（环境科学专业论文）高效除臭菌的筛选及其降解特性研究.pdf

a b s t r a c t o d o rp o l l u t i o ni sb r o u g h tb ya l lk i n d so fo d o r o u ss u b s t r a n c e w i t ht h eo d o r p r o b l e m sd r a w i n gm o r ea n dm o r ep u b l i cc o n c e m ，al o to fr e s e a r c hw o r k sa r ed e v o t e d t od e o d o r a n t t e c h n i q u e s ，e s p e c i a l l y t h e b i o l o g i c a ld e o d o r i s i n gt e c h n i q u e s m i c r o b i o l o g i c a lt r e a t m e n tt oo d o rh a sb e c o m em a i na s p e c to fd e o d o r i z a t i o nt r e a t m e n t r e s e a r c h h i g h l y e f f i c i e n td e o d o r i z i n gb a c t e r i a lc o n s o r t i ac a p a b l eo ft o l e r a n c ea n du t i l i z i n g h i g hc o n c e n t r a t i o no fd i m e t h y ls u l f o x i d e ( d m s o ) w e r ei s o l a t e da n dc u l t i v a t i o nw a s o p t i m i z e df r o mal a n d f i l ll e a c h a t e w es t u d i e dd e g r a d a t i o np r o c e s sa n du s e dp r o d u c t s o fc y s t e i n e ( c y s ) a ss o u r c eo fh 2 sa n ds i m u l a t e dg e n e r a t i o na n do x ! d a t i o np r o c e s so f h 2 sa sam a i nm a l o d o r o u sg a sf r o mn a t u r ei nt h ep r e s e n ts t u d y t h er e s u l t ss h o w st h a t m a x i m u mc o n v e r s i o nr a t eo fc y sc o u l dr e a c hu pt o7 8 7 5 a tt h es e c o n dd a yo f c u l t i v a t i o nu n d e rac o n d i t i o nt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fc y sw a s0 1 m g m l ，a n d f u r t h e ro x i d a t i o nr a t eo fh 2 sc o u l dr e a c hu pt o8 2 a tt h ef i f t hd a yo fc u l t i v a t i o n ， e x h i b i t i n gah i g h l y e f f i c i e n td e o d o r i z a t i o n e i g h tb a c t e r i a lc o n s o r t i ac , - qw e r e i s o l a t e di no u rr e p e t i t i o u so p t i m i z e d 、c u l t i v a t i o n sp r o c e s s a 1 lo ft h e e i g ta v a i l a b l e s t r a i n sw e r ep r o v e dt ob eh e t e r o t r o p h i cb a c i l l u s ，e i t h e r a e r o b e so rf a c u l a t i v ea e r o b e s i nt h en e x te x p e r i m e n tw ea p p l i e dt h eb i o l o g i c a lc o n t a c to x i d a t i o np r o c e s st ot h e t r e a t m e n to ft h ew a s t ew a t e r t h ea n t e r i o re i 【g h tb a c t e r i a lc o n s o r t i ac , - c 8w e r e i m m o b i l i z e dt ot h eb i o - f i l mt r e a t m e n t t h er e s u l t ss h o w s t h a t i nc o n d i t i o no f p h 2 7 4 ( n a t u r a l ) a n d2 0 。c ，a f t e r7 2 h sr e a c t i o n ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fc o dr e a c h e d 8 5 a n dt h et r a n s f o r m a t i o nr a t eo fa m m o n i a - n i t r o g e nr e a c h e d9 8 5 t h i sr e s u l t m e a n st h es u c c e s s f u la p p l i c a t i o no ft h eh i g h l y e f f i c i e n td e o d o r i z i n gb a c t e r i a lw i t ht h e b i o f i l mt e c h n i c s k e y w o r d s ：o d o rp o l l u t i o n ；d m s 0 ：c y s t e i n e ；d e o d o r i z i n gb a c t e r i a l ：b i o f i i m t t e a t m e n t 第一章前言 近年柬，随着人们生活水平的逐步提高，对环境质量的要求也日趋强烈。由 于生活垃圾、畜牧养殖业和污水处理运输等过程中所产生的臭味越来越受到人们 的关注，恶臭己成为7 种典型公害之一( 大气污染、水污染、土壤污染、噪声、 振动、士地下沉、恶臭) 。目前，凭人的嗅觉感知的恶臭物质有4 0 0 0 多种“1 ，恶 臭物质一般散发在大气中，有些会随废水和废渣进入水体，不仅使水发生恶臭， 还会影响水生生物的生存。恶臭物质不仅使人产生不快和厌恶感，还危害着人们 的健康甚至生命。因此实施恶臭污染控制和管理，研究恶臭物质去除技术具有积 极的现实意义。 1 1 丰要恶臭物质及其处理方法 1 1l 自然界中主要恶臭物质 研究表明，被公认的恶臭物质多达万种，按化学组分可分为5 类，包括： 含氮化合物：如氨气，吲哚和胺类等。含硫化合物：如硫化氢、硫醇、硫醚。 卤素及其衍生物。烃类。含氧有机化合物。其中主要的恶臭气体为氨气， 硫化氢，甲硫醇和甲基硫等“1 。自然界中主要恶臭物质来源及其物理化学特征见 表1 1 、表1 2 所示： 表1 1 主要恶臭物质的特征及其来源” 含卣素有机物刺激臭合成树脂合成橡胶、制冷剂 表1 2 主要恶臭物质“ 1 12 常用恶臭处理方法 去除恶臭物质，常用的方法可分为三大类：物理、化学和生物除臭法 5 1 。物 理除奥方法t 要是利用一些掩蔽剂，吸附剂，暂时性的吸附、掩盖一部分臭味， 而4 i 能从根本上除臭；化学除臭方法主要是利用氧化剂氧化一些臭味成分，除臭 效果较好，但成本较高，也容易产生二次污染：生物除臭方法主要是利用微生物 降解主要恶臭成分或阻断恶臭成分的产生，它与物理、化学方法相比，具有除臭 彻底，效率高，不易产生二次污染等优点，应用前景广阔。关于不同除臭方法的 效果比较如表l ，3 所示： 表1 3 除臭方法的应用效果比较6 1 方法优点缺点适用恶臭物质 物理法 能化燃烧法 化学吸收浊 t 艺成熟可列收有用 物赝、净化效半约9 5 。 台适的催化剂净化效 率町达9 9 ，能量消耗低， 操作简便。 能处理低浓度大分了 量的有机悲臭气体。 一般要求气体预净化，香脂肪酸、氨类及其 则墩附剂易堵塞。占易溶于水的臭气。 催化剂的选择较困难，要适用于所有恶臭气 特别注意催化剂中毒现篆的发 体。 生，设备复杂。 存在有二次污染，净化效率脂肪酸、氨等其它 般在在6 0 8 0 之间易溶于水的臭气 生物处理法 净化效率高。投资运行一般细菌活性温度范围在 大部分恶臭气体 费用低尢一次污染，易管 l o 4 0 之问在寒冷地区 删该法受到一定的限制 2 1 2 恶臭物质的生物处理法 1 2 1 生物脱臭的原理 恶臭的生物处理法，即生物脱臭，其机理是恶臭物质首先溶于水中，而后被 微生物吸收，作为其营养物质被分解、利用，从而生成无恶臭的物质。是利用除 臭菌高效降解恶臭物质从而达到清洁环境、彻底除臭的目的1 7 1 。 生物脱臭过程大致有如下三个阶段“1 ： 第一阶段恶臭成分的溶解过程，并遵循亨利( h e n r r y ) 法则。 第二阶段，恶臭成分的水溶液被好氧微生物群吸收在生物体内，而使恶臭成 分从水中去除，其速度接近一般化学反应的速度。 第三阶段，微生物体内摄取的恶臭成分，又转化为微生物的能源，变成细胞 物质而繁殖。酪酸、苯酚、甲醛等被分解为c 0 2 和h ：o 。硫系恶臭成分由一般细 菌与硫氧化细菌的作用而被氧化成硫酸，成为微生物的供给源。胺类、氨等氮系 恶臭成分中，一部分组成微生物构体蛋白质，还有一部分成为亚硝酸或硝酸。这 种生物化学反应过程，若由于某种原因而被阻断时，会使脱臭效率下降“1 。 1 2 2 生物脱臭的研究进展 在生物除臭这一领域，国外研究非常活跃。2 0 世纪8 0 年代初期，各国_ 玎始 在这领域丌展了广泛的研究，其中德国和韩国取得显著效果1 1 2 1o 日本琉球大 学农学系比嘉照夫教授培养出了e m 菌群( 即被称为有效微生物群，e f f e c t i v e m i c r o o r g a n i s m s ) “，同时又研究出各类微生物除臭的装置和设备开始运用于冶 金、石油、化工、畜牧业、污水处理厂等实际中。我国在2 0 世纪8 0 年代末才开 始实验室研究，尤其是有关处理硫系恶臭物质的研究还处于初级阶段。目前国内 的生物脱臭处理在对脱臭微生物的研究方面几乎没有进行，所采用的微生物都是 直接以活性污泥挂膜驯化，研究主要集中在工艺的选择、运行参数及处理效果的 探讨。蔺群虽经驯化，但总体代谢选择性和有效微生物比例仍较低，单位体积的 处理负荷不高。随着对脱臭微生物在臭气处理中作用认识的加深，为了提高恶臭 生物处理效率，特别是针对挥发性有机硫化物( v o s c ) 的脱臭，己_ 丌始了高效 脱臭微生物的筛选、培养和研究工作 1 0 l 。 尽管，七物方法有以上优点，但在生物除臭过程中仍然存在以下问题。首先， k 期处j ：厌氧条件是产生恶臭物质的主要原因之一。微生物在臭味的产生和降解 过程中都起着重要的作用。在臭味物质的产生过程中，厌氧菌发酵产生挥发性脂 肪酸( v o c ) 和挥发性硫化物( v o s c ) ；在除臭过程中，很多被研究筛选出来的微 生物是好氧菌，但在实际应用中，大多数是厌氧环境，好氧菌不可能很好的生长， 这f 是目前用微生物制剂解决恶臭问题的局限性所在。本项试验研究将讨论如何 筛选h 好氧与兼性厌氧菌，既能在有氧环境生长，又能在缺氧或少氧环境生长的 优势菌群。 其次，由于恶臭物质成分复杂，臭闽值一般较低( 见表1 2 ) ，很难用一种细 菌降解所有的恶臭物质“”。由于硫醇、硫醚等含硫化合物是恶臭气体中的主要 部分，所以本实验研究主要放在脱硫微生物的筛选及其降解特性研究上，筛选出 高效、广潜的微生态脱臭菌群是工作的重点2 11 4 4 1 。 1 2 3 脱硫微生物的类别 自然界中能够降解硫化物的微生物有“如1 4 5 1 i 23 1 片养型的硫氧化菌 这类菌分确j j “泛，种类很多，包括许多土壤细菌、放线菌和真菌。它们当 中一些种类能将硫代硫酸盐氧化成四硫酸盐，也有一些将硫代硫酸盐氧化 成硫酸盐。但是，这些异养型的硫氧化菌不能从硫的氧化过程中获得能量， 它们生活所必需的能量是从有机物的氧化中获得的。 1 2 3 - 2 贝氏硫细菌 这是一类形态比较复杂，较高等的硫氧化细菌。在环境中有硫化氢存在时， 贝氏硫细菌能将硫化氢转化成硫并积累在体内。当环境中缺乏硫化氢时， 体内硫粒逐渐氧化成硫酸，从中取得能量。 1 2 3 3 自养菌 ( 1 ) 光合硫氧化菌 包括紫色硫细菌和绿色硫细菌。在光照和厌气的条件下，他们能氧化 无机硫化物如硫化氢形成元素硫，并可进一步氧化成硫酸盐，但效率 较低。 ( 2 ) 化能无机营养硫氧化细菌 这类细菌通常称之为硫化细菌，它们能氧化硫化氢形成硫元素，硫可 暂时贮存在细胞中，也可进一步氧化成硫酸盐。 1 3 微生物除臭的机理研究及工程应用 高效脱臭微生物的菌均来自污水处理厂活性污泥或土壤中，菌株多是经驯化 而筛选得到的复合菌群“”。已有报道，利用冷冻干燥制成的t t h i o o x i d a n s j c m 7 8 1 4 细菌除臭剂，在与非还原糖共存时，常温6 0 天后，对硫化物的除臭活 性保持不变。同样的菌种，加0 2 m o l 柠檬酸配制成的液念除臭剂，涂布于1 2 5 m m 滤纸上，在3 l 封闭容器中，可在3 0 m i n 内将2 0 m g l 的硫化氢和3 0 m g l 的三甲 胺同时去除7 0 $ d8 5 “3 。 现今生物脱臭工程中广泛研究的主要是硫化细菌类。这一类微生物能氧化 l i ! s 形成硫元素，硫可暂时贮存在细胞中，也可进一步氧化成硫酸盐。主要代谢 途径是在氧化无机硫化物过程中获得能量，并以二氧化碳为主要碳源来合成细胞 成分们。如图1 1 所示： ( c h 5 ) 2 s 辉州 2 c h 3 辄 2 h 2 0 2 1 t ， 凳o 。旦籼地 j 姐z 嘣( 粼2 n a 删d 斗h 8 h 2 0 s ? 0 ，。2 l i 6 u 【s 0 2 - 2 2 i c o o h ilg + h 2 h 2 s 0 2 c 0 2 幽i i 化能无机营养硫氧化细菌氧化d m d c ( _ 二甲一二硫醚) 的机理1 ( a ) n a d h 激活d m d s 还原酶 ( b ) m t 氧化酶 ( c ) 触酶 ( d ) 甲醛脱氢酶 ( e ) 甲酸脱氢酶 其代谢过程主要分为三步： ( a )c 。h v o ：n m s c 0 2 + h 2 0 + n h 3 + h 2 s ( b )h 2 s + 0 2 - s + h 2 0 + 能量 ( c ) s * h 2 0 + 0 2 一s 0 4 2 + h + + 能量 据文献报道h 2 s 的降解产物有硫酸根、亚硫酸根、硫代硫酸根、聚硫物质 等引。根掘其对各种碳化合物的同化能力不同，微生物可分为自养型和异养型 两种。自养菌能利用c 0 2 和c 0 3 2 - 中的碳元素作为营养源，利用光能和化学能在 细胞内合成复杂的有机物，进行生长繁殖，其中的化能营养型微生物在氧化h 2 s 的过程中获得生长所需的能量嵋。目前研究比较明确的能够代谢硫系恶臭物质的 微生物人多是自养型硫化细菌，它们虽在恶臭气体的生物处理中发挥很大作用， 但是生长速率比较低，处理过程中产生硫酸，对菌的生长产生抑制作用，并容易 产生二次污染1 8 1 0 国外的许多研究都是从不同环境中分离到能代谢硫系臭味物 质的菌种接种于生物脱臭器中。对于低浓度气体，单菌种接种即可获得满意效果， 高浓度混合恶臭气体可以接种两种菌或多种菌的混合菌。 白养型硫化细菌虽在恶臭气体的生物处理中发挥很大作用，但是它们的生长 速率比较低，处理过程中产生硫酸，异养菌与之相比生长速度远远大于自养菌， 且代谢产生类似于元素硫的聚合物，使反应过程中p h 值变化很小，有很好的应 用前景，包括： 1 垃圾渗滤液的除臭 垃圾渗滤液是指垃圾在堆放和填埋过程中由于发酵和雨水的淋溶、冲刷，以 及地表水和地下水的浸泡而滤出来的污水，它是垃圾填埋过程产生二次污染的主 要j 是l 素之。垃圾渗滤液的污染特性主要表现在：一是污染物种类繁多，含有较 多的酸、醇等，很多具有刺鼻的臭味。二是污染物浓度高，c o d 、b o d 变化范 围大。这使渗滤液的处理比般城市生活污水的处理难度加人。二三是明显的变化 性，渗滤液的产量和污染物的组成随着季节和填埋场使用年限而变化。 好氧处理包括生物塘、圈灌、生物膜法和活性污泥法等处理技术1 1 9 | 。然而， 目前国内外只有关于微生物处理垃圾渗滤液实验室成功的报道，而真正经济高效 的应用于实际的示范工程却鲜有报道。目前垃圾渗滤液多是按比例与城市生活污 水混合进入污水处理厂集中处理，但由于垃圾渗滤液组成成分的多样性和浓度的 不确定性，给污水处理造成很多麻烦。尤其是其恶臭问题，一直没有得到很好的 解决。因此事先用加入有效除臭菌既可降低臭味给人造成的感官不快，减少恶臭 空气污染，同时又可以降低渗滤液中的b o d 5 、c o d ，以便于进步的处理。 2 畜禽粪便的除臭4 4 川5 1 1 随着畜禽业不断的集约化和规模化生产，畜禽粪便产生的臭味逐渐成为大气 环境 j 染的部分。 ；j 莳，备禽养殖场或粪尿处理场所采用的除臭方法有很多， 如水洗法、吸着法、药液处理法、生物除臭法、空气稀释法和臭氧氧化法等。其 中，最为经济有效和最常用的方法是生物除臭法。其投资少、运营成本低、技术 简单、便于推广，因此比较适合我国大中型养殖场1 2 1 1 。如果在畜禽粪便中加入 有效除臭菌，分解其中大分子有机物和臭味物质，堆肥化处理后的粪便两到三天 即可完全消除臭味，而且处理后的残渣可以作为绿色有机肥料：此外鸡粪中含有 大量的能量1 2 0 13 3 0 只鸡一天的粪便所产生能量相当于1 l 汽油，可以利用它生 产沼气沼气发酵残渣也可作为反刍家畜的饲料。 3污水处理厂中的污泥除臭“7 1 近几年随着人们对环保认识的提高，污水处理在我国得到了迅猛发展，但 随之带来另一严重的环保问题，这就是如何妥善处置污水处理后产生的污泥，它 己成为整个污水处理行业亟待解决的问题。利用有益微生物可清除污水处理厂中 污泥的臭味，增加其利于植物吸收的营养成分，如：速效有机碳的含量。l 划时通 过污泥除臭过程中微生物发酵产生的生物热，可使污泥得到进一步干燥，降低污 泥干化成本，增加污泥肥料的市场竞争力。通过经济分析这种污泥处置方法是可 行的，可节省污水处理厂前期投资费用及日后生产运行费用，尤其对尚无污泥消 化_ i 。序的小型污水处理厂无疑是一种比较好的污泥处置途径1 2 2 1 。 1 4 本章小结 本章主要讨论了恶臭的产生、来源及通用的一些处理途径，同时深入讨论了 恶臭c 卜物处理方法的基本原理、研究进展和应用前景。本论文选用天津市双口垃 圾填埋场的垃圾渗滤液作为研究对象，从其中筛选出多株具有高效除臭性能的菌 种，并且应用于接触氧化反应器中，经实验研究证明具有良好的处理效果。我们 希望通过这篇论文，为生物除臭工艺的进一步深入研究奠定基础，并且希望研究 成果能够很快的应用到实际工程中去。 第章高效除臭菌的菌株驯化分离及单菌株生理生化性能测定 2 1 实验材料与方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 样品采集 采集白天津市双口垃圾填埋场的垃圾渗滤液和污泥样品。在这些样品中 的微生物已长期适应恶臭环境，含有较多的有效降解有机硫系恶臭物质的菌 株。 2 1 i 2 驯化物质 o l i 二甲基亚砜( d m s o ) ，结构式式为h 3 c 一卜c h 3 ，常温为无色透明液体， 具有高极性、高吸湿性、高沸点及可燃性。毒性极低，热稳定性好，能溶于 水、乙醇、丙酮、苯和氯仿等大多数有机物，是一种强极性溶剂。本文之所 以没有选择甲硫醇( m t ) 或硫醚作为驯化物质，是由于硫醇、硫醚等物质 沸点低，易挥发，不溶于水，对实验条件要求高，且臭闽值很低，臭味易挥 发到实验室空气中，而d m s o 易溶于水，沸点高，稳定性好，能很好的溶 于培养基中，且不易挥发，基本无臭1 2 3 1 用d i s 0 驯化蔺种以期使其能够打开d m s 中的c - - - - s 键，将大分子含硫 有机物通过一些中间产物降解成小分子的h 。s ，并将h ：s 进一步氧化 2 1 1 3 h 2 s 及氨产生源 l 一半胱氨酸( c y s ，分子量1 2 1 ，1 5 ) ，白色颗粒状结晶，有光泽，特征 味道，溶于水，乙醇丙酮，乙酸和氨水。c y s 的分子式为： h s c h 2 g h c o o 一 | n h 3 + 山于d m s o 分解的中问产物非常复杂，有d m s ( 甲硫醚) ，m t ( 甲硫 醇) 等小分子含硫有机物，并且因为这些物质不溶于水，因此不能进一步被 微生物利用，产生的h 2 s 量很少，给下一步实验带来困难，所以不选择d m s o 作为实验测定物质。初期实验证明，经过d m s o 驯化的菌能够很快使含有 c y s 的培养基产生大量的h 2 s 。在污染源所产生的h 2 s 中，绝大部分都是因 为含硫的生物有机体分解而产生的，而这里之所以选择半胱氨酸就是因为它 首先是种非常重要的有机体构成物质。另外。方面，它的本身结构和分解 过程相对简单，便于进行定量分析。再次，半胱氨酸易溶于水，便于实验测 定1 2 41 。 2 1 1 4 培养基 ( 1 ) 改良高氏一号培养基( 以下简称g 1 ) ：( 1 0 0 0 m 1 ) 可溶性淀粉2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，k n o 。l g ，n a c l0 5 9 ，k ：h p o 。0 5 9 ，k h ：p o 。 o 5 9 ，m g s o 。0 5 9 ，( n i t 。) 。s o 。0 5 9 ，加水至1 0 0 0 m l ，调节p h 至7 o 一7 2 ； ( 2 ) 液体g l 培养基： g l 培养基不加琼脂： ( 3 ) 高氏一号一一半胱氨酸培养基( g i c y s ) ： 在普通液体g l 培养基中减少淀粉的量，并加入一定量的c y s ； ( 4 ) 各种生理生化性能测定时所用培养基”1 2 1 1 5 仪器 h h b l l - - 5 0 0 型电热恒温培养箱：天津市中环实验电炉有限公司： z d x 一3 5 b i 型座式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂； t h z 一2 2 型台式恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂： 体视显微镜：| = = 1 本奥林巴斯( o l y m p u s ) 光学工业株式会社： t n i o o b 型托盘式扭力天平：上海第二天平仪器厂； g t 2 a 型精密天平：北京光学仪器厂 锥璎瓶、培养m 、移液管、橡胶塞、接种针、接种环、微波炉、滴定管、氮 气瓶等。 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 样品的采集和驯化 将采集的垃圾渗滤液样品l o m l 或污泥样品1 0 9 溶于9 0 m l 无菌水中，充 分碰荡后取其l m l 接入盛有9 9 m l 液体g l 培养基的锥形瓶。在培养基中加入 d m s o ，使其浓度达到碳源的2 5 ( 淀粉占7 5 ) 。用灭菌橡胶塞将锥形瓶密 封，3 0 。c 条件下l o o r m i n 振荡培养5 天后，取出1 0 m l 培养液转接入l o o m l 9 新鲜培养基中，同时d m s o 的浓度增加到5 0 。按照上述方法，每5 天转换 一次培养基，并依次将d m s o 浓度增加至7 5 ( 见表2 1 ) 。保持7 5 的浓度 不变，每隔5 天将菌转接到新鲜培养基中继续驯化“5 “。 表2 1 培养基中的碳源 将浸透过醋酸铅溶液的滤纸条伸入培养2 天后的锥形瓶上层气体中，观 察滤纸是否变黑。若变黑，说明d m s o 己被分解为h ：s 。 2 1 2 2 有效菌群除臭效能测定 ( 1 ) 锥形瓶上层气体中h ：s 含量的测定方法 用氮气酸化吹入，用乙酸一乙酸锌溶液吸收后再用碘量法测定。1 溶液的配制 a 0 0 5 m o 几n a ：s 1 0 ，标准溶液的配制： 准确称取1 2 4 9n a 。s 。仉( n a ：s ：0 ，5 h 扣) 溶于水中，稀释至1 0 0 0 m l ， 加入0 2 9 无水n a ：s 0 。保存于棕色瓶中。 b 重铬酸钾标准溶液( i 6 k ：c r ：0 f o 0 5 0 0 m o l l ) 的配制： 称取烘f i2 h 的基准或优级纯重铬酸钾1 2 2 5 9 溶于水中，移入1 0 0 0 m l 容量瓶，稀释至标线摇匀。 c 乙酸一乙酸锌溶液的配制： 称取6 0 9 乙酸锌和1 2 5 9 乙酸钠，用水溶解稀释到1 0 0 0 m l 待用。 d 0 1 m o l 几碘标准溶液的配制： 称取6 4 9i 。放入2 5 0 m i 烧杯，加2 0 9 k i 。移入1 0 0 0 m l 容量瓶中，稀 释至标线，棕色瓶中保存。 e 1 + lh ；p 吼溶液的配制： 5 0 m l 浓磷酸加入5 0 m 水中。 f 1 + 5h ：s o 溶液的配制： 2 0 m l 浓硫酸缓慢加入l o o m l 水中，边加边搅拌。 g 1 淀粉指示剂的配制： 称取l g 淀粉溶于1 0 0 m 水中。 测定过程及装置设计( 如图2 1 所示) i h ，p o n a a c z n ( a c h 溶 n a a c z n ( a c ) 2 溶液 图2 1n ：吹入法收集h ：s 气体装置 a 用标准重铬酸钾溶液标定n a 2 s ：0 ，： 向2 5 0 m l 碘量瓶中加入1 9 碘化钾及5 0 m l 水，加入重铬酸钾标准溶液 1 5 m l ，加入1 + 5 h ：s o 5 m l ，密塞混匀，暗处静置5 m i n ，用待标定的n a ：s ：0 。 溶液滴定至淡黄色时，加入l m l 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色刚好消失。 c 。( m o l l ) = 1 5 o o x 0 0 5 ( v i - v ：) 公式中，v 是滴定重铬酸钾的n a 。s ：0 。溶液用量，v 。是不加重铬酸钾的 空白用量。 b 按图2 1 连接好吹气装置，通n ：气检查各部位连接是否紧密。 c 向2 个吸收瓶中各加入5 0 m l 水及1 0 m l h a c z n ( a c ) ：吸收液。 d 待测培养液放入水浴锅内，迅速将密闭塞予换成3 孔塞，连接好装置， 丌启氮气气源，以连续冒泡的流速吹气5 m i n ，关闭气源。 e ，向分液漏斗中加入1 + 1 的磷酸1 0 m l ，开启分液漏斗活塞，待磷酸全 部流入后，迅速关闭活塞，开启气源，水浴温度控制在7 0 左右。 控制好载气流速，吹气4 5 m i n ，将导气管取下，关闭气源 f 碘量法测定硫化物：在两个吸收瓶中各加入1 0 m l 碘标准溶液，5 m ll + 5 硫酸溶液，密塞混匀。暗处放置5 m i n ，用新标定的硫代硫酸钠标 准溶液滴定至淡黄色时，加入i m l 淀粉指示液，继续滴定至蓝色刚好 消失，记录用量。 g 空白实验： 取未接菌的g i - - c y s 培养基，按照上述方法通n ：，4 5 m i n 后用碘量法 测定硫代硫酸钠溶液用量。 h ：s 含量( s ”，m 0 1 ) = ( v o - v 。) * c 2 0 0 0 式中，v 。一空白实验中硫代硫酸钠标准溶液用量( m 1 ) ； v 一水样滴定时，硫代硫酸钠标准溶液用量( m 1 ) ； c 一硫代硫酸钠标准溶液浓度( m o l l ) 。 锥形瓶中h ：s 的含量( s ”，m 0 1 ) = 瓶l 中h 。s 含量+ 瓶2 中h ：s 含量 ( 2 ) 半胱氨酸用量的确定 取6 个分别含不同量c y s 和2 9 淀粉的2 0 0 m lg i 培养基的锥形瓶( c y s 的含 量见表2 2 ) ，灭菌后振荡放置1 天，分别取l o m l 新鲜菌液加入到6 个锥形 瓶中，用橡胶塞密封，3 0 条件下l o o r m i n 振荡培养2 天后( 初期实验证 明振荡培养2 天后c y s 的分解率达到峰值) ，用碘量法测定h ：s 的产生量。计 算各浓度c y s 被分解成h ：s 的转化率，选取最高转化率的c y s 浓度值作为下 一步测定的浓度。 表2 2c y s 的含量 ( 3 ) h ：s 的产生与转化曲线 分别取5 份2 0 0 m l 液体c y s g 1 培养基，其中淀粉含量为l o m g m l ，c y s 的用量根据上一步中得到的最大转化率确定。灭菌后振荡放罱1 天，接菌并 分别振荡培养l 天，2 天，3 天5 天后，取出i m l 稀释平板法汁菌落数， 然后将剩余菌液用氮气酸化吹气，并用乙酸一乙酸锌溶液吸收，用碘量法测 定l l ：s ，作出时删一h ：s 含量曲线。 同样取5 份灭菌的2 0 0 m l 液体c y s - - g i 培养基，将淀粉含量升高到 2 0 m g m l ，c y s 用量不变，用上述方法接菌培养，测1 天，2 天，3 天5 天后的菌落数和h 。s 含量。 h 。s 产生效率= h ：s 的含量( m 0 1 ) 菌落数( 个l ) ( 4 ) h 2 s 氧化产物的测定 c y s 降解的产物是s 和氨气，而h ：s 氧化的最终产物非常复杂：自养型 硫化细菌在有氧条件下产生硫酸等阴离子硫化物( 如硫酸根，硫代硫酸根 等) ，可以用离子色谱测定；而异养菌在缺氧条件下代谢则产生硫、聚硫物 质，可用x 一射线衍射法测定。不含c y s 的培养基作为空白对照。由于实验条 件和实验时刚限制，h ：s 的氧化产物有待在下一步实验中定量测定。 ( 5 ) 单菌种的分离、保存与生理生化性能测定 单菌的分离与保存 l m l 培养液被稀释一定倍数并接种到营养琼脂平板培养基上，3 0 。c 培养。直 到能看到单一菌落。将单菌落划线培养后接种在琼脂营养斜面上，一4 冷冻 可长期保存。 单菌的生理生化性能测定 按文献所列方法进行“。 2 2 实验结果与讨论 2 2 1 试验结果 2 2 1 1 驯化结果 在经过数次转接驯化的7 5 d m s o 的g l 培养基振荡培养2 天后，上层 气体使醋酸铅试制明显变黑，说明菌已经能够将c s 键打开，经过一系列 中间过程生成了h ：s ( 见表2 3 ) 。经过d m s o 驯化。已经将不能耐受高浓度 d m s o 的菌淘汰，剩下的是能够耐受并可利用d m s o 有效菌。 表2 3d m s o 驯化过程及结粟 2 2 ，l ，2 有效菌群除臭性能测定 ( 1 ) 半胱氨酸的浓度对转化率的影响 6 个平行实验的测定结果见表2 4 和图2 2 所示： c y s 的转化率= 已经转化成h 2 s 的c y s 量总共加入的c y s 量 表2 4 不同氨基酸浓度及其在培养第二天的转化率 9 0 8 0 7 0 琶6 0 褂5 0 琏4 0 邀3 0 占2 0 1 0 0 q q q 9q 、 c y s 含量( r a g m 1 ) 十c y s 降解率( ) 图22c y s 的浓度对转化率的影响曲线 图2 2 中的数据表明，半胱氨酸在g l 培养基中的转化率最高可达 7 8 7 5 ，这一转化率是在0 1 m g m lc y s 的浓度下实现的。如再增加 c y s 的浓度，1 1 ：s 的生成量会稍有增加，但是转化率显著降低。因此，我 们选用1 0 0 m g l 作为测定h ：s 产生和降解实验的c y s 浓度。 ( 2 ) h 。s 的产生与降解曲线 每个锥形瓶中含有2 0 0 m l 培养液，其中c y s 为2 0 m g ，淀粉含量分别 为l o m g m l 和2 0 m g m l ，锥形瓶上层气体中h 。s 含量和微生物生长情况随 培养时削的变化如表2 5 、表2 ，6 以及图2 3 、图2 4 所示： h ：s 的产生率= 实际产生的h 。s 量菌落数 表2 5h 2 s 含量随培养时间的变化( 淀粉含量1 0 m g m 1 ) # 黼 瓶1 消耗瓶2 消耗空白消耗 n a ：s = o s 浓度h 磊的量菌落数 h 。s 产生率 n a 2 s z 0 3 ( m 1 )n a 2 s z 0 3 ( m 1 ) n a 2 s 2 0 3 ( m 1 )( m o l l )( 1 05 m 0 1 )( 个m 1 ) ( m o l m l f ) l7 2 09 8 01 0 0 00 0 5 0 7 5 05 x 1 0 81 5 x 1 0 “ 5 4 0 7 9 0 9 4 0 9 8 5 9 6 0 9 7 0 1 0 1 5 1 0 0 5 1 0 1 0 0 0 5 0 0 0 5 0 0 0 5 0 1 3 1 3 6 5 0 2 7 5 4 l o “ l2 x 1 0 。2 15 1 0 1 2 3 3 1 0 1 6 5 4 x 1 0 7 1 8 x 1 0 一7 5 9 5 09 7 51 0 1 00 ，0 5 02 3 8 1 2 x 1 0 “2 0 1 0 7 表26 h z s 含量随培养时间的变化( 淀粉含量2 0 m g m 1 ) 。二* 瓶l 消耗 瓶2 消耗空白消耗n a 2 s z 0 。浓度h z s 的量 菌落数h z s 产生率 n a ：s m 0 ( m 1 ) n a ：s 。0 ( m 1 ) n a 2 s 2 0 ，( m 1 )( m o i ，) ( 1 0 。5 m 0 1 )( 个m 1 ) ( m 0 1 m 1 个) 1 4 芎1 2 雹1 0 =8 囊6 塑4 若、2 o 2345 培养时间( 天) + 淀粉1 0 m g m l 廿淀粉2 0 m g m l 图2 3时间一硫化氢含量曲线 5 ： e o 翌 呈 v 燕 七 坦 0 l2345 培养时间( 天) 十淀粉l o m g m l 廿淀粉2 0 m g m l 图2 4 混合菌在g l - - c y s 培养液中的生长曲线 山图2 3 可以看出，h ，s 在锥形瓶上层气体中的含量先增加后减少， 在第二天出现一一个最大值。这说明c y s 先被微生物分解为小分子的h 。s ， h ：s 又因为在微生物的作用下被氧化成其他物质而减少。在第二天之前， h 。s 的产生速率大于氧化速率，含量增加；在第二天后，h ：s 的氧化速率 大于产生速率，含量减少。在第5 天的时候，h ：s 的量已由1 3 1 3 l o - 5 m o l 减少到2 3 8 1 0 一m o l ，氧化率达8 2 。当淀粉浓度增加为2 0 m g m l 时， c y s 的转化率明显降低，而生物量增加，这说明增加其他一些碳源有机 物浓度会抑制微生物对c y s 的降解。这是因为微生物在复合基质中，因 为有其他可以利用的基质同时被消耗分解的缘故。 ( 3 ) i i ：s 的氧化产物 掘文献报道，h ：s 的氧化产物有s 仉”、s 0 3 、s ：0 3 2 - 和聚硫化合物( 化学 性质类似于硫的多聚体物质) “，但由于这些物质在培养液中含量很少， 培养液物质组成成分复杂，普通的分析化学方法无法测出。我们曾用离 子色谱法检测到s 0 ，。s 0 和其他氧化产物随时问的变化曲线有待进一 步实验证明。 ( 1 ) 单菌株的生理生化性能 分离得到8 株菌c , - c 。，它们的生理生化性能测定结果如表2 7 所示。 6 其主要特征如下： 将菌液8 09 c 水浴处理1 0 m i n ，再铺平板3 7 c 培养，发现所有菌长势良好， 说明c , - c 。皆为芽孢秆菌。 c ：和c 。是革兰氏阳性菌，其他都是革兰氏阴性菌。 通过b 一半乳糖苷酶实验，c ：、c 。、c 。、c 。、c ，具有b 一半乳糖苷酶，能 够打开糖苷键。 通过葡萄糖铵实验，c ：、c ，、c 。、c ；、c 。、c ，能利用铵盐作为唯一氮源生 长。 v - p ( 产酸产气实验) 和m p ( 甲基红) 实验说明，e ：、g 、c j 、c 。、c ，能 分解葡萄糖产酸。 通过硝酸盐还原实验，说明c 。、c 。、c 。、c 。、c ，能够在缺氧条件下将硝酸 盐还原成n o ：或者和n 乩。 在酪蛋白分解实验中，c ：c 。周围能够产生透明圈，说明菌落能够将蛋 白质分解。 氨基酸脱羧酶实验表明，除c 。之外，所有的菌都能使氨基酸脱掉羧基， 产生碱性的胺类物质。 尿素酶实验说明除c 。外，所有的菌都能打开c n 键。 氧化酶实验和过氧化氢酶实验说明只有c 。和c 。含有细胞色素氧化酶。也 就是蜕，只有c 和c 。没有过氧化氢酶，其他6 株菌都能分泌过氧化氢酶。 t t c 实验说明所有的菌都具有脱氢酶。 淀粉水解实验表明只有c 。和c 。能够分泌淀粉酶，水解淀粉。 耐盐性实验说明几乎所有的菌都能够耐受3 以下浓度的盐溶液，而不 能耐受3 以上的浓度。 表2 7 单菌株的生理生化性能 菌落特计 芽孢有无 革兰氏染色 。，如 网形十网形分圆形分厕形- 分 圆形，分圆形分圆形t 分圆形二_ f 口 燥泌物泌物泌物泌物泌物泌物燥 颜色口也 白色白色白色白色白色白色白色 + + + j一上、 1 3 一半乳糖营酶实验一+一+ 一 葡萄糖铵实验 一+ + 一 v p 实验一+一+ 一 m p 实验 一一 + 一 硝酸盐还原实验n o 。未 还原成还原成还原成还原成还原成 还原成n o 。未 还原n 0 ：一 n 2 和n h 。 n 0 2 一 n 晚一n 吼一n o ：一还原 酪甾向分解实验一+ 氨基酸脱羧酶实验 + 一+ 尿素酶实验 +一+ + 氧化酶实验 +一 一一一一一+ 细胞色素氧化酶实验 +一一一一 一一+ 过氧化氢酶实验 一+ +一 t t c 实验+ 淀粉水解实验 +一一 一一一一+ 3 + 耐盐性实验 7 一 一一一一一一一 1 l 一一一一 一一一一 初步判定c 一c 。均为芽孢杆菌属，他们的共同特征是化能异养菌，好氧或兼 性厌氧。 2 2 2 结果与讨论 ( 1 ) 培养过程中好氧厌氧的问题 山h 。s 转化成聚硫物质、s 0 。”、s o 。”等最终产物是氧化过程。而由于实 验条件的限制，我们实验中一直采用用三角瓶振荡培养，将其看作是有氧气 接触的环境。但实际过程中很有可能因为有机物分解过快或者三角瓶棉塞透 气性差等问题造成局部缺氧甚至厌氧环境。这样可能会造成h 2 s 无法完全被 氧化，导致h 2 s 累积而使c y s 向h 2 s 的转化受到很大程度的抑制。这也证明 了，为什么c y s 的转化率最高只能达到8 0 左右。 在实验过程中，我们把刚刚灭菌并冷却的g 1 - - c y s 培养基立即接菌培养 与灭菌后先将锥形瓶放入摇床振荡l 天充氧后再接菌做过比较，发现空瓶振 荡一天后由于培养基内氧气含量较多，c y s 的转化率明显增加( 由4 0 左 右卜升到6 0 以上) 。 我们在做h 2 s 产生与转化曲线时，培养过程中锥形瓶始终是用橡胶塞密 封( 防止h 2 s 损失) ，这必然造成缺氧环境，而c y s 何以能够分解，h 2 s 又 何以能够被氧化呢? 我们推测，可能是培养基中含有的k n 0 3 提供了氧。通 过实验，我们发现用n h c i 作为氮源代替k n 0 3 作为氨源时，菌种生长速度 明显缓慢h 2 s 的生成量也明显减少。在葡萄糖铵实验中，我们知道大多数 菌都能利用n h 4 c i ( 铵盐) 作为氮源生长，这只能说明k n 0 3 在培养基中除 了作为氮源，而且作为一种必不可少的氧化剂而存在，在c y s 的降解过程中 起到重要作用。在实验条件下，我们筛选出来的菌种是好氧菌，但也能够在 缺氧或厌氧条件卜生长，把这些除臭菌制成菌制剂，应该可以很好的应用于 垃圾渗滤液、粪池、污水等缺氧环境。 ( 2 ) 碘量法测硫化物时空白实验为什么用不接菌的g 1 - - c y s 培养基，而不是直接 用蒸馏水? 在通入n 。的过程中，很可能带出锥形瓶中其他挥发性物质或气体，而这 些物质的性质和含量都是不可知的，有可能被乙酸一乙酸锌溶液吸收并与 n a ：s 。0 反应，对测定结果造成影响。因此，用不接菌的g 1 - - c y s 培养基做空 白，进行同样的操作，可以最大限度的扣除其他物质带来的影响。 ( 3 ) h ! s 的氧化产物 h 2 s 被除硫菌利用后的产物应该仍然是很复杂的，因为仪器装置和实验 时间的限制，我们无法确切的测出所有的产物，只能从以前的报道中得知自 养菌代谢h 2 s 产物是s 0 4 2 - ，而异养菌的代谢产物是聚