（农药学专业论文）毒死蜱高效降解菌的分离鉴定及其生物学特性研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 摘要 为了应用生物降解制剂来控制农田农药污染，本研究应用微生物驯化的方法，分离得到1 株对毒死蜱具有高效降解能力的菌株施氏假单胞杆菌j h y 0 1 ，并对该菌株进行了形态、 生理生化及分子鉴定，对菌株的基本生物学特性、降解谱、降解中间产物以及环境条件对菌 株降解能力的影响等方面进行了探讨研究结果如下： 1 从农药厂排污口土样中成功分离筛选到1 株对有机磷毒死蜱具有高效降解能力的菌株。 在我国山东、河北、北京等地的农药污染区进行广泛的取样，分离得到对毒死蜱具有降解能 力的菌株3 0 株。其中j y h 0 1 菌株为高效苗株，能以毒死蜱为唯一碳源生长，在无机盐培养基 中( 接种菌体终浓度为4 4 1 x 1 0 8 个m 1 ) ，对毒死蜱( 浓度1 0 0 m z l ) 7 2 小时的降解效率可达 到9 7 8 。 2 运用形态、生理生化以及分子方法对高效降解菌株j h y 0 1 进行了鉴定研究明确了 该菌株的主要生物学特性。根据j h y 0 1 菌株的形态、生理生化特性以及1 6 5r d n a 的序列比 对结果，确定菌株j h y 0 1 为施氏假单胞杆菌p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 。其主要特性为：革兰氏阴 性，无芽孢，菌体细胞长杆状，单根鞭毛极生；严格好氧，非发酵型不能在6 0 生长， 能利用乙醇和甘油，不能利用甲醇，丙酮和d l 乳酸；氧化酶阳性，接触酶阳性，d n a 酶阳 性。j h y 0 1 菌株在牛肉蛋白胨培养基中生长迅速。p h 范围在6 - 9 的条件下，8 小时即达到稳 定期( 3 0 c ，1 8 0 r p m ) ，最适生长的p h 为7 。在2 3 - 3 8 * ( 2 条件下，生长良好，晟适生长温度为 3 86 c ，较适宜的摇瓶装液比为1 ：1 0 ( 2 5 0 m i 三角瓶装2 5 m l 培养基) 。菌株摇瓶培养适宜的碳源 为麦芽糖浓度为1 0 适宜的氮源为牛肉蛋白胨，浓度为1 o ：碳氮源原料比1 ：1 。 3 通过研究，明确了菌株的基本降解谱及降解的中间产物。气相色谱测定结果表明，菌 株j h y 0 1 对甲基对硫磷、三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯以及溴氰菊酯具有不同的降解能力当培 养基中接种苗体终浓度为9 1 0 x 1 0 8 个，“时，菌株对甲基对硫磷的降解率为1 0 0 ，对三氟氯 氰菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率分别为5 4 6 4 、5 2 2 6 和1 6 3 3 。菌株j h y 0 1 降解 毒死蜱的中间产物经液相色谱检测，确定为三氯吡啶醇：对甲基对硫磷的降解产物，经气相 色谱一质谱联用鉴定为对硝基苯酚。 4 明确了环境温度、p h 值、毒死蜱浓度、接菌量以及菌株复壮条件对菌株降解能力的 影响。结果表明，环境温度对菌株的降解效力有显著的影响，在无机盐培养体系中( 接种菌 体终浓度为7 5 6 5 x 1 0 8 个m l ，毒死蜱浓度1 5 0 m g l ) ，1 8 c 时毒死蜱的降解率为3 5 1 ，当温 度提高到4 3 c 时降解率可高达9 5 1 ，未接菌对照的降解率均在2 1 o 以下。环境p h 值对 菌株降解效力有显著的影响，在无机盐培养基体系中( 接种菌体终浓度为5 9 1 x 1 0 8 个m l ， 西南大学硕士学位论文摘要 毒死蜱浓度为1 5 0 m g l ) ，p h 值由7 提高到1 1 ，降解率可从7 4 5 提高到9 7 0 ：p h 值由4 提高到7 ，降解率由8 6 0 降低到5 1 9 ，说明偏酸和偏碱环境对降解过程有利。菌株对毒死 蜱的降解率随毒死蜱浓度的增加而逐渐降低，在无机盐培养基中( 接种苗体终浓度为4 4 1 x 1 0 8 个m 1 ) ，毒死蜱浓度由2 0 0 m g l 提高到5 0 0 m g l 时，菌株对毒死蜱的降解率由6 9 1 下降到 4 2 6 ( 培养5 天) 。接种量对毒死蜱的降解率有显著影响，体系中毒死蜱浓度为1 5 0 m n l 时， 接种菌体终浓度从1 9 1 x 1 0 6 个n i l 增加到7 6 3 x 1 0 8 个，r i l l ，毒死蜱降解率从2 2 5 提高到7 5 9 ；体系中毒死蜱的浓度为3 0 0 m g l 时，接种菌体终浓度从5 1 0 x 1 0 7 个t m 增加到1 0 2 x 1 0 9 个n i l ，毒死蜱降解率从1 1 0 提高到6 3 3 。复壮培养基对降解力没有显著影响，无论采用 无机盐培养基( 以毒死蜱为唯一碳源) 还是牛肉蛋白胨培养基复壮培养菌株，其对毒死蜱的 降解效率未见显著差异，说明该菌株中的降解酶为组成型表达酶。 关键词：生物降解，施氏假单胞杆菌，毒死蜱，生物学特性 西南大学硕士学位论文 a b s l r a c t a b s t r a c t m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fo i g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e si so fp a r t i c u l a ri n t e r e s tb e c a u s eo f t h e h i g hm a m m a l i a nt o x i c i t yo fs u c hc o m p o u n d sa n dt h e i rw i d e s p r e a da n de x t e n s i v eu s e i th a sb e e n r e l a t i v e l ye a s yf o rs o m eo r g a n o p h o s p h a t e ss u c ha sp a r a t h i o nt oi s o l a t ed e g r a d i n gb a c t e r i a h o w e v e r ， i th a sb e e np r o b l e m a t i ci s o l a t i n gad e g r a d i n gs t r a i nf o rc h l o r p y r i f o s ，w h i c hh a sb e e nw i d e l yu s e df o r a g r i c u l t u r a la n dh o u s e h o l dp e s tc o n t r o ls i n c e1 9 6 5 t h eo b j e c t i v e so ft h ee x p e r i m e n t sw e r et oi s o l a t e d e g r a d i n g s t r a i n sf r o mt h e p o l l u t e ds o i l s ，c h a r a c t e r i z ec h l o r p y r i f o s - d e g r a d i n gi s o l a t e s ，a n d i n v e s t i g a t et h ep a t h w a yo fd e g r a d a t i o n t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h i r t yi s o l a t e so fc h l o p y r i f o s - d e g r a d i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mt h es o i l sa r o u n dt h e w a s t e w a t e ro u t l e t so fc h l o r p y r i l o s p r o d u c e df a c t o r i e si ns h a n d o n ga n dh e i b e ip r o v i n c e so rs o i l s e x p o s e d t o o ! g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s i nt h e f i e l d so fs e i j i n g a l lo ft h ei s o l a t e su t i l i z e d c h l o r p y r i f o sa st h es o l es o u r c eo fc a r b o no rn i t r o g e n ，b u tv a r i e di nt h ea b i l i t i e st od e g r a d i n gt h i s p e s t i c i d e a n da m o n gt h e m ，o n ei s o l a t en a m e dj h y 0 1w a gs e l e c t e df o rf u r t h e ra n a l y s i sf o ri t sh i g h d e g r a d i n ge f f i c i e n c y t h i si s o l a t ew a si d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a ss t u t z e r ib y1 6 sr d n as e q u e n c e a n a l y s i sa n dm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s t h ei s o l a t eg r o w sw e l li nm u c hw i d e rt e m p e r a t u r ea n dp hr a n g e s ，w i t h3 8 ca n d7a st h e o p t i m u m t h eo p t i m a lr a t i oi nl i q u i df e r m e n t a t i o ni s i ：1w i t h1 m a l t o s ea sc a r b o ns o u r c ea n d1 b e e fp e p t o n ea sn i t r o g e ns o u r c e t h i ss t r a i nh y d r o l y z e dc h l o r p y r i f o st ot c pa n dd i e h y l i h i o p h o p h a t e ( d e t p ) ，f o rt c pw a s d e t e c t e di nt h el i q u i dc u l t u r em e d i u mb yh p l c t h ei s o l a t ea l s od e g r a d e dm e t h y lp a r a t h i o n ， c y p e r m e t h r i na n dc y h a l o t h r i n ，b u tn o td e l t a m e t h r i n a n dt h es t r a i nd e g r a d e dm e t h y l - p a r a t h i o nt o p n i t r o p h e n o lw h i c hw a si d e n t i f i e db yg c - m s t h ea b i l i t yo ft h ei s o l a t et om i n e r a l i z ec l t l o r p y r i f o sw a si n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tc u l t u r e c o n d i t i o n t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tc h l o r p y r i f o sc o n c e n t r a t i o n ，i n o c u l a t i n gq u a n t i t y , c u l t u r e t e m p e r a t u r e ，p ha n dc u l t u r ep e r i o dh a dg r e a te f f e c t so nt h ed e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o s t h er a t eo f d e g r a d a t i o nv a r i e db e t w e e n1 0 9 4 a n d1 0 0 a c c o r d i n gt od i f f e r e n ti n f l u e n c i n gf a c t o r s t h es t r a i n r e m o v e d9 7 8 o ft h e1 0 0 m g lc h l o r p y r i f o si nt h em i n e r a ll i q u i dm e d i u mw i t h i n3 d a y sw h e nt h e i n o c u l a t i n gc o n c e n t r a t i o nr e a c h e d4 4 1 x 1 0 8c f u m 1 t h e s er e s u l t sh i g h l i g h tt h ei s o l a t eo ft h i sb a c t e r i u mt ob eu s e di nt h ec o n t a m i n a t i o nc o n t r o lo f p e s t i c i d ep o l l u t i o ni na g r i c u l t u r a le n v i r o n m e n t k e yw o r d s ：b i o d e g r a d a t i o n , p s e u d o m o n a ss t u t z e r i c h o l o p y r i f o s b i o l o g i c a lc h a r a c i e 硌 独创性声明 学位论文题目；盎五竖商夔隆篚萱煎佥直鉴皇丞甚生堑堂挂性珏窒 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：到泌：文- 2 、签字日期：山 ：取2 0 夸器孛豹踣葬豹按照革兰菱染色法浚冀焉，蔫稳鞫豹魏 雀绿水溶液( 约为7 6 ) 搬1 0 分钟。用自来水冲洗，用o ，5 番红染液复染3 0 秒，永洗，吸 干，镜检：磐孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 1 2 - 2 扫接魄镶甏察 取以牛肉膏蛋白胨液体培养基培养2 0 小时的培养物1 5 m l ，5 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上 清用0 1 m o p l n a 2 1 i p 0 4 - n a h 2 p 0 4 ( p h 7 。2 ) 缓冲液重悬菌体，5 0 0 0 r p m 离心5 分钟。彝上清， 反复3 次，黻洗去蓥傣缎稳袭垂辩着静臻器蓥。臻害2 5 戎二醛熬p h 7 2o i m o l ln a 2 h p 0 4 - n a h z p 0 4 缓冲液重悬菌体，体积比约为2 0 ：1 ，用剪去尖凝的枪头反复吸打菌液，以使菌体散 开，加入饿酸固定2 小时，分别加3 0 、5 0 、7 0 、9 0 、1 0 0 乙醇各脱水1 5 分钟，临界 点干燥l 小髓，取出粘予一强形铜台上，翔金溅射喷镶，器泡子显徽镶下蕊察荠拍照。 1 2 3 透射魄镜观察 西南大学弼i 士学位论文 第三章毒瑶蜱高效降解菌株的形态及生理生化龆定 i i i i i i i i i i i i i i 载群璇魏裁蚕：先擞锾弼蔟两浓虢黢浸泡2 势锋，焉强本洗数次，最居蒋洗洚豹锅瓣膜 铺在有滤纸的培养皿中。轻轻注入无菌水，取配好的火棉胶液( 2 9 火棉胶溶于1 0 0 m l 醋酸异 戊酯中) 漪一滴在水面上，由于火棉胶在水面上的表蕊张力形成一薄膜，将第一、= 次的膜 除去，薄膜形成基迅速耀吸管在培莠撼豹透缘楚吸去窳分，壹至吸予，健貘紧紧魅蹙铜睡上 为止，室濑干燥备用。 用生长丰茂的菌株( 1 8 小时培养物) 伟9 成苗悬液，用洁净的毛细管吸取菌液并滴猩铜网上 形成- d , 液珠，静置2 - 3 分钟。使样品吸附在膜上，服滤纸条从液滴边缘吸去部分慧波。然后 霉嗣洁洚的毛鲴营暖取蒸馏承菠在镝弼液压，臻滤纸条瓤滚滚透缘教去蒸馏瘩，重餐2 - 3 次， 当铜网上样品近干燥时，将1 醋酸铀溶液滴加在样品上进行染色1 - 2 分钟，再用滤纸条从边 缘吸去染液。重复3 次，特其自然干燥厩，置于电镜下观察并拍照。 1 3 培葬鼍黧理生纯篷跫 1 3 1 菌落形态 将j h y 0 1 分别划线予牛肉蛋白胨和无枫盐固体培养基上，3 0 c 憔漩培养，观察魏落形态。 1 3 2 磺漾零l 鼹 基础培养基：( n h 4 ) 2 s 0 42 o g ，m g s o a 。7 h 2 0o ，n a h 2 p 0 4 h 2 0o 5 9 c a c i z 2 h 2 00 1 9 ， k 2 h p 0 40 ，5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 本试验赢勃为d l 霉羧、甘油、甲懿、z 。醇、嚣戮，底锈过滤炎蘸，终浓度豫弊旋l 琵芝 矫，其德麓物浓度为o 赫，玖蘸悬液接种，连续3 代移种，生长者为辩牲。 1 3 3 氧尊口二氧化碳的需骤 取3 0 9 硫乙醇酸盐培莽基( 厂家；_ e 京奥博星生物技术责任有限公司) 加入到l o o m l 蒸 馏承孛，鸯龚热煮沸，镬乏宠垒溶鼹，摇匀，势装试管，1 1 5 高压灭蘩分铸，探存嚣用。放 置过久，擞色层超过1 ，3 时可加热，趋毓一次再用。 以1 8 - 2 4 小时幼龄菌种做种子，穿剿按种，每株6 变，其中3 支用灭菌的凡士林霸蜡油( 熔 纯的2 3 茂士辣孛热入1 3 液体嚣蜡，越瀑灭莛澎差，缝0 5 i c m 蓐，爨疆绝空气。菇3 支不 封油为开臀，同时设不接种的闭管和开铐做为对照。进温培养1 、2 、3 、7 天观察结果。 1 3 4 葡萄糖氧化发酵 媾德鞠霍尔二氏培葵蒸n l 车 岛p 瓴0 5 9 ，k z h p o j , 0 5 9 ，酵母黉o 5g ，葡莓耱1 0 9 。璩 戆s g ，浚百里酚蓝l 强承溶滚3 m l ，蒸镶承1 0 0 0 m l ，p h7 0 - 7 2 。箍棼基配好岳，分装试管， 培养基高殿约4 5 c m ，1 1 5 蒸汽灭菌2 0 分钟。 以1 8 2 4 小时幼龄菌种做种子，穿刺接种。每株四支。其中2 支用灭菌的凡士林石蜡油封 藏，终0 。5 * l e m 蓐，鞋鞴缝空气。另2 支苓封涵舞舞警。弱鞋设不搂耱豹翅营窥舜管皴j c 重爨。 适温培养，1 、2 、3 、7 、1 4 天观察结粜。只有开管产酸变黄者为氧化溅；开管和闭瞥均产酸 变黄者为发酵型。 2 7 西南大学硕：扛学位论文第三章毒死蜱高效降解菌株的形态及生理生化鉴定 1 3 5 乙醇氧化 在葡萄糖氧化发酵培养基中以醇代糖使乙醇终浓度为1 。适温培养1 、3 、7 、1 4 天观 察结果。产酸变黄者为阳性；不变黄者为阴性。 1 3 6 氧化酶 在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的l 水溶液，仅使滤纸湿润即可。 不可过湿。用白金接种环( 不可用镍铬丝) 取1 8 - 2 4 小时的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在1 0 秒内涂抹的菌苔现红者为阳性，( 四甲基对苯撑二胺呈蓝色) ，1 0 6 0 秒现红者为延迟反应，6 0 秒以上现红色者不计，按阴性处理。 1 3 7 接触酶 将2 4 小时培养的菌种以铂丝接种环取一小环涂抹于己滴有3 过氧化氢的玻片上如 有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。 1 3 8d n a 酶 准备d n a 酶试剂盒。以1 8 ：2 4 小时幼龄菌种做种子。穿刺接种，每株3 支，另外取3 支 不接菌作为对照。适温培养1 、2 、3 、7 天观察结果。 1 3 9 高温培养( 6 0 x 2 ) 以2 4 小时的牛肉蛋白胨液体培养物- - d , 环接种牛肉蛋白胨液体培养基，置6 0 水浴培养， 三次移种( 每2 4 小时转接一次) ，观察是否正常生长。 2 结果与分析 2 1 形态特征 实验结果显示，供试菌株为革兰氏阴性，无芽孢。扫描电镜下( 如图3 - 1 ) 观察到，供试 菌株菌体细胞长杆状。透射电镜下( 如图3 2 ) 观察到供试菌体有一根鞭毛，极生。 2 2 培养与生理生化特性 2 ：2 1 菌落形态 实验结果显示，在牛肉蛋白胨固体培养基上，菌落圆形边缘整齐，表面隆起。乳白色， 不透明，生长后期菌落表面出现稽皱，菌落黄色，见图3 3 。在以毒死蜱为碳源的固体培养基 上，菌落圆形，边缘整齐，表面隆起。土黄色不透明，菌落中心凹陷，约5 天菌落周围形 成明显的透明圈，见图3 - 4 。 2 2 2 生理生化特性 碳源利用j h y 0 1 菌株能利用乙醇和甘油，不能利用甲醇，丙酮和d l 乳酸。 西簿夫学硕士学位论文第三章毒拜蜱赫教降解菌株的形态殿生理生化罄定 圉3 - 1j h y 0 1 翱描电镜翻 嗣3 - 2j h y 0 1 迸射电镜闰 f i g 3 l i s o l a t ej h y 0 1u n d e r e l e c t r o ns c a n m n g m i c r o s c o p e f i g 3 - 2 i s o l a t e j h y o iu n d e r e l e c t r o n 匿3 - 3j h y 0 1 在牛雨蛋白拣培养基上的形态 f i g 3 3 i h y 0 1c o l o n yo f fn u t r i e n tm e d i u m 翻3 qj h y 0 1 在以毒琵蜱为唯一碳源的无机靛培养基上的彩态 f i g 3 - 4 - j h y 0 1c o l o n i e so i lm i n e r a lm e d i u ma m e n d e dc h l o r p y 6 o sa s t h es o l e c a r b o ns m 畿拳l 二氧纯碳翦键娶：实骏缝鬃显黎，开譬疑理，渡瓣处先交混洼，鬟红色，然震簸上 西南大学硕士学位论文 第三章毒矩蟑高效降解蕴撩的形淼藏生理生纯鉴定 至下逐渐恩红色，逐渐变混浊，说明菌体先在液面嫩长，随着氧气逐渐向下渗透，菌体逐渐 生长；闭瞥处理，与对照相比，培养基没有显色，麟体完全没有生长；溅明此菌株为严格好 氧。 葡臻耱氧诧发酵：受曹鼯管缝理培养基产酸燮黄，说明毙菌株为载张黧。 乙醇氧化：发酵培养基变赞，说明此菌株能够氯化乙醇。 氧化酶；阳性。 接触酶：阳性。 d n a 酶：试管墙莠基由蘸惫变为黄色，谎甥d n a 酶雕馒。 嵩滋6 。：不韪生长。 3 结论与讨论 综上鳙果，菌株j h y 0 1 菌体细胞长杆状革兰氏阴性，无芽孢，单檄鞭毛。极生；严格 好氧，非发酵型，不自g 在6 0 耋e 长，能利用乙酵和嚣油，不能剥用甲酵，掰酮和d l 乳酸； 氧健酶麓瞧，接魅酶疆瞧，d n a 酶疆毪。 现代生物技术豹发展靼不断完善，细菌种类的攘定需要用分子鉴定来最后确定种类，所 以奉章的生理生化鉴定方面只选择了一些主要的指标进行实验和比较，而没有进行更多指标 的测试。 西南大学硕士学位论文 篱四章毒死蜱高效降解菌株的分子鉴定 第四章毒死蜱高效降解菌株的分子鉴定 1 6 sr d n a 是编码原核生物核糖体小亚基r r n a ( 1 6 8 r r n a ) 的基因，长度约为1 5 0 0 b p ， 具有分子大小适中，突变率小等优点，索有“细菌化石”之称，是细菌分类学研究中晟常用、最 有用的“分子钟”。本章对j h y 0 1 菌株进行1 6 sr d n a 序列分析，以期确定该菌株的分类地位。 1 材料与方法 1 1 菌株和质粒 供试菌株：j h y 0 1 ，能够在含5 0 0 m g l 毒死蜱的无机盐培养基上生长。 质粒：p m d l 8 - tv e c t o r ，a m p + ，生产厂家为t a k a r a 。 受体菌：e c o l id h5 a ，生产厂家为天为时代。 1 2 培养基 l b 培养基：蛋白胨l o g ，酵母粉5 9 ， n a c l5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 r a l ，调p h7 0 ，1 2 1 c ，灭 菌3 0 分钟各用。 以毒死蜱为唯一碳源的无机盐培养基( s t a n l a k eg j e ta 1 ，1 9 8 2 ) ：m g s 0 4 7 1 1 2 00 1 9 ， c a c l 2 。h 2 0o 0 2 9 k i - 1 2 p 0 40 6 8 9 ，k 2 h p 0 41 7 3 9 ，m n s 0 4 + h 2 00 0 3 ，n h 州0 31 o g ，f e s o , 7 1 - 1 2 0 0 0 3 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，调p h 值为7 0 ，灭菌3 0 分钟备用。 牛肉蛋白胨液体培养基：蛋白胨1 0 9 ，牛肉膏5 9 ，n a c l 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，调p h 7 2 ， 1 2 1 。灭菌3 0 分钟备用。 1 3 实验仪器 p c r 仪p t c - 2 0 0 ( m jr e s e a r c h ) ，电泳仪p a c 一1 0 0 0 ( b i o r a d ) ，凝胶成像系统( b i o r a d ) ， 超低温冰箱u 5 8 1 ( 三洋) ，恒温摇床d h 耳d a ( 江苏太仓) ，恒温培养箱s g s p - 0 2 ( 湖北黄石) ， 高压蒸汽灭菌锅( - - 洋) ，超净工作台v d - 1 3 2 0 ( 哈东联) ，烘箱v c n t i c e l l ( 3 m ) 冰箱m p r - 4 1 1 f ( 三洋) ，电子天平b p 2 1 1 d ( s a r t o r i u s ) ，移液器( e p p e n d o r f ) 等。 1 4 试剂 细胞裂解液( 1 0 0 r n mt f i s h c i - 5 r a me d t a ，5 0 0 m mn a c i ，l s d sp h 7 5 ) ：3 m n a a c ( p h 5 2 、。 s o l u t i o ni ：葡萄糖5 0m m ，t r i s - h c l2 5 m m ( p h 8 o ) ，e d t al o m m ( p h 8 o ) 。 s o l u t i o ni i ：n a o h0 2m ，s d s1 现用现配。 s o l u t i o nh i ：k a c5 m ，冰乙酸1 1 5 m l ，水2 8 5 m l 。 3 1 西南大学硕士学位论文第四章毒死蜱高效降解菌株的分子鉴定 r n a 酶( s i g m a ) ，h i n d u ( n e w e n g l a n d b i o l a b s ) ，t a e 缓冲液，氨苄青霉索5 0 m g m 1 t r i s 饱和酚，氯仿，异戊醇7 0 及无水乙醇，t a q 酶，载样缓冲液。 1 5 方法与步骤 1 5 1 总d n a 的提取 取培养过夜的菌液1 5 m l ，离心5 0 0 0 r p m ，2 m i n ，收集沉淀；加入0 0 0 9 l6 5 预热的细胞 裂解液充分混匀，加入1 1 0 体积的t r i s 饱和酚，6 5 保温半小时，并不时轻柔振荡：加入 等体积酚氯仿，异戊醇，充分混匀，离心1 3 0 0 0 l p m ，1 0 m l n ；取上清，加入等体积氯仿异戊醇 再抽提一次，离心，1 3 0 0 0 r p m 1 0 m i n ：取上清，加入1 1 0 体积3 m 醋酸钠，加0 6 体积预冷 异丙醇- 7 0 c 放置1 0 分钟；离心1 0 0 0 0r p m 1 0 分钟，弃上清液，7 0 z , 醇洗涤沉淀，真空 干燥；加2 0 蛳l 去离子水复溶，加入l m g ( 1r n a s e2 0 # l ，6 5 ，保温3 0 m i n ；补水至5 0 0 ( 1 ， 加入等体积酚，氯仿，异戊醇，充分混匀，离心，1 3 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ：取上清，加入等体积氯仿， 异戊醇再抽提一次，离心，1 3 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ：取上清，加入1 1 0 体积3 m 醋酸钠，加0 6 体 积预冷异丙醇，7 0 。c 放置1 0 分钟；离心1 0 0 0 0r p m ，加分钟，上清液弃去，7 0 7 , 醇洗涤沉 淀，真空干燥，复溶于2 0 9 l 超纯水，取红l 经0 8 琼腊糖凝胶电泳检测，其余2 0 保存。 1 5 21 6 sr d n a 的p c r 扩增 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，引物序列如表4 1 所示，1 6 sr r n a 序列分析 的步骤参考东秀珠等主编的常见细菌系统鉴定手册。 表4 - 1 引物序列及其在犬肠杆菌1 6 s r d n a 上的相应位点 t a b l e4 - 1 p t i i n c rs e q u e n c ea 耐t h e i rt a r g e ts i t e si e c o l i1 6 s r d n a 以提取的j h y 0 1 菌株的d n a 为模板， p c r 反应体系 d n a 模板 上游引物( 5 p m o u u 0 下游引物( 5 p m o lm 1 ) 1 0 x t a q 缓冲液 按照如下p c r 体系进行扩增。 1 儿l ( g i1 6 6 7 7 5 5 2 61 9 b ! d q 0 5 9 5 4 6 1 1 p 矗e u d o m o n a ss t u t z e r ii s o l a t e s a l1 6 sr i b o s o m a lr n a g e n e ， p a r t i a ls e q u e n c e l e n g t h = 1 5 0 t s c o r e = 2 9 2 4b i t s ( 1 4 7 5 ) ，e x p e c t = 0 0 i d e n t i t i e s = 1 4 9 1 1 4 9 5 ( 9 9 ) ，g a p s = 1 1 4 9 5 ( 0 ) s t r a n d = p l u s m i n u s q u e r y 3 7a g g t t t g a t c c t g g t c a g 从c g 从c g c t g g c g g c a g g c c t a a c a c a t g c 从g t c g a g c9 5 s b j c t 1 4 9 8a g a g t t t g a t c c t g g c t c a c a t t c a a c g c t g g c g g c a g g c c t a a c a c a t g c a a g t c g a g c1 4 3 9 q u e r y 9 6 g g a t g a g t g g a g c t t g c t c c a t g a t t c a g c g g c g g a c g g g t g a c t 从t g c c t a g g 从t c t1 5 5 s b j c t 1 4 3 8g g a t g a g t g g a g c t t g c t c c a t g a t t c a g c g g c g g a c g g g t g a g t a a t g c c t a g g a a t c t1 3 7 9 q u e r y 1 5 6 g c c t g g t a g t g g g g g a c a a c g t t t c g a 从g g a a c g c t a a t a c c g c a t a c g t c c t a c g g g a2 1 5 s b j c t i3 7 8 g c c t g g t a g t g g g g g a c a a c g t t t c g a a a g g a a c g c t a a t a c c g c a t a c g t c c t a c g g g a1 3 1 9 q u e r y 2 1 6 g a a a g t g g g g g a t c t t c g g a c c t c a c g c t a t c a g a t g a g c c t a g g t c g g a t t a g c t a g t t2 7 5 s b j c t i3 1 8g a a a g t g g g g g a t c t t c g g a c c t c a c g c t a t c g a t g a g c c t a g g t c g g a t t a g c t a g t t 12 5 9 q u e r y 2 7 6 g g c g a g g t a a a g g c t c a c c a a g g c g a c g a t c c g t a a c t g g t c t g a g a g g a t g a t c a g t c a3 3 5 s b j c t 1 2 5 8 g g c g a g g t a a a g g c t c a c c a a g g c g a c g a t c c g t a a c t g g t c t g a g a g g a t g a t c a g t c a1 1 9 9 q u e r y 3 3 6 c a c t g g 从c t g a g a c a c g g t c c a g a c t c c t a c g g g a g g c a g c a g t g g g g a a t a t t g g a c a3 9 5 西南大学硕士学位论文第四章毒死蜱高效降解菌株的分子鉴定 s b j c t 1 1 9 8c a c t g g a a c t e a g a c a c g g t e c a g a c t c c t c g g g a g g c a g c g t g g g g a t t t g g a c 1 1 3 9 q u e r y3 9 6 a t g g g c g a a a g c c t g a t c c a g c c a t o c c g c g t g t g t g a a g a a g g t c t t c g g a t t o t a a a g4 5 5 s b j c t1 1 3 8 t g g g c g 从a g c c t g t c c a g c c a t g c c c c g t o t g t o a a g a a g g t c t t c g g a t t o t a a a g1 0 7 9 q u e r y4 5 6 c a c t t t a a g t t g g g a g g a a g g g c a g t a a g t t a a t a c c t t g c t g t t t t g a c c t t a c c g a c a5 15 s b j c t 1 0 7 8c a c t t t a a g t t g g g a g g a a g g g c a g t a a g t t a a t a c c t t g c t o t t t t o a c g t t a c c g a c a 1 0 1 9 q u e r y 5 1 6g a a t a a g c a c c g g c t a a c t t c g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c g a a g g g t o c a a g c g t t a5 7 5 s b j c t 1 0 1 8g a a t a a g c a c c g g c t a a c t t c g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c g a a g g g t o c a a g c g t t a9 5 9 q u e r y5 7 6 a t e g g a a t t a c t g g g c g t a a a g c g c g c g t a g g t o g t t c g t t a a g t t g g a t o t o a a a g c c c 6 3 5 s b j c t 9 5 8 a t c g g a a t t a c t g g g c g t a 从c c g c g c c t a g g t g g t t c g t t a a c t t g g a t g t g a a a g c c c8 9 9 q u e r y6 3 6c g g g c t c a a c c t o g g a a c t o c a t e c a a a a c t g g c g a g c t a g a g t a t g g c a g a g g g t g g t o6 9 5 s b j e t 8 9 8c g g g c t c a a c c t g g g a a c t o c a t c c a a a a c t g g c g a g c t a g a g t a t g g c a g a g g g t g g t o83 9 q u e r y6 9 6g a a t t t e c t g t g t a g c g g t g a a a t o c g t a g a t a t a g g g a g g a a c a c c a g t o g c g a a g g c g7 5 5 s b j c t 8 3 8 g a a t t t c c t o t g t a g c g g t o a a a t g c g t a g a t a t a g g a a g g a a c a c c a g t g g c g a a g g c g7 7 9 q u e r y 7 5 6 a c c c c t g g g c t a t c t g a c a c t g a g g t o c g a a a g c g t o g g g a g c a a a c a g g a t t a g a t8 1 5 西南大学硕士学位论文 第四章毒死蜱高效降解菌株的分子鉴定 s b j c t 77 8 a c c a c c t g g g c t a a t a c t g a c a c t g a g g t g c g a a a g c g t g g g g a g c a a a c a g g a t t a g a t 7 1 9 q u e r y8 16a c c c t g g t a g t c c a c g c c g t a a a c g a t g t c g a c t a g c c g t t g g g a t c c t t g a g a t c t t a g8 7 5 s b j c t 7 1 8 a c c c t g g t a g t c c a c g c c g t a a a c g a t g t c g a c t a g c c g t t g g g a t c c t t g a g a t c t t a g6 5 9 q u e r y8 7 6 t g g c g c a g c t a a c g c a t t a a g t c g a c c g c c t g g g g a g t a c g g c c g c a a g g t t a a a a c t c a9 3 5 s b j c t 6 5 8 t g g c g c a g c t a a c g c a t t a a g t c g a c c g c c t g g g g a g t a c g g c c g c a a g g t t a a a a c t c a5 9 9 q u e r y 9 3 6 a a t c a t t g a c g g g c g c c c g c a c a a g c g g t g g a c c t g t g g t t t a a t t c g a a g c a a c g c g9 9 5 s b j c t 5 9 8 a a t g a a t t g a c g g g g g c c c g c a c a a g c g g t g g a