（农药学专业论文）苏云金芽孢杆菌WB9的研究.pdf

独创性声明 y 7 7 4 9 4 0 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是在指导教师的指导下，通过 我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和 致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：l 末黼易 日期：加r 只；y 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定， 即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文 的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文作 指导教师亲笔签名： 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 一 舌客确参 v 日期：2 万， ； 日期：口，f ， 福建农林大学博士学位论文 摘要 本文对土壤中分离的苏云金芽孢杆菌w b 9 菌株的生理生化特性、小菜蛾和 甜菜夜蛾的致病力测定、编码活性因子的基因分析、杀虫蛋白基因的克隆和表 达、工业培养基的室内摇瓶优化筛选以及茶尺蠖的室内外防治试验等进行了较 为系统深入的研究。 采用醋酸钠法加热处理和抗生素的分离方法，对收集自武夷山自然保护区 非耕作区的2 0 0 个土壤样品进行了分离，得到1 2 株苏云金芽孢杆菌菌株，出菌 率为6 0 。对w b 9 菌株的室内致病力测定结果表明其对小菜蛾具有高致病力、 对甜菜夜蛾具有较高的致病力。 以库斯塔克亚种的8 0 1 0 和8 3 1 l 菌株以及鲇泽亚种的n o 1 菌株为对照，对 新分离的w b 5 、w b 7 和w b 9 菌株的1 2 项经典生理生化指标进行了测定。测定结 果显示w b 9 和w b 5 分别与库斯塔克亚种8 0 1 0 和鲇泽亚种n o 1 的生理生化反应 特性表现相同，仅在个别反应上有强弱差异。由此推测，w b 9 和w b 5 可能分属 库斯塔克亚种和鲇泽亚种。 采用p c r 及p c r - r f l p 技术对w b 9 的i c p 、v i p 、几丁质酶和肠毒素4 种活 性因子的编码基因进行了分析。结果表明：该菌株含有编码i c p 蛋白的e r y l a a 、 c r y l a b 、c r y l c b 、c r y l f a 和c r y l g a5 个c r y l 基因型，编码v i p 3 a 蛋白的v i p 3 a 基因以及编码3 种肠毒素的肋n 、b e e t 和e n t s 基因，不含编码几丁质酶的基 因。将v i p 3 a 、h b l a 、b e e t 和e n t s 基因的p c r 产物回收纯化后直接测序，利用 在线的b l a s t 软件进行同源性分析，前两个基因片段的核苷酸序列与苏云金芽 孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性分别为9 9 和9 6 9 8 ，b e e t 基因片段 与蜡质芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性为9 7 ，e n t s 基因片段与苏 云金芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌已公布基因序列的相应片段同源性为9 4 9 9 。 设计可扩增出e r y l a b 基因完整的开放阅读框( o r f ) 的引物对f l 和r l ， 通过p c r 技术从w b 9 中扩增出全长的c r y l a b 基因。利用高效克隆p c r 产物的专 塑壁垒苎查兰苎主兰垡笙苎 用载体p m d l 8 一t 。直接从p c r 产物中克隆了c r y l a b w b 9 基因，测序结果表明该 基因( g e n b a n k 登录号为a y 6 4 6 1 6 6 ) 由3 4 7 1 个碱基组成，编码含有1 1 5 6 个氨基 酸残基的蛋白质。该蛋白质的分子量为1 3 0 5k d a ，等电点为5 0 4 , 为弱酸性 蛋白质。在c r y l a b w b 9 蛋白的氨基酸组成中，亲水性氨基酸占3 0 8 ，疏水性 氨基酸占4 5 2 ，酸性氨基酸占1 2 9 ，碱性氨基酸占1 1 1 。氨基酸序列的同 源性分析结果表明：c r y i a b w b 9 蛋白与已报道的c r y l a b 蛋白同源性为 9 5 4 9 9 7 ，该蛋白的4 个氨基酸残基一p r o 。、g l y 。、g l y 。和g 1 y 。与其 它已报道c r y l a b 蛋白相应位置的氨基酸残基均不同，且比所有已报道的 c r y l a b 蛋白( c r y l a b 2 蛋白除外) 多了一个氨基酸残基。现在，c r y l a b - w b 9 基 因已被苏云金芽孢杆菌国际命名委员会确认为一个新的c r y l a b 基因，命名为 c r y l a b l 7 。该基因编码的c r y i a b l 7 蛋白己被添加到苏云金芽孢杆菌c r y 蛋白的 目录中，成为c r y 家族中的一个新成员。 从g e n b a n k 中获得c r y l a a 、c r y l a c 、c r y l a d 、c r y l a e 、c r y l a g 及已报道 c r y l a b 蛋白的代表性核苷酸序列和氨基酸序列，利用在线的c l u s t a lx 软件， 将c r y l a b l 7 蛋白的序列同它们进行多重比较，然后根据比较结果，应用p a u p 4 0 构建了它们的系统发育树。 利用在线蛋白质分析软件p r e d i c t p r o t e i n 对c r y l a b l 7 蛋白的二级结构进 行了预测分析，结果表明在该蛋白的二级结构中，螺旋结构占3 1 9 6 ，折叠结 构占2 7 6 9 ，成环结构占4 0 3 5 。同时，应用s i g n a l p3 os e r v e r ( b ! b ； ! ! ! ：! ：! g ：d e i i ! ! ! i i g j ! ! ) 军2z i ps e r v e r ( b ! ! b ；! 鲨! ：2 9 i 2 ：婴q ! g ! ： d e ) 分析了c r y i a b l 7 蛋白的氨基酸序列。发现该蛋白中不含信号肽序列和亮氨 酸拉链结构。 以c r y i a a 蛋白的三维结构为模板，在氨基酸序列同源性比较的基础上， 利用氨基酸替代获得了c r y l a b l 7 蛋白的3 个结构域的组成。c r y l h b l 7 蛋白的 结构域i 由2 2 1 个氨基酸残基( t y r 。t oa r g 。) 组成，结构域i i 由1 9 8 个氨 基酸残基( a r g 。t op h e 。) 组成，结构域i i i 出1 4 7 个氨基酸残基( a s h 。t o 2 塑丝查苎奎兰苎主兰些堡苎 t h r 。) 组成，它仃1 与c r y l a a 蛋白对应结构域的氨基酸序列同源性分别为 9 6 8 、6 8 2 和1 0 0 。 将克隆的c r y l a b l 7 基因插入表达载体p e t 一2 9 a ，构建了重组表达质粒 圜t - 2 9 a c r y l a b l 7 ，采用c a c l 。法将其转化到大肠杆菌b l 2 1 进行原核表达，筛 选出的稳定转化子经lm m o l li p t g 诱导表达了分子量大小约为1 3 0k d a 的 c r y l a b l 7 蛋白。以3 龄小菜蛾幼虫为靶标昆虫，生物测定结果表明表达产物具 有高杀虫活性。 以来源容易获取的农副产品为主要原料，通过正交试验设计和室内摇瓶培 养，对w b 9 的工业培养基各组分配比进行了初步优化筛选，获得了优化后的培 养基组合，其组成为玉米淀粉3 0 9 6 、黄豆饼粉2 o 、玉米粉1 5 、酵母粉 1 0 、蛋白胨0 2 、玉米浆1 5 、c a c o ，0 5 、m g s o , 7 h d0 0 3 、k h ：p o , o 1 和z n s o 7 h d0 0 0 2 。此外，以茶树主要害虫之一茶尺蠖为靶标害虫，测 定了w b 9 的室内外防治效果，结果表明其与防治该害虫的常用化学农药8 0 敌 敌畏乳油的防治效果大致相当，但致死速度较慢。 关键词；苏云金芽孢杆菌；分离；生理生化特性：活性因子；克隆和表达：培 养基优化 3 福建农林大学博士学位论文 a b s t r a c t b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b t ) i sa ne n t o m o p a t h o g e na n d h a sb e e nu s e da s a ni n s e c t i c i d a l a g e n t f o rd e c a d e si nc o m m e r c i a l a g r i c u l t u r e f o r e s t m a n a g e m e n t a n dm o s q u i t oc o n t m l i t si n s e c t i c i d a la c t i v i t yi sp r i m a r i l yd u et o t h ei n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ( i c p s ) f o r m e dd u r i n gt h es t a t i o n a r ya n d s p o r u l a t i o np h a s eo ft h eg r o w t hc y c l e m o r et h a n3 0 0 0i n s e c ts p e c i e sw i t h i n 1 6o r d e r sw e r ed e m o n s t r a t e dt ob es u s c e p t i b l et od i f f e r e n tb ti c p s t h e s e a r c hf o rn o v e lb ti s o l a t e sa n dn e w c r yg e n e si sa no n g o i n ge f f o r tw o r l d w i d e h e r e i n w er e p o r t e dan o v e is t r a i ni s o l a t e df r o ms o l ia n di t sb i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c ，t o x i c i t yt op l u t e l l ax y l o s t e l l aa n ds p o d o p t e r ae x i g u a g e n e st o e n c o d ea c t i v ef a c t o r s ，a sw e l la s c l o n i n ga n de x p r e s s i o n o fc r y la b l 7 o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i aa n dc o n t r o lo fe c t r o p i so b l i g u a am e t h o dw a sd e v e l o p e dt oi s o l a t eb a c i l l u s t h u r l ：n g i e n s i sf r o ms o i l s a m p l e sc o l l e c t e df r o mw u y im o u n t a i ni ns o u t h e r nc h i n a t w e l v eb ts t r a i n s w e r eo b t a i n e df r o m2 0 0s o i ls a m p l e sa n dt h ep r o p o r t i o nw a s 6 0 b i o a s s a y s h o w e dt h a tw b 9w a sh i g h l ya n dm o d e r a t e l yt o x i ct op l u t e l l ax y l o s t e l l aa n d s p o d o p t e r ae x i g u a ，r e s p e c t i v e l y t h eb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fw b 5 ，w b 7a n dw b 9s t r a i n sw e r e t e s t e db yu s i n gb t k u r s t a k 8 0 1 0a n d8 3 1 1 ，a n da i z a w a i n o 1a sc o n t r o l s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep r e s e n t a t i o n so fb i o c h e m i c a lr e a c t i o n so fw b 9a n d 8 0 10 a n dw b 5a n dn o 1 w e r et h es a m e t h u s i tc a nb ed e d u c e dt h a tt h e p o t e n t i a ls t a t u so fs e r o v a ro fw b 5a n dw b 9w e r ea i z a w a ia n dk u r s t a k ， r e s p e c t i v e l y p c r - r f l pa n dp c rt e c h n o l o g yw e r eu s e dt oa n a l y s et h ee n c o d i n g g e n e sf o ra c t i v ef a c t o r so fw b 9 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw b 9 c o n t a i n e df i v e 4 福建农林大学博士学位论文 d i f f e r e n tc ，y 1 g e n e s ，c l a a ，c l a b c ，y l c b c r y l f aa n dc r y l g a 。a n da l s o t h e 帅3 a 加，a b c e ta n de n t sg e n e s h o w e v e r , n oc h ig e n ew a sf o u n d t h e p c rp r o d u c t so fv i p 3 a h b l a ，b c e ta n de n t sw e r ep u r i f i e da n dd i r e c t l y s e q u e n c e d h o m o l o g yc o m p a r i s o nr e v e a l e dt h a tn u c l e o t i d es e q u e n c e so f v i p 3 aa n d 肋舱o fw b 9h a d9 9 a n d9 6 - 9 8 i d e n t i t yw i t ht h o s eo ft h ek n o w n v i p 3 aa n dh b l ao fb t ，r e s p e c t i v e l y , a n db c e to fw b 9h a d9 7 i d e n t i t yw i t ht h e k n o w nb c e to fb a c i l l u sc e r e u s ( b c ) ，w h e r e a se n t so fw b 9h a d9 4 9 9 i d e n l i t yw i t ht h ek n o w n e n t so fb ta n db c t h ee n t i r ec o d i n gr e g i o no ft h ec ，y i a b - w b 9g e n ew a sp r o d u c e db yp c r w i t hp r i m e r sf 1a n dr 1 p c r p r o d u c tw a sp u r i f i e d ，c l o n e di n t op m d l 8 - t a n d s e q u e n c e d n u c l e o t i d es e q u e n c eo fc r y l a b - w b 9h a db e e nr e g i s t e r e di n g e n b a n k ( a c c e s s i o nn o a y 6 4 6 1 6 6 ) i tc o n s i s t so f3 4 7 1b a s e sw h i c h e n c o d e dap r o t e i no f115 6r e s i d u e sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f 13 0 5k d aa n da nd v a l u eo f5 0 4 a m i n oa c i d so fc r y l a b - w b 9c o m p r i s e d 3 0 8 o fh y d r o p h i l i ca m i n oa c i d s ，4 5 2 o fh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d s 。1 2 9 o fa c i d i ca m i n oa c i d sa n d11 1 o fb a s i ca m i n oa c i d s t h ed e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c eo fc r y la b - w b 9s h o w e d9 5 4 t o9 9 7 i d e n t i t yw i t ht h o s eo f t h ek n o w nc r y l a bp r o t e i n s f o u rr e s i d u e s ( p r 0 1 7 0 g l y 4 4 9 ，g l y 7 9 6a n dg l y e 6 3 ) o fc r y l a b - w b 9w e r ef o u n dt ob ed i f f e r e n tf r o mt h o s eo ft h er e s p e c t i v e c o r r e s p o n d i n gp o s i t i o n i n a l lk n o w n c r y l a bp r o t e i n s i na d d i t i o n ， c r y l a b w b 9w a so n er e s i d u el o n g e rt h a ne a c hk n o w nc r y l a b ( e x c e p tf o r c r y l a b 2 ) t h ec r y l a b - w b 9h a db e e nn a m e da sc r y l a b l 7b yt h eb t d e l t a - e n d o t o x i nn o m e n c l a t u r ec o m m i t t e ea n db e c o m ean e wm e m b e ro fb t c r yt o x i n s t h en u c l e o t i d ea n da m i n oa c i dr e p r e s e n t a t i v es e q u e n c e so fc r y l a a 、 c r y l a c 、c r y l a d 、c r y l a e 、c r y l a ga n dt h ek n o w nc r y l a bp r o t e i n sw e r e 5 福建农林大学博上学位论文 d o w n l o a d e df r o mg e n b a n ka n da l i g n e dw i t ht h o s eo fc r y l a b l 7b yu s i n g c l u s t a lx ap h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e du s i n gp a u p4 0f 2 0 0 0 r e p l i c a t e s u n r o o t e dt r e e ) t oe v a l u a t et h eb i o l o g i c a le v o l u t i o n o ft h e s e p r o t e i n s w i t hp r e d i c t p r o t e i nf o rt h e p r e d i c t i o n o fs t r u c t u r e i ti n d i c a t e dt h a t 3 1 9 6 o fh e l i x 。2 7 6 9 o fs h e e ta n d4 0 3 5 o fl o o pi ns e c o n d a ws t r u c t u r e o fc r y l a b l 7 m o r e o v e r , s i g n a l p3 0s e r v e r ( h t t p ：l l w w w c b s d t u d k s e r v i c e s l g d 坌! 已) a n d2z i ps e r v e r ( h t t p ：w w w 2 z i p , m 0 1 q e n , d e ) w e r eu s e dt oa n a l y z e t h ep r e s e n c ea n dl o c a t i o no fs i g n a lp e p t i d ec l e a v a g es i t e sa n dl e u c i n e z i p p e ri nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn o s i g n a lp e p t i d eo rl e u c i n ez i p p e rw a s f o u n di nc r y l a b l 7 b a s e do nt h es t r u c t u r ea s s i g n m e n to fc r y l a a ，t h et h r e ed o m a i n so f c r y l a b l 7w e r ep r o p o s e dh e r e d o m a i nl c o n s i s t so f2 2 1r e s i d u e s ( t y r 3 3t o a r 9 2 5 3 ) w i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f2 5 6k d a a n da np lv a l u eo f4 7 6 d o m a i ni ic o n s i s t so f19 8r e s i d u e s ( a r 9 2 6 5t op h e 4 6 2 ) w i t hac a l c u l a t e d m o l e c u l a rw e i g h to f2 1 9k d aa n da np lv a l u eo f7 2 1 d o m a i n 川c o n s i s t so f 1 4 7r e s i d u e s ( a s n 4 6 4t ot h r 6 1 0 ) w i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a r w e i g h to f1 5 8k d a a n da np lv a l u eo f1 0 8 3d o m a i ni 。i ia n di i io fc r y l a b l 7w e r e9 6 8 ， 6 8 2 a n d10 0 i d e n t i c a lt ot h ec o r r e s p o n d i n gd o m a i n so fc r y la a t h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i dp e t - 2 9 a - c o f l a b l7 w a s c o n s t r u c t e db yi n s e r t i o no fc r y l a b l 7g e n ei n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o r p e t - 2 9 a a n dt h e nw a st r a n s f o r m e di n t o ec o i lb l 2 1t oe x p r e s st h e c r y l a b l 7u n d e rt h ei n d u c t i o no f1m m o l ll p t g s d s p a g es h o w e dt h a t t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ee x p r e s s e dp r o d u c tw a sa b o u t13 0k d a ，w h i c h c o r r e s p o n d sw i t ht h ec a l c u l a t i o nb ys e q u e n c e b i o a s s a yr e v e a l e dt h a tt h e e x p r e s s e dc r y l a b l 7e x t r a c t e df r o mt h ec u l t u r em e d i u mw a sh i g h l yt o x i ct o 6 福建农林大学博士学位论文 3 旧i n s t a rl a r v a eo f 只b f e ax y l o s t e l l a g e n e r a l t y s o m ei n e x p e n s i v ea n da v a i l a b l ea g r i c u l t u r a tb y p r o d u c t s w e r eu s e di nt h em a s sp r o d u c t i o no fb t a no r t h o g o n a ld e s i g nw a ss e l e c t e d t oa r r a n g eb a t c hf e r m e n t a t i o ni ns h a k e rf l a s k st oc a r r yo u tt h eo p t i m i z a t i o n o fm e d i aw i t hw b 9s t r a i n t h eo p t i m a lc o m b i n a t i o nc o m p r i s e d3 o o fc o r n m e a l 2 0 o fs o y b e a np o w d e r 1 5 o fc o r np o w d e r , 1 0 o fy e a s tp o w d e e o 2 o fp e p t o n e 。1 5 o fc o r ns y r u p ，o 5 o fc a c 0 3 ，0 0 3 o fm g s 0 4 。7 h 2 0 0 1 o fk h 2 p 0 4 a n d0 0 0 2 o f 办s 0 4 7 h 2 0 w a s o b t a i n e d i n a d d i t i o n 1 a b o r a t o q , t e s t sa n ds m a l l - s c a l ef i e l dt r i a l sw e r ec o n d u c t e dt oo o n b o le c t r o p i so b t i g u aw i t ht h e f e r m e n t a t i o nc u l t u r e so fw b 9 1 ts h o w e dt h a tb o t hw b 9a n d8 0 d i d i w e i c o u l db eu s e df o rc o n t r o l l i n gt h i sp e s te f f e c t i v e l y k e yw o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ；i s o l a t i o n ；b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c a c t i v ef a c t o r ；c l o n i n ga n de x p r e s s i o n ；o p t i m i z a t i o no fm e d i a 7 福建农林大学博士学位论文 1 前言 环顾全球，为了满足每年以2 比率持续上升的世界人口对食物不断增长 的需求，重视和发展农业，籍以安邦定国，始终是各国政府的一个重要目标和 紧迫任务。据联合国粮农组织( f a o ) 估计，世界粮食生产因虫害常年损失1 4 ， 病害损失1 0 ，草害损失1 l ，鼠害损失2 0 。全世界每年因有害生物造成 的损失达1 2 3 0 亿美元( 戴小枫等，1 9 9 7 ) 。我国是一个以种植业为主的农业大 国，病虫草鼠害种类多、发生频繁。1 9 9 2 年，仅棉铃虫( h e l i c o v e r p a 口r m 0 阳， h a ) 危害，造成棉花减产超过3 0 ，直接经济损失达1 0 0 亿元以上。为了对 付病虫害，人们尝试各种手段以求最大程度地挽回损失，其主要措施是采用化 学防治。化学农药虽然在防治病虫害上取得显著的经济效益，但随着时间的推 移，其弊端( 对人体健康的危害、对有益生物的杀伤、对环境和食品的污染以 及害虫抗药性剧增等) 日益突出，越来越受到人们的关注。 1 9 6 2 年，美国海洋生物学家卡尔逊在寂静的春天一书中指出：我们 生活在化学化的社会中，野生动物的今天，就是人类的明天，因为我们只拥有 一个地球。作者满怀对人类生存环境的忧虑，以浓重的笔墨描述了杀虫剂污染 造成对环境严重危害的凋零、肃杀景象，阐明了人类同大气、海洋、河流、土 壤和动植物的密切关系。1 9 9 6 年，美国副总统戈尔撰序的我们失落的未来 一书再次向人们敲响了警钟。可喜的是，长期施用化学农药所带来的严重后果 已为世人所关注，也引起了各国政府的高度重视。全世界化学农药的销售量不 断下降，代之而起的是生物农药。自9 0 年代始，世界生物农药产量每年阻1 0 - 2 0 的速度递增，对生物农药的研究开发已不是一些新兴的生物技术工程公司的专 利，一些世界驰名的跨国企业集团也相继介入这一新兴科技产业领域( 关雄等， 1 9 9 9 ) 。 随着我园的入世，保护和遵守知识产权势在必行，我国生产使用的大多数 8 福建农林大学博士学位论文 化学农药属于仿制品，必然面l 临严重冲击。同时，“入世”对我国农副产品的 出口也将提出严峻挑战。据第2 5 届f a o w h o 农药残留法典委员会决议，已 制定出1 8 5 种化学农药在各种农副产品中3 2 2 3 个最高残留限量。然而，我国 目前仍然存在使用违禁农药问题，这对进一步扩大我国外贸出口构成潜在的隐 患。因此，发展生物农药是市场的需要，是2 1 世纪农业可持续发展的需要。 在我国，生物农药已被列入“8 6 3 ”、“十五”攻关等重点项目之中，中国2 1 世 纪议程也将我国生物农药和绿色食品的研究开发列入首批重点项目计划( 关 雄等，1 9 9 9 ) 。随着人们经济生活水平和环保意识的不断提高，生物农药必将 在未来农业发展中起到越来越重要的作用。生物农药是利用生物体本身、生物 提取物或生物代谢产物作为毒杀昆虫、抑制昆虫生长发育、控制昆虫繁殖的一 类生物或生物制品，它与传统的化学农药相比具有来源广、成本低、低毒或无 毒、选择性强、无污染和抗性发展缓慢等优点。在生物农药中，苏云金芽孢杆 菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 是目前研究最深入、应用最广泛的一种，已发展 为系列性商品。 1 1 苏云金芽孢杆菌概述 苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、杆状、能形成内生芽孢的土壤细菌， 其营养体细胞具有周生鞭毛或无鞭毛。鞭毛是细菌的一种运动器官，因此，具 有鞭毛的菌株能运动，而不具鞭毛的菌株不能运动。营养体在形成芽孢的同时， 在细胞的另一端形成不同形态、具蛋白性质的伴孢晶体，它可以是一个、两个 或多个( 喻子牛，1 9 9 0 ) 。苏云金芽孢杆菌分类上属于原核生物界，细菌纲， 芽孢杆菌科( b a c i l l a c e a e ) ，芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 的一种，在伯杰氏细菌鉴定 手册第九版中被列为第二类第十八群。1 9 0 1 年，同本细菌学家石渡从患病 的家蚕幼虫上得到了一种杆状芽孢菌，并在1 9 0 5 年发表的另一报告中称之为 “猝倒芽孢杆菌”。但直到1 9 1 1 年b e r l i n e r 从德国苏云金地区谷仓中患病的地 中海粉螟幼虫体内分离到另一株类似的细菌之后，1 9 1 5 年才正式将此昆虫病 9 福建农林大学博上学位论立 原细菌命名为苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 。1 9 3 8 年，第一个 苏云金芽孢杆菌商品制剂s p o r e i n e 在法国问世，并在地中海粉螟的防治中得到 了应用( 戴莲韵等，1 9 9 7 ) 。苏云金芽孢杆菌广泛分布于世界各地，从热带雨 林到北极冻土带，从土壤、昆虫尸体、植物体表面、贮藏物或仓库灰尘、污水 等基质上均可分离到该菌，而土壤为微生物的大本营，是其分布最为丰富的生 境( m e a d o w se ta 1 ，1 9 9 2 ；i t o u a - a p o y o l oe ta 1 ，1 9 9 6 ；b e r n h a r de ta 1 ，1 9 9 7 ； h a n s e n e t a l ，1 9 9 8 ；k a e l i n g a d a n i ，2 0 0 0 ；k a u r s i n g h ，2 0 0 0 a ，b ：o h b a e t a 1 ，2 0 0 0 ：m a d u e l le ta 1 ，2 0 0 2 ) 。据估计，目前世界上约有6 0 ，0 0 0 余个苏云 金芽孢杆菌分离物( g l a r e ，2 0 0 0 ) 。近来，人们在世界各地系统进行苏云金芽 孢杆菌资源调查的同时，也尝试从极端生态环境( 如海洋、极地等) 中分离该 菌( i r i a r t e e t a l ，1 9 9 8 ；k i m e t a l ，1 9 9 8 ；o h b a e t a l ，2 0 0 0 ；m a e d a e t a l ，2 0 0 1 ) 。 而且，人们曾在很少会有昆虫存在的地方分离出苏云金芽孢杆菌，因此推测该 菌的祖先是一种与昆虫无关的土壤习居菌，而其杀虫性可能是在进化过程中为 了摄取更丰富的营养而获得的( k n o w l e s ，1 9 9 4 ) 。 苏云金芽孢杆菌主要根据鞭毛抗原的血清型和生理生化特性的不同来进 行亚种的划分。近来，人们尝试将多种化学分类和分子生物学手段用于其菌 株间的分型，如1 6 sr d n a 序列、r a p d 、多位点酶电泳( m m e ) 、随机引 物p c r ( a p - - p c r ) 的d n a 指纹图谱、脉冲场凝胶电泳等。自1 9 6 2 年开始 用鞭毛抗原的血清学反应将苏云金芽孢杆菌划分为6 个血清型以来，目前已 增加到7 0 个血清型，8 3 个血清亚种( 表1 1 ) ，其中1 1 个血清型亚种来自中 国( l e c a d e te ta 1 ，1 9 9 9 ；g l a r e ，2 0 0 0 ；李长友，2 0 0 1 ) 。不过随着研究的不 断深入，已发现苏云金芽孢杆菌菌株的血清型与杀虫特异性( 基因型) 的关 系不相一致，不同血清型的菌株可能显示相同的特异性，而同一血清型的菌 株又可能具有不同的特异性。所以，通过血清型预测杀虫活力并不可靠，因 为它并不反映菌株所含的i c p 基因型( 黄志鹏等，1 9 9 8 ) 。 1 0 福建农林大学博士学位论文 表1 1 苏云会芽孢杆菌的血清型及其亚种 t a b l e l 1b a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss e r o t y p e sa n d s u b s p e c i e s 血清亚种血清型 血清亚种血清型 ( s e r o t y p e )( s e r o v a r ) ( s e r o t y p e )( s e r o v a r ) 2 f i n it i m u s3 0m e d e ln n 3 a 3 ca l e s t i 3 1 t o g u c h i n i 3 a 3 ds u m iv o s h i e n s i s3 2 c a m e r o u n 3 a ，3 b ，3 c k u r s t a k i 3 3 e e s i s 3 a ，3 d ，3 ef u k u o k a e n s i s 3 4k o n k u k i a n 4 a 。4 bs o t t o d e n d r o i m u s3 5 s e o u e n s i s 4 a ，4 c k e n y a e 3 6 m a l a y e n s i s b a ，5 bg a l l e r i a e3 7a 力d a o u s i e n s i s b a ，5 cc a n a d e n s i s3 8 o s w a l d o c r u z i 6 e n t o m o c i d u s s u b t o x i c u s3 9 b r a s i l i e n s i s 7 a i z a w a i p a c i f i c i u s 4 0 h u a z h o n g e n s i ， 8 a ，8 b m o r r i s o n i 41 s o o n c p d 仃 8 a - 8 c0 s t r i n i a e 6 4 2 j i n g h o n g i e n s i ， 8 b ，8 d n i g e r i e n s i s 4 3 g u i y a n i e n s i ， 9t o w o r t h i 4 4 h i g o l o a 。l o bd a r m s t a d i e n s i s4 5 r j s k i l d i e n s i s l o a ，l o cl o n d r i n a 4 6 c h a n p a i s i s l l a ，ll bt o u m a n o f f i4 7 啪t i s a v i e n s i s l l a ，l l c k y u s h u e n s i s 4 8 b a l e a ，i c a 、2 t h o m n s o n i4 9 喃j 1 3 p a k i s t a n i 5 0 n 矗v a r r e n s i s 1 4i s r a e l e n s i s 5 、x i a g u a n g i e n s i g 1 5幽膏o f a 5 2 k i m 、6i n d i a n a 5 3 a s t u r i e n s i s l7t o h o k u e n s i s 5 4 p o i o n i e n s i s 1 8 a 1 8 bk u m a m t o e n s i s5 5 p a i 融a n y 。i e n s is 1 8 a ，1 8 cy o s o o5 6 r o n g s e 。n 1 4 1 9 t o c h i g i e n s i s5 7 p i r e n a i c a 2 0 a 2 0 by u n n a n e n s i ，蕊 a r g e n t i n e n s i s 2 0 a ，2 0 c p o n d i c h e r i e