固定化细胞ppt课件.ppt

第七章 酶催化反应 酶是具有高度选择性的催化剂 而一般情况下的酶反应均是在温和条件下进行的 如常温 常压和中性溶液 酶的这些特性使酶能在食品 饮料和诊断工业中广泛应用 同样这些特性使酶能在各种化合物的合成 尤其是在药物 手性中间体 特殊的聚合物和生化物质合成中显示出了潜在的吸引力 酶作为一种特殊的催化剂正越来越受到人们的重视 对其应用研究也更趋广泛 从生物体系的酶到非生物体系的酶催化 从酶的固定化到非水相酶反应 酶的潜在能力正获得越来越多的开发和利用 7 1酶和细胞的固定化 7 1 1酶和细胞的固定化方法 固定化酶 通过物理或化学的方法将溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全或局部约束的一种不溶于水 但仍具活性的酶 它能以固相状态作用于底物进行催化反应 固定化细胞 将完整的细胞限定在一定空间内活动的一种固定化生物催化剂 注意 由于是具有催化活性的蛋白质的固定化 所以必须严格操作条件 尽可能避免酶的高级结构受到损害 7 1 1酶和细胞的固定化方法 常用方法 吸附法 包埋法 交联法 化学共价法 逆胶束包囊法等 常用载体 活性炭 多孔玻璃 纤维素 交联葡聚糖 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 海藻酸盐 明胶 合成的高分子化合物等 1 吸附法 最古老 最简便经济 特点 蛋白质与载体之间的结合力很弱 在很多情况下 酶的非特异性吸附常会引起部分或全部失活 且高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附 吸附剂的种类 1 各种矿物质和其他无机载体 高岭土 多孔玻璃 氧化铝 二氧化硅等蛋白质结合量通常很低 纤维素粉 糖苷水解酶在纤维素上有较强的吸附 离子交换剂 目前最常用 羧甲基纤维素 DEAE 纤维素 DEAE 葡聚糖以及合成的离子交换剂等作用原理 静电吸引缺点 当离子强度增加或者介质的pH 温度改变时 这种结合发生分解 如果通过化学方法增加酶蛋白上的电荷则可使这些影响得到改善 第一个用于工业生产的固定化酶 固定化氨基酰化酶 将氨基酰化酶吸附在DEAE 纤维素或DEAE 葡聚糖上制得 吸附剂的种类 2 吸附剂的种类 3 蛋白质载体 胶原蛋白是最常用的一般胶原蛋白载体预先制成膜状 胶原膜 胶原膜溶胀 然后浸入酶溶液 酶渗入膜内并被吸附 制成酶膜 生物特异性吸附剂 如 伴刀豆球蛋白A 琼脂糖 可有效地固定一些以糖蛋白为结构的酶 伴刀豆球蛋白A具有凝集红血球细胞和肿瘤细胞的作用 这种作用主要是由于伴刀豆球蛋白A能够与细胞表面上的单糖和低聚糖发生特异性结合 因此 当琼脂糖上结合有伴刀豆球蛋白A以后 它就能够与溶液中的多糖和糖蛋白发生特异性结合 2 包埋法 普适性 包埋法 将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法特点 酶分子本身不直接参加反应 条件较温和 酶活力回收较高 对底物分子和产物分子的大小有限制 当底物和产物的相对分子质量小时 扩散阻力就小 载体 1 格子型包埋法载体 常用的 海藻酸盐 K 角叉菜 琼脂 三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等 海藻酸盐 价格便宜 来源丰富 无毒性 目前应用较广特点 操作简便 条件温和 在高浓度的电介质 K Na 等 溶液中 固定化颗粒会不稳定 Ca2 等多价离子在磷酸缓冲液中会沉淀 固定化颗粒的机械强度将降低 最后重新溶解 因此用此法包埋的固定化酶或细胞不能用于磷酸缓冲溶液中 一般操作方法 先将海藻酸盐溶于水中 使其具有一定粘度 然后加入一定量的细胞菌体 并且充分搅拌 使之分散均匀 通过注射器或毛细管将此菌体悬浮液逐滴注入含有Ca2 Zn2 Al3 等多价离子的溶液中 由于离子转移的胶凝作用 海藻酸盐液滴便形成珠状的固定化细胞颗粒 待颗粒经过一定时间的硬化后洗净 即可用于催化反应 聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质的固定量较高 可达10 100mg g单体 目前常用的聚合物载体特点 聚丙烯酰胺凝胶中孔的大小分布很不均匀 因此要防止酶的漏失 调节单体和交联剂的用量可以改善聚丙烯酰胺凝胶的渗透性 操作方法 在含酶 或细胞 的水溶液中 加入一定比例的单体丙烯酰胺和交联剂N N 甲撑双丙烯酰胺 然后在催化剂 二甲氨基丙腈 和引发剂 过硫酸钾 的作用下低温 水浴 聚合 产生的聚合物凝胶便是固定化酶 可通过机械方法分散成一定大小的粒子 载体 2 微胶囊包埋材料 常用的 火棉 尼龙 聚脲等半渗透的界面聚合物膜如 将含有1 6 二氨基己烷的酶水溶液分散到与水互不相溶的含有己二酰二氯的有机溶剂中去 水相与有机相界面上的二胺和二酰氯发生聚合 形成一个包围在水相酶溶液珠滴外面的聚酰胺薄膜 即尼龙 6 6 薄膜 3 交联法 交联法 利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶发生分子间交联因而得到固定的方法 常用的试剂 戊二醛 1 6 亚己基二异氰酸酯 双重氮联苯胺和乙烯 马来酸酐共聚物等 双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用 常引起蛋白质高级结构的改变 使酶失活 常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白 避免或减少酶在交联过程中因化学修饰造成的失活 如牛血清蛋白和明胶等蛋白的加入往往能提高固定化酶的稳定性 3 交联法 4 化学共价法 共价法 使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合 主要方法 酰化反应 芳化和烷基化反应 溴化氰法 重氮化反应 硅烷基化法等特点 结合牢固 半衰期较长 活性回收较低 共价偶联反应的选择 酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性 反应条件尽可能温和 最好能在水溶液中进行反应 偶联反应对酶蛋白上某一类功能基团有很高的专一性 而对其他功能基团或水溶液几乎无副反应 7 1 2酶催化反应的应用实例 1 在工业及医药上的应用 食品工业 淀粉制糖 乳品加工 啤酒加工P238 轻工业 丝绸脱胶 原料皮的脱毛 氨酸酸 有机酸生产 酶法拆分外消旋氨基酸 合成氨基酸 合成有机酸 医药行业 蛋白酶 胶原酶 链激酶等作为药剂的应用 医疗诊断 分析 2 酶催化研究的新动态 基因工程菌产生酶的应用研究 酶固定化 修饰后参与酶催化反应的研究 在手性化合物拆分中的研究 7 2微生物转化 微生物转化 生物转化biotransformation bioconversion 微生物的生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶 作用于一些化合物的特定部位 基团 使它转变成结构相类似但具有更大经济价值的化合物的生化反应 利用的是完整细胞中的酶的活性 这些细胞可以是活的细胞 正在生长的或静态的 细胞分裂很少或根本没有 细胞 也能使用干细胞或孢子 微生物转化与化学过程相比的优点 微生物转化在温和的条件下进行 化学物质转变成要求的产品 不产生分解 而且节约能源和投资 微生物转化作用于基质分子的专一位置 产生立体专一性 光学专一性产物 不需要化学拆分 微生物转化的发展 20世纪40年代 微生物转化领域的研究蓬勃兴起 首先在甾体转化方面取得巨大成功 并建立了工业规模的甾体激素转化操作 微生物转化在其他种类生理活性化合物如生物碱 抗生素 大麻油和前列腺素合成上也得以应用 7 2 1微生物转化一般过程 1 制备培养系统 催化剂 p244 2 加入底物 3 加入效应物 抑制剂或激活剂 4 保温反应 5 监测反应过程 6 终止反应 7 产物分离 7 2 2培养系统类型 1 分批培养 培养基的准备 接种 细胞培养 底物加入 保温直至反应完成 2 连续培养 连续加入新鲜培养基和等速率移去消耗了的培养基 使细胞在相对长的周期内维持稳定状态 7 2 2培养系统类型 3 静息细胞 有生命的 不生长的细胞 保持许多酶的活性 可自由改变反应液中底物和菌体的比例 反应时间较短 转化生成物中杂质较少 因而分离提纯容易 4 干细胞 冻干或丙酮处理 用干细胞粉的方法与用新鲜静息细胞相同 但干粉保藏和运输方便 7 2 2培养系统类型 5 孢子 悬浮在培养基中的孢子能用作生物转化活性相对稳定的来源 方法类似于静息细胞的方法 6 渗透细胞 用表面活性剂或溶剂处理细胞 改变细胞渗透性 使底物和产物进出细胞更容易 如加入青霉素提高细胞渗透性 注意 可能因渗透性的改变而影响细胞的生存 7 2 2培养系统类型 7 固定化细胞 可以保持活性几个月 比静息细胞催化寿命长 而且可以建立连续转化系统 8 渗透交联固定化细胞 P245先用某些试剂 多为表面活性剂 处理细胞 提高细胞通透性 然后再进行交联固定化 保证酶活力破坏较小 又减少了传质阻力 7 2 3底物加入 水溶性底物简单 考虑的是加入的时间和量 非水溶性底物1 细小粉末 2 溶在与水互溶的有机溶剂 常用的有乙醇 丙酮 N N 二甲基甲酰胺 二甲基亚砜 中 3 用表面活性剂来分散不溶性物质 7 2 4微生物转化的类型 氧化还原氨基化乙酰化和去乙酰化脱氢形成双键腈转化成酸光学专一和立体专一性转化与拆分 7 2 5微生物转化的应用 1 甾体转化 2 内酰胺类抗生素 3 维生素 4 氨基酸 5 生物碱 6 其他药物 7 化学制品 7 3非水相酶催化 传统观点 酶只有在水相中才有活性 20世纪80年代 美国MIT的Klibanov等用脂肪酶粉或其固定化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽 手性的醇 酯和酰胺 有机相酶催化反应研究蓬勃兴起 7 3 1非水相酶催化的特性 1 增加非极性基质的溶解度 2 使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行 如肽的合成 酯的合成等 3 可减少在水相容易发生的副反应 如酸酐的水解 卤化物的水解等 4 容易分离回收 5 无微生物污染 缺点 酶的活性比水相中低 7 3 2非水相酶催化的相关问题 在完全无水的情况下 酶是无活性的 极少量的水就会激发酶的活性 但含水量低于最适水量时 酶会失去催化活性 有机溶剂可能直接与酶分子水合层中的必须水发生反应 影响酶的结构和功能 尤其是极性较强的溶剂 它可以溶解大量的水 将酶分子水合层中的必须水剥离掉 导致酶失活 相对来讲 憎水性溶剂对水的溶解能力较低 故对酶活和结构影响较小 7 3 2非水相酶催化的相关问题 有机溶剂在非水相酶催化