生物技术药物学复习.doc

第一部分1、药物（medicine，remedy）是指用于预防、治疗和诊断或用以调节机体生理功能促进机体康复、保健的物质。药物一般可分为预防药，治疗药，诊断药和保健药，有些药物同时具有预防、治疗或保健康复作用。常见的药物有三大类：化学药物，生物药物和中草药。化学药物可分为无机药物、合成药物和天然药物。广义的生物药物包括生化药物、微生物药物、生物制品和生物技术药物。药品（drug），按中华人民共和国药品管理法的法定含义是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应证、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药物、化学原料药及其制剂、抗生素、生物制品、放射性药品、血清疫苗、血液制品和诊断药品等。药物的内涵比药品更广泛一些，药品专指在临床上直接应用的产品。2、特异性药物作用机制大多数药物的作用机制属于特异性作用机制。它的生物活性与其化学结构的特异性密切相关。通过其化学结构与机体生物大分子的特定活性部位结合，产生一系列生理生化效应。这些药物大部分通过作用于受体分子或通道蛋白影响递质与激素的释放和分泌而起作用。药物受体存在于细胞膜，细胞浆和细胞核内。是一些能与生物活性分子如神经递质、激素、药物等相互作用的分子。蛋白质是最重要的一类药物受体。还包括细胞的其他成分，如核酸（肿瘤化疗药物的受体）。竞争性与非竞争性拮抗剂受体拮抗剂是一类能与受体结合,但不能使受体激活的药物,它通过阻止激动剂与受体结合或阻止激活受体起作用.竞争性拮抗剂，内在活性为0，与受体结合后本身不产生生物效应，但与激动剂竞争相同受体，拮抗作用是可逆的，使用足够浓度的激动剂仍可达到最大效应，即拮抗作用可以随着激动剂浓度的增加而解除。非竞争性拮抗剂，在任何浓度下都可阻止激动剂在特定受体产生最大效应，使激动剂的量-效曲线向右移，但斜率及最大效应均降低，它与受体结合后，可以妨碍激动剂与受体的结合，或使激动剂与受体结合后不产生生物效应。因此增加激动剂浓度不能解除非竞争性拮抗剂的拮抗作用。药物的跨膜信号转导有四种机制：A脂溶性药物可以通过细胞膜，作用于胞内受体。 B配体与跨膜受体结合，使胞内酶产生变构活性调节。 C通过配体-门控跨膜离子通道进行信号转导。 D通过G-蛋白偶联的受体进行信号转导：G-蛋白可视为转换器，受体激活时G-蛋白开启，信号传递终止时，G-蛋白关闭活性，从而产生放大的信号传递。3、极量：药物出现最大疗效，而不出现中毒的剂量。4、效应强度（Potenc）：指药物产生一定强度的效应时所需的剂量，一般以药物产生最大效应的50%时所需的剂量（ED50）或浓度（EC50）表示。5、安全指数：评价药物的安全性治疗指数（therapeutic indexTI）：是衡量药物安全性大小的指标，治疗指数=半数致死量/半数有效量.治疗指数表示半数致死量与半数有效量之间的剂量距离，TI值越大表示药物的安全性越大。6、影响药物作用药物方面的因素药物的剂型、剂量、给药途径、给药次数、时间、合并用药的相互作用等因素都会影响药物作用的效应。连续给药易产生耐受性：连续用药后机体对药物的反应性降低，化学结构类似或作用性质类似的药物还会产生交叉耐受性病原微生物对抗微生物药物产生的耐受性称抗药性（resistance）麻醉药品或精神药品连续使用时还可产生药物依赖性（drug dependence） 7、生物药物(Biopharmaceutics)：是利用生物体生物组织及其成分综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和现代药学的原理与方法进行加工，制造而成的一大类预防、诊断、治疗制品。广义的生物药物包括从动物、植物、微生物、海洋生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。生物药物进一步分成4大类，即：（1）基因工程药物（2）基因药物 （3）天然生化药物（4）合成或半合成的生物药物生物技术药物：又称基因工程药物,则属于上述的（1）和（2）两类生物药物,国家药品监督管理局将其列入新生物制品药物(以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞因子类药物，及用蛋白质工程技术制造的上述产品及其修饰物)。反义药物、基因药物和核酶也属于生物技术药物的发展领域。生物技术药物学：是近代药物学的一个重要分枝，是研究生物技术药物，尤其是基因工程药物和基因药物的一门新型综合学科。内容包括各类生物技术药物的来源、结构、性状、作用、用途和用法等各方面的知识，比较系统地介绍生物技术药物在疾病防治、诊断有关的基础理论及其临床应用知识。根据生物技术药物的特点、重点，主要讨论：生物技术药物的临床前研究与临床评价、生物技术药物的生产工艺与生产管理、生物技术药物的质量控制与安全性评价、各类生物技术药物的来源，结构、性质、作用与用途。8、生物技术药物的主要品种类型：（1）细胞因子干扰素类（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子（3）造血系统生长因子类（4）生长因子类（5）重组蛋白质与多肽类激素（6）心血管病治疗剂与酶制剂（7）重组疫苗与单抗制品（8）基因药物9、生物技术药物表达系统：（1）大肠杆菌表达系统（2）昆虫细胞表达系统(3)酵母表达系统 (4)植物表达系统(5)哺乳类细胞表达系统(6)转基因动物与动物克隆技术10、三股螺旋DNA技术：脱氧寡核苷酸能与双股螺旋双链DNA特异性序列结合,形成三股螺旋DNA,这种三螺旋结构可阻止转录RNA和DNA的复制,因其作用原理有别于RNA的反义技术,所以有人将三螺旋DNA技术称为反基因技术。11、新药的研究开发过程：化合物发现基本特性研究临床前研究申报临床试验临床试验（、和期）申报试生产申报生产证书产品投放市场后市场跟踪分析。12、先导化合物：从众多天然来源或化学合成的候选化合物中发现具有进一步研究开发意义的物质，具有特定生理活性的化合物,可作为进行结构修饰和改造的模型,从而获得预期药理作用的药物称为先导化合物，是新药研究的起始和基础。高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。新化学实体（New Chemical Entities,NCEs）：指以前没有用于人体治疗并注定可用作处方药的产品，可以治疗、缓解或预防疾病或用作体内疾病的诊断。它不包括现存化合物的新型盐类、前药、代谢物和酯类以及一些生物化合物(如疫苗、抗原和生物技术的其他产品），也不包括组合产品，除非其中一种或几种活性成分以前没有市售。合理药物设计：是以某一疾病发生的分子机制为基础，进一步确定药物作用的靶物质，并尽可能阐明靶分子的结构与功能，再以靶分子为对象设计药物分子，使其能专一结合于靶分子的活性部位(如酶的活性中心)，从而能改变靶分子的活性以发挥药物分子的治疗作用。常见的靶物质有以下几种：.酶：.受体：3.离子通道，4.核酸。组合化学：采用化学、生物学或生物合成方法，把诸如核苷酸、氨基酸、单糖以及各种小分子，系统地装配成不同的组合，高效自动化合成结构多样性，具有多种特征的大量分子，建立可供筛选的化学物质库。13、可以申请专利的生物药物研究成果：从专利保护角度出发，生物技术发明一般分为三类：（1）方法发明。即利用生物转化、纯化、和分离等技术手段产生活的有机体或其他生物组分的方法发明。如一种纯的微生物培养方法，纯化的核酸序列(包括分离的功能基因、质粒等)，以及其他纯化的生物分子(如抗生素、维生素)等。（2）用途发明。也称生物特性利用发明。指有关动物、植物、微生物或其他生物组分的生物特性在应用或用途方面的发明。对于基因和DNA序列的专利主要是保护具有功能的基因和它们的克隆产物的应用(如EPO、tPA)。（3）产品发明。指动植物或其他生物组分的发明。如一种纯的微生物培养物，分离的病毒，专一纯化的蛋白。纯化的核酸序列(包括分离的功能基因、质粒等)，以及其他纯化的生物分子(如抗生素、维生素)等。如果是采用基因重组、体细胞杂交等现代生物技术得到的产品，均是人工创造而非自然界存在的，因此符合发明定义。如果是用选育、突变、筛选等传统方法，需分析用该方法得到的产品是发现还是发明，是否为技术成果。14、模仿创新：也称快速跟踪创新或“me too”创新，是在不侵犯他人专利权的基础上，对已知药物的药理、毒理、代谢及临床效果、作用机理、构效关系等进行充分研究，然后以该药为先导化合物进行结构修饰或改造，得到的改进的化学实体。模仿创新（me-too）的研究方法：（1）密切注视新出现的，很成功的突破性新药，包括“me-too” 途径研制的新药，对母体药物进行结构修饰和改造，寻找新的化学实体（2）对某些无专利保护的新药，尽快进行结构改造形成自己的知识产权保护。（3）有专利保护的新药，深入研究其专利保护范围，在不侵犯专利情况下进行专利边缘创新。（4）有意识的改变局部化学结构，有可能获得强于母体的新药。（5）重视手性药物的开发。如对已有的外消旋体药物进行研究开发成单一对映体的手性药物。15、药品注册：是指国家食品药品监督管理局根据药品注册申请人的申请，依照法定程序，对拟上市销售的药品的安全性、有效性、质量可控性等进行系统评价，并决定是否同意其申请的审批过程。新药：系指未曾在中国境内上市销售的药品。已上市的药品改变剂型，改变给药途径，增加适应症亦按新药管理。可基本上可分为中药与天然药物，化学药物，生物制品几类。创新程度可分为新药,仿制药,进口药三种。定义包含以下三种类型：1.我国未生产，国外也未生产的创新药物2.我国未生产，国外也未生产但已有文献报道过的药物；.国外已生产的，但未在国内销售过。ADME：药代动力学研究，包括药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄。主要研究新药在体内的吸收速率、吸收程度，在体内各重要器官的分布和维持情况以及排泄的速率和程度等。16、临床前研究的内容应当执行药物非临床研究质量管理规范（good laboratory practice ,GLP）药物非临床研究质量管理规范（GLP）：是为评价药物安全性，在实验室条件下，用实验系统进行的各种毒性试验中的标准化管理措施。包括急毒，长毒，生殖毒性，遗传毒性、致癌、局部毒性、免疫原性试验，依赖性试验，及评价药物安全性有关的其它实验。为申请药品注册而进行的药物临床前研究，包括药物的合成工艺、提取方法、理化性质及纯度、剂型选择、处方筛选、制备工艺、检验方法、质量指标、稳定性、药理、毒理、动物药代动力学研究等。生物制品还包括菌毒种、细胞株、生物组织等起始原材料的来源、质量标准、保存条件、生物学特征、遗传稳定性及免疫学的研究等。(一) 新药的药物化学研究：主要包括工艺路线、结构确证和理化特性研究、质量稳定性和质量标准的制定研究等。(二) 药理学研究新药临床前药理研究：包括主要药效学研究、一般药理学研究、药代动力学研究(三) 毒理学研究：急性毒性试验、长期（慢性）毒性试验、生殖毒性与致畸试验、致突变、致癌和其它试验(四) 生物技术药物特殊情况资料17、新生物技术药物的一般研制过程实验研究小量试制 临床前研究阶段中间试制试生产正式生产18、生物利用度：给药后药物急速到达其作用部位的比例。生物等效性试验：是指用生物利用度研究的方法，以药代动力学参数为指标，比较同一种药物的相同或者不同剂型的制剂，在相同的试验条件下，其活性成份吸收程度和速度有无统计学差异的人体试验。19、临床试验（clinical trial）：指任何在人体（病人或健康志愿者）进行药物的系统性研究，以证实或揭示试验药物的作用，不良反应或药代动力学资料，目的是确定实验药物的疗效与安全性。新药的临床试验一般分为34期进行，必须经国家药品监察管理局批准后实施，执行药物临床实验质量管理规范（Good clinical pratice ,GCP）分期和目的：一期临床试验：初步的临床药理学及人体安全性评价阶段目的：研究人体对新药的耐受程度和药代动力学，为制订给药方案提供依据。受试者：在国家药监局新药审评办指定的定点临床试验医院 ， 遵循临床试验规范（GCP），选择10-30例的志愿者，受试者有知情权，男女各半，应给受试者必要的报酬。给药剂量：一般不超过预测剂量的十分之一作为人用的起始剂量，并应事先确定耐受性试验的最大剂量，一般以临床应用该药单次最大剂量为限。从起始剂量至最大剂量之间用几个剂量级别，需视药物安全范围大小根据需要而定。在达到最大剂量仍无毒副反应一般即可终止试验。切不可机械地按动物剂量折算为人用剂量。期临床试验：为治疗作用初步评价阶段，可分为两阶段进行，初步评介药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性 (一)第一阶段目的：在有对照组的条件下详细考察新药的疗效、适应症和不良反应。试验设计：在国家药监局，新药审评办指定的临床试验医院进行，设置对照组，要随机分组，用随机双盲对照法进行试验。对照药：已知有效药物对照组（阳性）和安慰剂对照组（阴性对照）。剂量：药物的使用剂量根据期临床试验结果而定，一般采用一种固定剂量。(二)第二阶段目的：在较大范围内对新药作全面评价，要求进一步扩大病例数（不少于300例）和扩大临床试验单位（不少于3个，多中心实验），可以不采用双盲法。期临床试验：治疗作用确证阶段，扩大的多中心临床试验。其目的是进一步验证药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性，评价利益与风险关系，最终为药物注册申请获得批准提供充分的依据。试验一般应为具有足够样本量的随机盲法对照试验。该期的病例数更大，一般为1000-3000。 期临床试验：又称为后市场试验，(Post marketing trials)， 其目的就是评价药物长期使用的安全性，疗效和不良反应，尤其对于长期使用的药物。20、生物技术药物一般生产过程：获得目的基因构建DNA重组体将重组体导入宿主细胞鉴定筛选阳性克隆构建基因工程菌（或工程细胞）；培养工程菌分离纯化表达产物除菌过滤半成品检定制剂成品检定包装21、生物技术药品质量保证要素（一）药典（pharmacopia）（二）质量保证体系（药品质量管理规范文件及缩写）药品的质量保证起始于新药的研究与开发 ，并贯穿于生产销售和使用的各个环节。研究与开发者，临床前研究，GLP(good laboratory practice 药品非临床研究质量规范)临床研究单位，GCP(Good clinical practice 药品临床试验管理规范)药品生产企业 ，GMP(Good Manyfacturing practice 药品生产质量管理规范)药品经销商，GSP(Good supplying practice 医药商品质量管理规范)医院，消费者，GUP(Good use practice 医药商品使用管理规范)中药栽培企业，GAP（Good Agriculrure Practice 中草药栽培规范）医院药房和药剂科，GPP（Good Pharmacy Practice 医院药房质量管理规范）QAGMPQC(三)生产车间与设备制制药车间设备包括生产专门设施区、质量控制区和贮存区。洁净区：是安装有制药设备并受严格环境洁净控制的区域，注射剂或无菌生物药物必须在洁净区生产，洁净区需特殊设计以防止产品受到污染，常见的污染物有微生物与颗粒物质。洁净区的环境监测：空气悬浮粒子标准监测、微生物限度监测、人员监测（四）制药用水系统 纯化水：为原水经离子交换法、反渗透法、蒸馏法或其他适宜方法制得的供药用的水，不含任何附加剂，可作为配制普通药物制剂用的溶剂或试验用水，不能于注射剂的配制。注射用水：为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌内毒素实验要求，可作配制注射剂用的溶剂。（五）生产许可（8项内容）工艺规程，药品的批准文件（新药证书或药品批准书、药品生产许可证、GMP、批准文号），生产方法(manufacturing method)，生产过程控制方法及标准，原、辅料质量标准，成品质量标准、包装材料质量标准，稳定性考察，变更控制和登记。22、生物技术药物表达系统（一）原核生物细胞（1）大肠杆菌A.表达方式及特点细胞内不溶性表达：包含体胞内可溶性表达：分离纯化较困难细胞周质表达：用渗透振扰法分离产物,可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除 N- 末端的甲硫氨酸， 胞外分泌型表达：通过信号肽携带等操作，是最优选的方法。B.不足分泌能力不足，真核蛋白在E.coli中常形成不溶性包含体，表达产物必须变性和复性处理才能使目的蛋白恢复生物活性。在E.coli表达体系中不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物不能进行糖基化，因此只能用于表达不需糖基化作用的真核蛋白。由于翻译常从起始密码子AUG(甲硫氨酸)开始，因此目的蛋白的N末端常多了一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌还会产生内毒素，故目的产品应作内毒素检测 产生蛋白酶会破坏目的蛋白 C解决方法：降低培养温度(从37降到30)以硫氧还原蛋白为载体进行融合蛋白表达（2）枯草芽孢杆菌 A、优点：分泌能力强，表达产物可直接分泌到培养液中，不形成包含体。B缺点：不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会降解表达产物。（3）链霉菌A特点：不致疾、使用安全、分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。B 缺点：操作比大肠杆菌复杂，转化或转化频率低用于基因表达的启动子少。（二）真核生物细胞（1）酵母A特点：酵母易繁殖，可以大规模廉价培养，而且没有毒性，能将表达产物分泌到细胞外，表达产物能糖基化，在细菌中难于表达的真核基因在酵母中可获得高效表达。它有以下特点：是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后修饰与糖基化；表达量高，如明胶表达量达14.8g/L;培养基成本低；适用高密度发酵；杂蛋白少，产物易纯化。 B缺点色素难以除去 啤酒酵母表达量偏低；大量表达时，常会有质粒丢失；重组蛋白发生超糖基化；分泌蛋白留在壁膜间隙，增加了纯化难度。毕赤酵母表达系统优于啤酒酵母。（2）哺乳动物细胞 A优点：哺乳动物细胞可将表达产物由重组转化细胞分泌到培养液中，使产物易于纯化。哺乳动物细胞分泌的表达产物是糖基化的，接近或类似天然产物。可获得结构与天然蛋白相一致的活性蛋白，对于制造结构复杂的生物药物是其它系统所无法比拟的。B缺点：细胞生长缓慢、生产效率低、培养条件苛刻、费用高，培养液中产物浓度稀，因此生产成本高，扩大生产规模有较大困难。常用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)和幼仓鼠肾细胞(BHK) （3）昆虫细胞表达系统昆虫细胞可进行信号肽的切除，糖基化等蛋白质翻译后加工，并能进行适当的细胞分区和胞外分泌表达。主要包括杆状病毒表达系统、稳定转化系统（stable transformation system）两种。（4）转基因动物：是指通过基因工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰，并通过相应的动物育种技术使这些经修饰改造后的基因组在世代间得以稳定的传递和表达。动物基因组中稳定地整合含有外源性基因的动物。可以大容量、廉价地生产复杂蛋白。（5）转基因植物可大规模生产治疗和诊断用的医用抗体。生产成本比其它任何来源抗体都要低。植物细胞的糖基化与哺乳细胞相似，但能产生一些不同哺乳细胞的糖类残基（木糖残基），而缺乏哺乳动物常见的末端残基唾液酸。23、最终产品的质量控制(1)生物学效价测定 （2）纯度测定（3）药物的比活性（4）理化性质鉴定（5）杂质检测24、蛋白质类药物的降解途径化学上的不稳定性：由多种因素引起的对蛋白质分子的化学基团进行化学修饰，引起原有化学键的断裂或形成新的价键形式。主要有：氧化作用，脱酰胺作用，水解作用，外消旋作用，-消去反应等。物理的不稳定性：主要是涉及到更高级空间结构的改变，包括蛋白质分子二级或高级空间结构的改变，这些改变的引起因素如：温度，pH 等25、不稳定氨基酸残基的化学降解途径不稳定氨基酸残基基本化学反应Asn，Gln脱酰胺、外消旋作用、异构化Asp水解作用、外消旋作用、异构化Met，Cys氧化作用His，Trp，Tyr-消去反应Ser，Thr，Cys外消旋化Cys二硫键交换26、提高生物技术药物稳定性的途径定点突变：通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。化学修饰：多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。添加剂：通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。冻干：多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。27、细胞因子(Cytokine,CK)：主要是由免疫细胞分泌的、在体内含量极低、具有多种生物学活性的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白的统称。细胞因子介导多种免疫细胞间的相互作用。有多种其他名称：单核因子、淋巴因子等。28、细胞因子的分类（按功能分）：白介素（interlenkin,IL），干扰素（interferen,IFN），肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)，集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)，生长因子(growth factor,GF)，趋化性细胞因子(chemokine)，转化生长因子（transforming growth factor，TGF），其它细胞因子。29、白细胞：通常被称为免疫细胞，作为免疫系统的一部分帮助身体抵抗传染病及外来的东西，是血液中一种重要的血细胞。白细胞分类：单核-巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞（粒细胞存在较大颗粒，许多类型的粒细胞可被细胞因子激活，直接引起机体的免疫应答和炎症。粒细胞又可分为三种亚型，即中性，酸性，碱性粒细胞）。30、细胞因子的特点和生物学活性（一）特点(1)绝大多数细胞因子为分子量小于25kDa的糖蛋白，分子量低者如IL-8仅8kDa。多数细胞因子以单体形式存在，少数细胞因子如IL-5、IL-12、M-CSF和TGF-等以双体形式发挥生物学作用。大多数编码细胞因子的基因为单拷贝基因(IFN-除外)，并由45个外显子和34个内含子组成。(2)主要与调节机体的免疫应答、造血功能和炎症反应有关。(3)以自分泌、内分泌、旁分泌的形式发挥作用。通常以旁分泌或自分泌 形式作用于附近细胞或细胞因子产生细胞本身。在生理状态下，绝大多数细胞因子只在产生的局部起作用。(4)高效能作用，体内含量极低，一般在pM(10M)水平即有明显的生物学作用。(5)多种细胞产生，一种IL可由许多种不同的细胞在不同条件下产生， 如IL-1除单核细胞、巨噬细胞或巨噬细胞系产生外，B细胞、NK细胞、成纤维细胞、内皮细胞、 表皮细胞等在某些条件下均可合成和分泌IL-1。(6) 许多类型的细胞可以产生多种细胞因子如成纤维细胞能产生IL-1,11,TNF,CSF,IFN等 (7)多重的调节作用(multiple regulatory action)， 细胞因子不同的调节作用与其本身浓度、作用靶细胞的类型以及同时存在的其它细胞因子种类有关。有时动物种属不一，相同的细胞因子的生物学作用可有较大的差异，如人IL-5主要作用于嗜酸性粒细胞，而鼠IL-5还可作用于B细胞。（多效性）(8)重叠的免疫调节作用 (overlapping regulatory action)，如IL-2、IL-4、IL-9 和IL-12都能维持和促进T淋巴细胞的增殖。（重叠性）(9)以网络形式发挥作用，细胞因子的网络作用主要是通过以下三种方式:a 一种细胞因子诱导或抑制另一种细胞因子的产生，如IL-1和TGF-分别促进或抑制T细胞IL-2的产生；b: 调节同种或不同种细胞因子受体的表达，如高剂量IL-2可诱导NK细胞表达高亲和力IL-2受体；IL-1、IL-5、IL-6等可促进IL-2受体的表达；IL-1能降低TNF受体的密度 :细胞因子生物活性之间的相互影响B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上细胞因子的协同作用或彼此调节（网络性）一种细胞因子可对多种靶细胞发挥作用，产生多种不同的生物学效应，称多效性；几种不同的细胞因子也可同一种靶细胞发生作用，产生相同或相似的生物学效应，称重叠性；一种细胞因子可以抑制另一种细胞因子的某些生物学作用，表现为拮抗效应；可以增强另一细胞因子的某些生物学作用表现为协同效应。（二）细胞因子的生物学活性细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。免疫细胞的调节剂，免疫效应分子，造血细胞刺激剂，炎症反应的促进剂，诱导凋亡，其它。31、干扰素的分类I型干扰素（酸稳定型干扰素）：干扰素，干扰素，干扰素、干扰素II型干扰素： 干扰素I型和II型都诱导应答基因的重叠部分和激活相似的信号级联反应I型和II型在一级氨基酸序列，进化关系，受体交叉反应，产生部位和可诱导性上均不同。两大类结构关联性不大。干扰素：是指一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。抵抗病毒的感染, 干扰病毒的复制的细胞因子，包括IFNa、IFNb、IFNg。32、干扰素的生物学性质（一）IFN结构来源:主要白细胞产生;基因:多基因产物（24种干扰素相关基因）;结构:根据一级结构又可分为I和II两个亚族（subfamily）I：166AA，II：172AA；都有23AA信号肽，各种之间有70%同源性，富含（亮）leu,（谷） Glu，含有四个半胱氨酸(1,29,99,139位)，形成2对二硫键;三级结构相似：只有螺旋, 无-折叠;分子量:理论分子量:19-20kD;等电点:56.5之间,耐酸(二)IFN结构与性质来源:成纤维细胞产生,糖蛋白结构:166AA组成,与IFN有30%同源性,三个Cys,(41-141)二硫键,天冬氨酸(Asp)80位有糖基化位点三级结构:5个螺旋,3个平行,2个反向平行.分子量:Mr20kD性质:耐酸,与IFN一起称为I型干扰素,或酸稳定型干扰素（三）IFN的结构与性质来源：活化的T淋巴细胞产生基因:定位于12号染色体,结构:143AA,四级结构有6个螺旋相对分子质量：17kD 电泳：16-17kD没有被糖基化 20kD97位天冬酰胺(Asn)糖基化 25kD25，97位糖基化活性形式：同源二聚体性质：与（，）I型干扰素无同源性，不耐酸，通常称为II型干扰素。（四）IFN的结构与性质营养胚素，最先发现于反刍动物体内。功能：维持怀孕早期的黄体功能，与妊娠有关。与 HCG相似，有抗病毒能力。结构：成熟的IFN蛋白由172个氨基酸组成，与I型受体相互作用。属I型干扰素，在体外，能与 ，受体结合。生物学活性：能产生与I型干扰素类似的效果，包括抗病毒和免疫调节。但是毒性降低，同时它能加强HIV病毒感染细胞对逆转录酶活性的抑制。重组的绵羊蛋白IFN已报道对治疗多发性硬化症和AIDS病毒感染有效。人的IFN没有绵羊蛋白的潜在免疫原性，具有治疗价值，但至今尚未发现这样人的基因。（五）IFN的结构与性质IFN：172AA组成的糖蛋白，与 有50%-60%的同源性，属I型干扰素，与IFN 关系更为密切。约一亿年前从IFN- 进化而来，可能是原型的IFN- 扩充前的型式，其基因在反刍动物但不在人被复制成高拷贝数。在体外激发与其它I型干扰素相似的生物学效应。（六）IFN 的结构与性质产生：在表皮角化细胞中发现。 病毒感染，与双链RNA、 IFN 、 接触时在角化细胞中被诱导产生。基因定位在9号染色体，蛋白有207AA组成。与其它I型IFN蛋白有30%的同源性。生物学活性：以种族或组织专一的方式，利用与其他I型IFN相同的受体和信号途径来产生细胞保护以抗病毒感染。33、干扰素的作用原理JAK-STAT通路（JAK：Janus激酶；STAT：转录信号传导和激活因子）配体与受体的结合促进受体的二聚化，使与受体连接的JAKs相互靠近，并发生磷酸化，活化的JAKs进一步使受体的特定酪氨酸发生磷酸化而促进一种或多种胞浆蛋白STATs家族成员与受体连接并发生磷酸化激活。活化的STATs转运到细胞核，直接对干扰素和其它细胞因子的基因表达进行调控。34、干扰素的结构改造融合干扰素：融合分子的结构功能分析表明IFN- 分子的N末端部分对它们的生物活性至关重要。将IFN- 1的前61个氨基酸残基与2的后104个氨基酸残基组成的融合体对鼠细胞表现出高度抗病毒活性。IFN- 1的前91个氨基酸残基与4的后72个氨基酸残基组成的融合体没有抗病毒活性，但却提高了抗肿瘤活性。PEG化干扰素：PEG交联分子有更高的耐热性，物理稳定性，更好的抗蛋白酶降解的保护性，更好的溶解性，更长的体内循环半衰期和更低的清除率，降低免疫原性和抗原性。35、干扰素的生物学活性（1） 抗病毒繁殖：IFN抗病毒作用（机制）是通过影响两个酶系统而实现的，一是eIF-2蛋白激酶激活蛋白激酶产生磷酸化，使起起动因子“翻译”过程障碍，病毒复制受阻；二是激活2,5-寡腺苷酸合成酶，激活内源性核酸内切酶,分解病毒mRNA，终致病毒复制受阻。（2）直接抗肿瘤（3）间接抗肿瘤 (4)IFN还具有双向免疫调节作用36、干扰素的临床应用IFN-2a和IFN-2b：毛细胞白血病IFN-2b和IFN-n3：性传播生殖疣IFN-：多发性硬化症IFN-：类风湿性关节炎、慢性肉芽瘤37、白介素（interleukin,IL）：主要由白细胞产生，介导白细胞间相互作用，具有免疫调节活性的细胞因子。是一类低相对分子质量的蛋白多肽,通常由1个或多个基因表达合成,已发现并命名了23种白介素。38、IL-2【合成和分泌的主要细胞：活化的T细胞（CD4+细胞和CD8+细胞），T细胞瘤细胞（EL-4、Jurkat、BSM、MLA-144和LBRM-33等），大颗粒淋巴细胞（LGL），包括NK细胞和LAK细胞。】基因结构及表达产物的分子结构：基因定位于4号染色体上,长5kbp,4个exon,3个intron组成.人和小鼠IL-2基因DNA序列有63%同源性。IL-2前体多肽153 AA残基，去除N端20个AA信号肽，成熟的IL-2由133AA构成。IL-2受体：白介素-2受体（IL-2R）为异多聚糖蛋白，分子量约140kDa，由三条链组成。其中链55kDa， IL-2R链是IL-2 特异的，只与IL-2结合； 链7075kDa， IL-2R链属于造血因子受体家族，与EPO、 IL-4、 IL-3、 IL-7、GM-CSF、生长因子和催乳激素等受体相似，可与 IL-15结合；富含丝氨酸和脯氨酸。链65kDa。IL-2R链与IL-4、 IL-7和 IL-13 等受体的链相同，为每种白细胞介素受体共有的链。由于 IL-2R 具有多种形式，故结合IL-2的亲和力也不同。链和链亲和力低，不能传导信号,单独链也不能结合IL-2 ；/异二聚体是IL-2R主要存在形式，具有高亲和力，但易解离；/异二聚体具有中度亲和力，但是能诱发细胞内一系列的信号传递过程。/链三聚体具有高亲和力，且不易解离，故能有效地传导信号。IL-2结构与功能关系：（1）螺旋A与结合 IL-2受体链有关。其中Asp20和Leu17高度保守，用Lys取代后可使IL-2完全失去活性和结合能力。（2）螺旋A和螺旋B-B中的Lys35、Arg38、Phe42,Lys43与IL-2结合 IL-2受体链的有关。用Ala代替Arg38后， IL-2则不能与 IL-2受体链结合。（3）螺旋D中的Gln126与 IL-2结合链有关。（4）Leu17、Trp121和Phe44是 IL-2的活性位点。（5）除去IL-2 N端1-10AA，活性下降30-50%。除去IL-2 N端1-20AA，活性消失。（6）Cys58,Cys105,Cys125 ，其中Cys58-Cys105 形成二硫键，在保持IL-生物学活性上起关键作用。Cys125易使IL-2形成链间二硫键，形成二聚体，使IL-2活性下降。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。 改变 IL-2的氨基酸序列或分子结构，均会影响其活性效应。理化性质：分子量为1517kDa 的糖蛋白，有无糖基化对活性无影响。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63%同源性。多肽链中含有等量的酸性氨基酸和碱性氨基酸，等电点为6.28.2。rIL-2 PI 7.756保活1小时，65 30min失活蛋白酶敏感，而对核酸酶和神经氨酸酶不敏感4mol/L尿素中稳定1%SDS 75 17min活性不失。pH 4-9稳定结构改造：A、新型人的IL-2：针对结构中Cys125易形成链间二硫键进行定点诱变（site-spcific mutation），降低了包涵体复性过程中的二硫键错配的可能性，有效防止分子内二硫键的错配或分子间二聚体的形成。现已有应用点突变，将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使其只能形成一种二硫键，保证了在IL-2复性过程的活性。B、PEG修饰的IL-2；C、IL-2融合蛋白39、IL-11主要作用于髓系干细胞、B细胞、巨核细胞、浆细胞瘤细胞和脂肪细胞。又名脂肪细胞生长抑制因子。一种在生物学功能上类似于IL-6的造血刺激因子。基因：位于19染色体上，由5个外显子和4个内含子组成，长约7kb.编码由199个氨基酸残基组成的前体蛋白，含21个氨基酸的先导序列。结构：成熟人的IL-11的分子量为23kDa，含178个氨基酸残基，其中富含脯氨酸（12%），不含二硫键和潜在的糖基化位点，与灵长类IL-11有94%氨基酸同源性。性质：IL-11对热稳定，在中性PBS中可耐受80处理。IL-11在碱性环境中稳定，但很易与保存管的管壁结合而降低活性，在低浓度时尤为明显。在酸性条件下，易被水解而失活。在中性环境中IL-11呈高度碱性，PI为11.7,是一个高度碱性蛋白。结构和功能的关系：IL-11具四个螺旋区,其中Met58和Lys41、Lys98位于分子表面。化学修饰和点突变研究表明Met58改变导致IL-11体外活性下降25倍,Lys41和Lys98改变导致IL-11体外活性下降3倍。端对IL- 11的活性影响甚大,可能参与IL-11受体结合,如端缺失4个氨基酸活性下降25倍,缺失8个或8个以上氨基酸活性就完全丧失。IL-11R：链：151KD，造血因子超家族，是受体与IL-11特异性结合部位。 链：与IL-6R、LIFR（白血病抑制因子受体）、OSMR(肿瘤抑制素M受体),CNTER(睫状神经营养因子受体)等共有的gp130，因此这些细胞因子有相似的生物学活性。生物学活性：对造血系统的作用（1）促进骨髓集落形成、促进原始多潜能祖细胞的增殖及其他造血前体细胞的生长和增殖。对淋巴样细胞系,髓样细胞系和红细胞系和巨核细胞系均有作用.对多能造血前体细胞,淋巴造血前体细胞,髓样造血前体细胞和红细胞系前体细胞的增殖有刺激作用.（2）促进巨核细胞的形成和成熟,促血小板生成。（3）协同PTH(甲状旁腺激素)等促进破骨细胞发育。（4）参与神经组织的调节，诱导神经元的分化。（5）其他效应如抑制脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL)活性和脂肪细胞的分化，抑制脂肪形成,故又称脂肪形成抑制因子(AGIF)。 （6）促进肝细胞分泌急性期蛋白。临床应用：血小板减少和中性粒细胞减少40、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）：是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。TNF-和TNF-在产生上的区别：TNF-主要是由巨噬细胞产生，LPS是其较强的诱导剂，T细胞和NK细胞在某些刺激因子（如乙酸豆寇佛波醇PMA）作用下也可分泌此类因子。TNF-主要是由活化的T细胞产生，T细胞在抗原、丝裂原等刺激物的作用下可合成高水平的TNF-。TNF-的结构和性质：产生：单核细胞、巨噬细胞产生诱导剂：LPS、IFN-、M-CSF，GM-CSF抑制剂：PGE结构：hTNF基因位于染色体6，基因全长约3.6kb，包括4个外显子和3个内含子，它所编码的前体蛋白含有233个氨基酸，其中内含76个氨基酸残基的特长先导信号肽，该信号肽在翻译过程中不被切除，而是成为跨膜TNF，将前体蛋白固定在细胞膜上，成为有活性的跨膜TNF。酶解去除信号肽后，成为分泌型TNF。成熟的TNF157AA。成熟的TNF-不需糖基化，Cys69-Cys101二硫键， TNF-单体的分子量为17kDa，其活性单位为三聚体（51kDa），三个单体组成三角棱锥体。性质：PI为5.6，TNF-对多种蛋白酶敏感（如胰蛋白酶、糜蛋白酶和V8蛋白酶等）；在4可保存6个月；对5610分钟处理稳定，但经70处理1小时则可失去活性；pH510时稳定，但在pH4时即可失活。TNFR：I型55kDa ，与TNF-和TNF-结合，型受体转导的信号与细胞毒性和内毒素休克有关。 II型75kDa,与TNF-和TNF-结合,型受体与TNF的亲和力是型受体的10倍。型受体转导的信号可促进T细胞的增殖。与I型结构相似，但对TNF亲和力显著高于I型。TNF-结构特点（结构和功能的关系）：具有生物活性的hTNF其空间结构是3个TNF单体以边对面形式形成的近似三角锥形的三聚体,结构与功能研究表明,删去端前7个氨基酸残基不影响hTNF三聚体空间结构。删去端7个氨基酸残基的同时增加端的碱性氨基酸,可以增强形成活性三聚体的能力,从而提高hTNF的抗肿瘤活性。端的氨基酸具有高度的同源性,对该区域进行缺失改造会引起hTNF的生物学活性明显下降。由于端位于三聚体的内部,3个单体157位的氨基酸相互靠得很近,这种空间结构的维持主要依赖于氢键和疏水性相互作用,因此增加端的疏水性氨基酸可以提高hTNF的抗瘤活性。基于hTNF结构与功能的关系,国内外研究者对hTNF端、端的结构基因进行了各种定点突变,并获得了许多新型有效的hTNF衍生物。TNF-的结构改造：（大方向）N端改造：（1）删去端7肽,且将hTNF的Pro8 Ser9 Asp10用Arg8 Lys9 Arg10替代,结果得到的衍生物不仅活力提高为野生型的6倍,还扩大了抑瘤谱,降低了TNF对小鼠的致死毒性。（2）将hTNF的Arg2改为Lys2,活性比野生型高了4倍多,且毒性小,同时对一些野生型不能抑制的癌症,如人体胃癌和肺腺癌表现出很强的抑制活性。 (3)N端缺失1-7AA ,Ser52-Ile+Tyr56-Phe,与天然相比，对肿瘤细胞杀伤力提高14-24倍。 (4)N端缺失1-7AA，Leu29-Ser+Ser52-Ile+Tyr56-Phe,体外和体内毒副作用均降低90-95%，但生理活性未变。（5）将野生型TNF的Arg29-Val构建29突变体；Arg4 Thr5 Pro6突变成Arg4 Gly5Asp6的RGDT突变体；同时做上述两种突变的RGDV29突变体。 29突变体在表现抗肿瘤活性的同时显著降低了对正常细胞的细胞毒活性,RGDT突变体在肠胃毒性方面也得到明显的改善; RGDV29突变体不仅比TNF抗肿瘤效果突出,而且还表现出对正常细胞的低细胞毒作用,是一个理想的低毒抗瘤药物。中部和C端改造：(1)将hTNF分子中部Ile80、Lys90和Asn92突变为Ser80、His90和Val92,毒副作用下降89%，生理活性未变。(2)端缺失7个氨基酸、中部缺失6个氨基酸(102107)的衍生物,不但细胞毒活性比原型提高了一个数量级,而且抑瘤谱广、稳定性好。(3)将端157位氨基酸由Leu变为Phe,能使TNF诱导细胞分化的作用增强20倍,但稳定性下降。(4)端缺失7个氨基酸,且Pro8 Ser9 Asp10突变为Arg8 Lys9 Arg10 ,端Leu157突变为Phe157已获得新药证书。阻止分泌型TNF产生：由于跨膜型TNF(TMTNF)易在某些蛋白酶的作用下转换为分泌型TNF(STNF),STNF可进入血循环引起全身的毒副作用,故极大地限制了它的临床应用。因此为保留TMTNF而又阻止STNF的产生, 应用体外定点突变技术删除编码第112位氨基酸的密码子,造成TMTNF转换为STNF酶切位点的缺失,获得了不能酶解成STNF的TMTNF突变体(TMTNF)。经突变删除了12个氨基酸(Val1-Pro12)的TMTNF仍然保留有TMTNF的生物学