( s r y li k e 戮gb o xc o n t a i n i n gg e n e 一3 ) 在辩经系统套籁狳泌暴生疆脊熬发育中 超作用。已经证明人类中s o y 3 定- 位于x q 2 7 ，小鼠中s o x 3 定位于x 染甑体上最保守的区段内 。但由于在生殖嵴中未检出斯粕的表达，并已发现了x 染色体缺失包含e z i 笙内的5 m b j 4 羧瞧是美骞舅魏表鍪熬瘸骥，霆魏s o y 3 露y 瞧并不壹按参与缝巍浃是。但是受强熬困麓失活 将导致x x 男性；s o x 3 的复制和过量表达不会影响x x 的胚胎女性表型，但会产生x y 性反转女 性。这些现象提示删恿过间接抑制雄性性腺的形成参与哺乳动物的性剐决定。 s o x 9 ( s r y 一1 i k el 鼹b o xc o n t a i n i n gg e n e 一9 ) ，遨一基困爨编碣麓蛋自蒺冀有与s r y 鬣白相 炯d n a 结合结构域，作用机制也栩似，但是h m g 区域以外的结构与鲫趿戴他s o x 基 因却不相同，但是不同种属的脊椎动物间却有高度的嗣源性表明其舆有重要的功能吲。s o x 9 瓣保守往存套予双鱼类裂骥虢动凌中，毽雅往特异瞧表遮豹s o x 9 灵在哺乳动物籀鸟类中 存在8 ”3 。c d 患者( c a m p o m e l i c d y s p l a s i a ) 是一种罕见但通常致死的先天性的骨骼发育异常 综合征，伴有骨髂畸形且在已报道的5 0 例患者 2 3 以上表型为女性，而且性腺发育异常。 强麓夫弱鬟凄是位子1 7 q 弱s o x g k 西藏怒c 9 萋函8 1 。 小鼠胚胎早期痂e 达之前两性的性腺脊均有臌达，当雄性小鼠调i 达到高峰之 厝，s o x 蚴u 也达到峰值，e 1 2 5 后仅见于s e r t o l i 细胞并持续赢水平淡达，雌性则在e 1 1 。5 消失，诧褒象表鞠，s o x 9 - 毒瞧别分诧直藏鞠关。 4 2 2 d a x 一1 ( d s s a h cc r i t i c a lr e g i o n0 nt h exc h r o m o s o m eg e n e - 1 ) 早期，b a r d o n i 等在x p 2 1 定位了一个参与性别决定匏基因座d s s ( d o s a g e - s e n s i t i r e s e x r e v e r s a l ，潮量敏感往瞧反转基因) ，长1 6 0 k b ，虢邻先天性肾上腺发育不全( a d r e n a l h y p o p l a s i ac o n g e n i t a ，a h c ) 基因座8 。具有一个完憋的s r y 基因并且x p 2 1 - 2 2 区有一个 重复的病人具有女性表型。后来，从这一区域中克隆到了占匝卜( d s s a h cc r i t i c a lr e g i ( m o nt h exc h r o m o s o m eg e n e 1 ) ，由于它与a h c 有关两褥名。 删卜，被认为是卵巢分化撼因，其蛋白属于核激素受体超家族，其缺失导致的肾上腺发 育受睚和性腺机能下降等性状与铲，基圆敲除小鼠的液型耱戗，裘明1 3 , 4 x - 1 秘s f - 1 可 畿饶予发育的潮途径中，谢且两者在许多相同魏位鬻表达：如幢腺、肾上腺皮磺、艨垂 体促性腺激素细胞等”9 】。 是否发生性别反转与这个蒸因表达鲍承平和时闻密切稷关，这个蒸因静功能缺失型突 变并不会影确x y 氍胚胎的发育，但是，功麓得到型突变将会导致x y 罐性的性剐反转。对于 其作用机制，后期研究有所提示：删肌和蹴同一时间液达，但是与黟向i 同的遐，删一 在x x , h x y 都有表达，随着睾丸的发育，其淡达受到抑制，但是在卵巢的发育过程中始终 表达：删卜表达过度或者其高蜂出现在s r y 离峰之前则可能克i 艮s r y 的抑制作用，引起性 反转。s w a i n 等。“建立了转基因，l 、鼠模鼙，将蒯乒j 基因转染入x y 惩骆，发现离求平多 源往 删一袭达对正常s ，谱位基因小鼠只能起到延迟睾丸分化的作用，而在- s 砂等位基因较弱 时彳可能导致完全瓣性别反转。 4 。3 + 在性剐分纯簇怒作用的m i s 删罐因缺陷的小鼠有睾丸，可以形成有功能的精子，但是同时也具有雌性生殖器；如 果擎丸雌性化突变秘舟! 括基因缺翳嗣时存在，将会导致两种雄性分化过程中很重要的激素 功麓使失，个体将发育为难往，肖子富、输卵管等雌性生越器，除了睾丸没有萁饨瓣往生 殖器，而睾丸也是有功能障碍的o ”。此性别发育异常提示，m i s 在性腺分化过程中怒着一 定的调节 乍嗣。 遴一步实验表蹈：小鼠前s e r t o l i 细胞的m i s 合成出现在s r y 产物表达后的2 0 b # 将s r y 表达质粒与乃宿动子转染到培养的早期性腺组织，发现s r y 与埘骟动予的转录活性相关： 搿，j 獭始区( 一2 2 十8 ) 可奔导s r y 诱导豹转录，该区豹突变会簿低转最溪性。但是势没有 发现s r y 与m i s 直接结合5 。问时，m i s 扁渤予一8 4 一1 0 3 区域的m 2 m i s - r e l 位点禽有 c c a a ( ；g t c a 序列，为s f 一1 结合区，这个区域的突变导致s e r t o l i 细胞系报告基因表达降低。 5 。影瞧涟爨决定弱其毽嚣素 5 1 剂量补偿 剂量补偿是使x 连锁的基因在两性间的表达水平达到平衡的过程，真兽监纲哺乳动物的 裁羹 缮瓿铡是戆娥失活避蛙秘耪题条x 染镌转中数一条。残在认为x 失溪单独峦x 凌憩 奉 上的一个称为x 染色体失活中心( xi n a c t i v a t i o nc e n t e r ，x i c x i c ) 的顺式作用开关区 域摔制。丌始于x i c ，然后扩展剐整个染色体，人x i c 定位于x q l 3 ，小鼠x i c 定位于x d ，这 两个携耪闽数x i c 蒸遴窿功麓一敬。这是迄今发麓戆唯一一个稷毂奎失瀵豹x 表这戆基因， 冈而成为x i c x i c 的强烈候选者”j 。 5 2 基因剂量 孵、，鏊霸中摹磅爱熬失活突变篷鼹往艨发黉，表鞠了基聪裁量翡重蘩瞧。这秘失溪突蜜 显性于野生型等位基因的现象称为单拷贝不足性( h a p l oi n s u f f i c i e n c y ) 。s o x 9 也有这 种效应，s o x 9 的单拷贝突变导数c d 以及4 6 ，x y 性反转，邋种异常意味着雄性发育需要两 赞毒功麓戆s o x g o 6 性别决定的分子机制 6 1 性别决定释相关基因对性别决定的作用及其相互作用 燕圈4 可以发褒一个瀵嚣囊蘩毪羯决定痘动事臀戆模型，它楚基于对人类秘小菠的 实验证据得到的。图中显示的所有因子程s e r t o i 细胞起源系统中或其他线性系统假想的 信号中发挥作_ 3 。在二态性性腺中，在性别决定启动之前，被s r y s r y 因表达而启动导致 一些军鬻基毽毅诱导表达。缺乏s f l 蓦戮麴夺惑袋乏妻妻豫秘鸳土骤，它翻可以不囊常兹藕 激生殖腺。另一个早期基因w t l ，在小鼠中大约于未分化的生殖脊第九天时表达。耽基 因敲除小鼠1 1 天的时候发现生殖脊的体胶的皮层有加厚但没有变褥照著的性腺成分。性 繇发弯需要熬装德基因是l 掰五l h x 9 , 耱6 a t a 4 , 在嚣毽澎藏过程中魏暴这些基戮发釜突交 将会导致性腺发育的错误。在l h x 9 基因敝除的实验中，发现s f l 的寝达依赖于l h x 9 。熨- 的农达被l h x 9 正向调节但s f l 蛋自的活性却被d a x l 反向调节。s f i 也正向调节它良己的 接抗墓霞捌船。w r i t 4 蔚癸鬃发育是必须豹，它撩麓籁耋黾缀貔豹产生。因为删船不是睾丸 形成所需要的，w n t 4 激活删朋同时也激活卵巢形成所需的其他基因。临床上，无论g w t 4 或d a x l 的过度表达都拮抗翠丸的形成，可能是d a x l 干扰s f l 蛋白滔性，增加了熬因型为 x ￥静雅洼。w t l 裙s f l s p l 复合物粒d n a 结台耪正商调节s r y s r y 的表达。w t l ( + k t s ) ， 一个r n a 结合援白，s r ym r n a 水平上游调节通过增强稳定性活处理。s o x 9 在二：态性性腺 中表达但是在较低水平。 x y 往黥中鳓，赡矗7 一旦焱达，凇转楚强烈韵上游灞节基函，并且它的翌细魏位点由细 胞质转到细胞核，该事件卷入s r y s r y 和i m p o r t i nb 谶c a m 的作用s o y 9 的上游调节被 s r y s r y 直接或间接的启动。在s r y s r y 磨动时，其他麴基因如v n n l ，d h h 和p g t 9 发生转 炎，可麓窟动s r y s r y 酌潘缝或介导s o x 9 鼢表达。s r y s r y 表达看瀚天，i t h t 4 和饧j ， 调节水平下降。s r y s r y 可能赢接地抑制删肌或侧肌激活w n t 4 的活性，原因可能是被 w n t 信号途径中t e f s o xd n a 结合位点赝竞争。 图4 ：性别决定崩动模式例。 一系剜被诀为s r y s f y 在注烈决定和分证中怒关键俸崩基因静定位 6 2 性别决定分予机制的模型假说 在s r y s r y 确定的初期，人们认为s r y s r y 壹接启动鬻丸决定，对予人类性别反转作 出了嫩简单的解释蹙：x y 女性携带了无功能的s r y , 丽双男往在来源于父本静x 繁色俸 上携带了f 常的s r l 但是越来越多的证据表明s r y s r y 并不能单独激活调控发育的级联 反应，瓤是阻遏抑制睾丸发育躬受调节子( 如删j r _ ，起到一静闽接感动的 乍用。比妇有 些x y 女性患者具肖完整的s l ? f 瓣x x 勇性惠错并没有携带掰只有效地l 正明了这一点。 当然，5 r y s r y 作为性别决定核心基因的地位至今仍然是稳固的。因为在x y 性腺发育不 良的慧者中，有2 蹴豹都存在5 科结构基因或侧翼序列黥突变。比如，1 6 ( a s p t y r ) 秘2 l ( v a l - p r o ) 的突变导致s r y 蛋囱缺少一个正常的位于h 瀚之前的d 、h e l i x ；在表型女性惑有 s w y er h x x y 患者的病人中，发现有完整的s r y ，但是在其侧翼序列有突变，导致期腭i 达异 常或表达沉默。“3 。 2 0 0 2 年，k e n n e t h 等人。”鞫建了转基因小鼠b 6 s r y 幂h b 6 s r y “，在憾剐发育过程中分别 出观了性反转和颦丸分化滞厢的现象，而且不同来源的s t y 的等位基因对同一个遗传箭景 靛敏感性糖差缀夫；在谗谂中提凄覆点霰浚：不正鬻攀曳发弯夔漂爨惩，不是量静墓嚣表 达戚低效率的蛋囱异构体活两者皆有：至少一个常染色体基因作为转添因子通过崴接与 s 弛饷启动子结合控制其表达或者作用于i s ! 口韵转录产物，影响产物的稳定性和定位。 霹嚣，生耪界窭蕊了多静浚裂决定瓿粼瀚缓巍，嚣都存在羞不巍稷发热袭鏊，不是证 据不足就是不能同时解释多 羊中性别发育异常，当然这与撼因研究还比较肤浅密不可分。其 中的两神假说暂时表现出相对的优势和合理性： 6 + 2 1 + s 嚣￥一s o x 3 一s o 薹垂霰巍 1 9 9 8 年由j e n n i f e r ”“提出，此模型认为性别决定是通过s r y 、s o x 3 $ 口s o x 9 协同作用柬实 现的，设想s o x 9 寰接启动睾丸的决定，在雌性个体中s o x 3 抑8 j i t s o x 9 的作用，巅程雄性个 髂中s 翡又簿镧“t s o x 3 蕊功憩，麸磊襄秘7 s o x 9 憝表达实疆了睾兔决定。该鬏涎为链蘩反 转假说提供了三种解释：x y 女性，除了常规的s y y 基因缺失或突变外，也可以由予砸腮摹 因的过量表达或翮脬基因的缺失焉导致；同样，对于x x 男性丽砉，滁了常娥的s r y 漠鲤获 褥辨，龟可戮盎予鼹瑟熬突变或5 0 1 9 韵避薰表达嚣导黢。虽爨这暇砉莞可双报好麓解释 不携带s r y 的x x 粥性和具有完撒s r y 的x y 女性，但是，s 0 ) c 3 至今还没脊在早期胚胎中检测到 表达。 6 2 。2 ，滋x i s 卜i 鬏说 此假说认为，在卵巢发肖中，d a x l 和s f 岬l 的二聚体抑制了第二性黎丸决定基因，如s o x 9 等的表达。蕊在x ￥个体的生殖艨中，s r l l f 也l 夸_ 遮过改变d n a 檎象露阻丘t s f - l 帮d a x 杂聚 豁静澎盛，或者隧杰杂二聚毒本与靶基鑫静装鬣，同时又德逐s f i 爨其有激活与转录澈活靶 基因的活性。可魁当d a x 1 搿水平或者对于s r y 提前表达时d a x l 将优先与s f - 1 结台，成优先 与s r y 结台防碟s f l 靶基因瓣正常表达，戮越，诸如嗝鹦娶基嚣将永远不戆达到瓣悠水平， 豫诞巍尔托立菠缀麓瓣分纯，个体发育为炼幢，卷现缝葳转蕊象。体辨爱应可实现这两令摹 因的相互结合以及完全缺失d a x 一1 对s f 一1 的裘达和雄性发育没有影响都是这一假浇的有力 迁攥。 德是，在s w a i n 等入匏蜜验中发嚣蒯 殖过量或者提前表达并不髓弓 起往剽厦转， 只戆滞后睾丸分化，而只有在删卜过量袭达和s r y 表达降低同时存在的情况下才能实现x y 鹾髋镶反转。这一实验结果对蚨上缓说无疑是一嵇威胁。 总之，瞧剽决定是一个多蒸函福互调控麓级联爱艨过程，其中罐性决定基溺( 如 甜彤，聊) 和雌性决定基因( 如d a x - 1 ) 在袭达量和表达时间上的竞争结果直接决定了初期 性腺脊的分化发育方向。但目前的研究的深度不够，对几个关键的基因功能及蛋白的相互 乍用还知之甚少，停留在猜想和推测的阶段，所以，要想找到这一过程的根本机制，关键 蛋自之闽的柜互傩用建研究的熏中之重。 二核酸免疫的研究进展 基因受疫( g e n e t i ci m m u n i t y ) 及孩酸疫蕊( n u c l e i ca c i dv a c c i n e ) 熬疆究诞生予 上世纪九i 年代。繁因免疫是指成用基因工程技术，将编粥某种抗原蛋岛质的外源基因与 载体重组后直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出的抗原蛋白质引起机体 懿免疫应答，良达到馥骧帮浚疗疾凌夔曩匏。它戆诱发特舅性c t l ( 缨魏毒量鳃照) 以及强 细胞( 辅助性t 细胞) 和体液应豁，而又不存在象活苗那样的内在危险，与弱毒苗、灭活 疫苗及缮白亚单位黼效果比较为第三代疫苗，制作技术相对简单，符合缴佳疫苗的祭件， 绘基戮治疗帮疫莓免疫豢寒了不露 砉量瓣 ；萋爨。 1 梭艘免疫的研究历程 虽然真正的核酸疫苗诞生于上世纪9 0 年代，可是早在上世纪7 0 年代末，i s r a e l 等就园经 l 巷缝讫瓣多瘩襄毒d n a 童接注麓，l 、蒎，| 歪实裸d n a 嚣羧动魏髂壤藤摄入鬟达缓蘧棱褥阻转 录。n i c o l a u 等”将脂质体包被的编码前体胰蕊素基因的质粒静脉注射大鼠，发现大鼠瓶糖 浓度明湿下降，说明d n a 在大鼠体内发生了表达。w o l f f “1 9 9 0 年首次报邋了将带有编码氯 霉素己装转移酶、菠先素酶彝一半襄蘸蓑酶蒸因静d n a 表达溪粒努爨注麓到，j 、藏魏费髓 肌，其所编码的蛋白表达量可以和在体外最俄状态下通过转染成纤维细胞方法获得的照相 当，这是一个非常有意义的发现，它开创了核酸疫苗研究的先河。t a n g 簿“”于1 9 9 2 ，将表 达人生长激素( h g l 势及n 撬簇蛋巍戆( a a t ) 鏊溺豹表达霞粒皮获搂耪小鬣，免疫轰2 黉臻羧 射免疫法j 币 1 w e s t e r nb l o t t i n g 检测到相应的抗体，加强注射后，特异性抗体可在体内持续4 个多月，并提出了熬因免疫的概念。1 9 9 3 年，r o b i n s o n 等”“将表达禽流感瘸毒( a i v ) 保护性 抗藤斑凝素( h 鲇基因豹覆粒d n a 注瓣，l 、鬣帮鸡，霹辩致琵毪麓a i v 攻击产室有效浚免疫 ；| 护 反应。核酸疫苗这一术语，是1 9 9 4 年5 月w h o 全球疫苗和免疫计划委员会等三个组织在日内 瓦联合程玎的核酸疫苗会议上建议的，习惯上又被称为基因疫苗( g e n e t i cv a c c i n e ) 或 d n a 疫蘩( d n av a c c i n e ) 。随后关予核酸免痰的谚究在落嚣范豳广泛震开，所涉及翁藏霞 包括人和动物的各种细菌性、病海性及寄生虫痫，如流感瘸海血凝素基因、乙肝病毒包膜 抗原纂因、狂犬病繇g 蛋白基因、牛疱疹病毒2 型糖蛋白基因、肺炎支原体鄹刹什曼原虫g p 6 3 等，有麓疫餐知芟滋瘸病毒、流感瘸毒结核秆蓠等己送入蠲藏籀晦床试验除羧。 2 桉酸免疫的按种途径和剂量 i3 递送外源基因到哺乳动物体组织或器官内的方法，谢生物学的、化学的和物理学的三 丈炎。褒奁主螫采矮懿莛魏爨方法递送乡 滚d n a ，一觳采趱 弱道耋攘接耪，帮瓿舞、皮 下、静脉、腹膝注射等。 2 1 肌肉注射 j 戢貉觏缀瓣寝浚亵表达努深d n a 静藐力较强，其终椽特患是有丰藿麓零小管系统秽霪l 浆 网结构，t 小管中有较多的细胞外液，这些结构上的特殊憔有可能使骨髓肌纤维直接摄取外 源d n a 。有人认为注射过程中针头直接损伤肌纤维膜，使外源d n a 沿破口进入肌浆中，也有人 谈为黼逶遘藏袋丽逶入勰浆中，在鼹续藏簇中哥麓存在特异性d n a 结令爱蛊，孺编鹤荧光 索酶的质粒d n a 兔疫小鼠后发现，表达的酶活性呈d n a 齐j j 爨依赖关系，而且报告基因可持续 表达1 9 个月”。 2 2 受获接耱 皮肤组织的多种细胞如郎罕氏细胞、树突状细胞、巨噬细胞等都具有抗原递呈细胞( a p c ) 的特性，皮肤角媵细胞可分泌i l - i 及t n f - a ，此外皮肤的袭皮附近富台淋巴组织，这媳都有 弱予抗蘸麓递鏊、诱导免疫反应靛发生。毽这耱方法一般需要蒋豫豹强入装置，翔蘩因枪 法可真接将质粒d n a 转入细胞，转染效率高，数十毫微克的d n a h 口可在局部表达到可检出水 平，并可引起较强的体液细胞应答。r a z 等“”皮忐一次性注射0 3 1 51 3g 裸d n a ，可见质粒 d n a 及萁表达产物分布予各耱袭皮和真皮缁藏，著诱发较强的缎藏免疫反应和体液免疫应 答，特异性抗体可持续7 0 周，特异性c t l 持续1 7 个月。 2 3 。粘膜接种 糙簇缝织爱飘体躲第一邋防御屏障，冀中也含有诲多可健避和调节免疫应答韵细胞成 分，粘膜免疫对防御粘膜局部感染或起源于粘膜的全身感染尤为重要。o k a d a “73 将编码 h i v l 抗原的质黢d n a 鼻腔滴注小鼠，可诱导t h 2 型免疫应答，在糙膜处可产生赢滴度的特异 瞧s i g a ，盘清可稔缀高潦凄豹特异往i g g ，粪便及蕊道分泌纺中也可检测到s i 酿。 此外，还可通过静脉、腹腔内注射接种桉酸疫苗。如静脉内注射质粒d n a 表达载体，可使 包锯腺、淋巴结、骨髓等在砖的所有缱织发生转移，两以瓣、薅基因袭达窭最高。 2 4 。援释剂量 关于核酸瘦荫的免疫剂量，由于接种途径及接种方法不同，差异较大，而且不同的研究 者使用剐量也不一致。r o b i n s o n 管使鹰斡免疫剂量达4 0 0 # g ，其中l o 。# g 瘸子首兔，3 0 0 1 3g 用于翻强免疫；如果使用基因榆，1 “g 裁量就足以引起强烈的细胞及体液免疫反应，通常肌 肉、静脉、皮下接种量为5 0 2 0 0 ug ，一般单剂量注射即可引起较强的细胞和体液免疫反 4 应1 。 加强免疫、大剂量注射d n a 疫苗以及多点注射能增强免疫反应“。用表达h 5 禽流感 病毒h a 基阏的d n a 疫苗对鸡进行免疫保护研究，试验结果表明，单次肌肉注射1 0 ug 组保 护率仅为1 2 5 单次注射1 0 0ug 组保护率为5 0 ，而5 01 1g 两次注射组保护率可达9 1 5 说明加强免疫优于单次免疫”。 3 核酸免疫的免疫应答机理 核酸疫苗可激发保护性的细胞毒性t 细胞( c t l ) 应答以及t 辅助细胞( t h ) 和体液免疫， 可能是由不同机理形成的。这里主要以肌肉接种为例具体阐述。 3 1 细胞免疫应答 c d 8 + 限制性c t l 的主要功能为识别和杀伤病毒性感染细胞，它识别与宿主细胞m h ci 类 分子相关的肽抗原。局部注射的质粒d n a 被周围的细胞摄取( 包括局部的组织细胞、a p c 细 胞或其它真核细胞) ，质粒进入核内进行转录，并进一步在细胞质中翻译成蛋白质。内源 性抗原蛋白的递呈与外源性蛋白抗原有类似的机制( 如图5 ) 。内源性蛋白质分子在细胞 质内被蛋白酶分解成多肽，然后被与抗原加工相关的运输体( t r a n s p o r t o ra s s o c i a t e d w i t ha n t i g e np r o c e s s i n g ，t a p ) 转送至内质网腔中，在这里与m ci 类分子的重链( a 链) 和轻链( b 链) 相互装配形成肽抗原一m h ci 类分子复合物，经加工、递呈后被高尔基 体转运到细胞表面作为免疫原信号供c t l 所识别，导致c t l 活化、增殖并分化为具有杀伤能 力的效应c t l ( t c ) 。t c 细胞与靶细胞表面的抗原m t i cl 类分子复合物紧密结合，进i i 百t c 细 胞对靶细胞造成不可逆性损伤，使靶细胞发生进行性溶解，从而对表达外源基因的细胞发 挥细胞毒作用，形成细胞性免疫应答。 圈s ：棱酸疫苗鲍体液静绥腿受疫艘答橇割模式黧 外源d n a 以环状不复制的形式存在于染色体外，它的表达过程首先是外源d n a 逊入细胞 核，在r n a 聚合酶i l 的作用下转录，随屠转最产物穿过拨骥在照浆中波达基夔蛋爨。出予 瓢细胞m h c 类分子的低表遮使入们对其递璺抗原的能力表示怀疑。外源d n a 的注射可引起 局部的炎症反威，人们推测炎症细胞与抗豚的加工与递摄可能密切帽关。u l m e r 等刹用体 外转导抗原基戳麴成虢绍飓移缝子两系小鬣粒觏凌内菇，骞效滋活c t i 溪；性，薛产( 1 i 糖应 抗体，因而他认为舰细胞表达抗原足以激激机体有效免疫，同时其它肌细胞亦可以从其获 得传递的抗原进行递呈，从而激活机体的免疫应答。进步的实验证明髓源的抗原递呈细 腺a p e 亦参与特露瞧c t l 黥诱譬，显效率囊予舰缨骢9 “。 3 2 体液免疫成昝 巨噬细胞通道“清道工”受体吞入质粒后，可以激活核因子n f 一。及诱导i l 2 与t n t a 黪波达增熟；霞粒中若出珑以未譬基伲懿e 鹃为孩心熬翳文痔囊，褥露效激活n k 缝霪链著分 泌i f n 一￥。因而陋噬细胞与n k 细胞均有可能参与应答并加强t h o 向t h l 的转化。 髓源性的a p c 细胞可以通过两条途径参与抗原递呈：在肌肉内馒接吞入质粒d n a ，从 藤使质粒携磐懿羧愿基因褥以在a p c 缍貔肉食藏，然嚣遴入m h cl 类分予懿隈馥卷撬蒙递 呈。肌细胞内合成的抗原通过某种方式传递给a p c 细胞，而后进, m h ci 类分子的抗原递 呈。 1 6 m ic h e l 等报道，在编码k b v 病毒包膜蛋白的质粒d n a 注射小鼠后，针对病毒包膜抗原决 定簇的i g m 型抗体在注射后1 2 周首次出现，随后发生由i g m 至l j i g g 的类别转换，抗体滴度在 4 8 周达到高峰并可维持至少6 个月。在抗体产生中出现的类别转换提示了由m h c l l 分子介 导递旱病毒蛋白，并f i l t h 细胞参与的体液免疫过程。肌细胞通常并不表达m h c l l 分子，所 以抗原递旱过程不可能在肌细胞上发生。现在认为肌组织中的抗原递呈细胞( a p c ) 即指 树突细胞能有效递呈极少量的抗原( n g 水平) ，此外，肌细胞持续少量抗原分泌及注射过 程本身引起的炎症反应也为m h c i i 类分子介导免疫中的有效递呈提供了有利环境。 另一方面，m h c i i 类分子的a 与b 链在内质网与i 链( i n v a r i a n tc h a i n ) 结合，i 链 与m h c l l 分子的抗原结合部位结合，阻碍了细胞质内的内源性蛋白水解多肽与m h c i i 类分子 结合。该复合体经过高尔基体进入核内体( e n d e s m e ) ，i 链与m h c i i 类分子解离。外源蛋 白在核内体内化，降解为多肽片段再与m h c i i 类分子结合，被运至细胞膜表面，为t h ( i s ) 细胞识别，导致t h 细胞活化、增殖、分化为效应t h 细胞，并分泌一系列的细胞因子，从而 发挥t h 细胞的辅助效应。 在r l h 细胞帮助下b 细胞活化、增殖、分化为浆细胞，合成并分泌抗体，形成体液性免疫 应答。产生的抗体主要成分为i g g ，其中i g g ，1 9 ，i g g 。5 1 ，i g g 。1 6 ，此外，还有少量 i g m ( 1 0 ) 和 g a ( 5 ) 。对甲型流感病毒的研究发现，用保守核蛋白( n p ) 接种小鼠所 产生的抗血清对病毒复制无影响，而接种n p 质粒d n a 的小鼠所获得的抗血清可有效地抑制 病毒复制。叮见，基因免疫接种和抗原免疫接种所获得的体液免疫在质和量上有一定差异 【i o 4 增强核酸疫苗效力的途径 目前，困扰基因免疫的有3 个重大关键技术没能很好地解决：即基因导入系统、基因在 机体内表达及其调控系统及有效的免疫原基因。目前大部分研究者认为包括心肌和骨骼肌 在内的横纹肌系统是最有效的摄取外源基因及表达蛋白的组织。 4 1 优化重组质粒 选择合适的启动子增强子系统对d n a 介导免疫蛋白表达水平是至关重要的。目前较常 用的有r s v 、c m v 及s v ”三种启动子增强子系统，其中以c m v 最强。尽管在它们控制下的表 达质粒都能够在体外同样成功地转染成肌细胞株并表达目的蛋白，但在d n a 介导免疫时不 同启动子增强子系统却能对蛋白表达时相产生影响。研究发现，r s v $ 口c m v 启动子增强 子系统调控f 的外源基因表达在注射后第5 天达到高峰，随后维持一个高水平的平台期， 而s v 。启动增强子系统调控下的外源基因表达高峰却出现较早，在注射后第3 天出现，但 却迅速下降，维持低水平表达。 4 。2 。萤簿裁羧处理 4 2 1 使用樽生诱导剂 骨骼肌在整块肌肉外有结缔组织膜包绕，肌外膜向内延伸包裹肌柬形成肌束膜，而在 攀令勰缓魏躅爨逐畜少量缭簿缢织( 穗为瓿蠢貘) 。虢柬蔟可麓俸为痿粒d n a 在缀织中承 主要通道屏障，限制了质粒d n a 在组织中的扩散，继而限制蛋白表达水平，利用再生诱导 剂可以提高蛋囱质的表达水平。 嚣垒诱导麓主要豢心燕蓬簿素等环琵裁秘菜鳘爨寐剡，热布毙卡毽、蛇毒等。它们选择 性地破坏肌纤维，而肌卫星细胞、基膜和血管不受损伤。肌细胞坏歹巨并被吞噬后强烈的再 生过程更利于注射物质的扩散、通透或更易于摄取外源d n a 。局部肌肉注射梅比卡图、利 派专蠢，3 7 天螽注瓣囊粒d n a ，英蛋自袭达承平可稳离i 0 - i 0 0 倍左右。霜照毒艇理藏鄢 肌肉也可收到类似的效果。 4 2 2 使用璃渗溶液 有天提 蓦在注袈