做好血液涂片和正确染色.doc

做好血液涂片和正确染色，是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直 接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。（一） 玻片的清洁1一般清洗法（1） 将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。（2） 用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 5 次。必要时再置95 乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。 新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。2油污载片清洗法（1） 清洗液甲液10gL 过锰酸钾水溶液 乙液25gL 草酸水溶液（2） 清洗方法 将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95 乙醇中，以毛巾擦干净即成。 久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。（二） 血涂片制作取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移， 接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 45角，向前平稳均匀推 动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干 燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号 （图142）。图14 2 推血片方式一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整 齐，并留有一定的空隙。涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的 血膜片50 的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主 要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。（三） 染色1瑞氏染色法 （Wright staining）本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中 的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。（1） 原理 瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离 子。如以 M 代表美蓝，以E 代表伊红，其反应式为：M Cl Na E M E NaCl美蓝 伊红伊红化美蓝 （ 瑞 士 染 料 ）将适量的 M E 溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使 ME 溶解，解离为 M 和E ，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着色。甲醇的另一 个作用是有很强的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被 沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染 色效果。细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附 作用，又有化学亲和作用。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对各种染 料的亲和力也不一样，因此，在血片上可以见到不同的着色。细胞中碱性物质与酸性染 料伊红结合染成红色，因此该物质又称为嗜酸性物质。如，红细胞中的血红蛋白，嗜酸 性粒细胞胞浆中的颗粒为碱性物质，这些物质可与伊红结合染成红色。细胞中的酸性物 质可与染液中的碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质，如：嗜碱性粒细 胞中的颗粒为酸性物质可与碱性染料美蓝结合染成蓝色。细胞核主要由脱氧核糖核酸和 强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组成，这种强碱性的物质与瑞氏染液中的酸 性染料伊红结合成红色，但因为核蛋白中还有少量的弱酸性物质，它们又与染料中的碱 性染料美蓝作用染成蓝色。但因含量太少，蓝色反应极弱，故核染色呈现紫红色。幼稚 红细胞的胞浆和细胞核的核仁中含有酸性物质，它们与染液中的碱性染料美蓝有亲和 力，故染成蓝色。当细胞含酸、碱性物质各半时，它们既与酸性染料作用，又与碱性染 料作用，染成红蓝色或灰红色，即所谓多嗜性。当胞浆中的酸性物质消失时，只与染液 中的伊红起作用，则染成红色，即所谓正色性。（2） 试剂瑞氏染液瑞氏染料 （粉）10g纯甲醇 （AR 级以上）6000 ml将全部染料放入乳钵内，先加少量甲醇慢慢地研磨 （至少半小时），以使染料充分 溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒人洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶 解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。 密闭保存。磷酸盐缓冲液 （pH64 68）磷酸二氢钾 （K H2PO4）03g磷酸氢二钠 （Na2 HPO4）02g蒸馏水加至10000ml配好后用磷酸盐溶液校正pH ，如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。（3） 操作用蜡笔在血膜两头划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。用瑞氏染液3 5 滴覆盖整个血膜，固定细胞05 1 分钟。滴加等量或稍多的缓冲液，用吸球将其与染液吹匀，或者摇动玻片染色5 10 分钟。慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥后 （或用滤纸吸干），即可镜检。2姬姆萨染色法 （Giemsa staining）（1） 原理 姬姆萨染料由天青、伊红组成，其染色原理与瑞氏染色法基本相同，但姬姆萨染色法对细胞核着色较好，结构显示更清晰，而对胞浆和中性颗粒则染色较差。（2） 试剂姬姆萨 （Giemsa） 染料10g 甘油660ml 甲醇660ml将10g 姬姆萨染料粉末全部倒入盛有660ml 甘油的圆锥烧瓶内，在56 的水浴锅 上加热90 120 分钟，使染料与甘油充分混匀溶解，然后加入60 预热的甲醇，充分摇 匀后置棕色瓶中，于室温下7 天，过滤后才能使用。此种染液放置时间愈久，细胞着色 越佳。（3） 操作将干燥血片用甲醇固定3 5 分钟。将固定的血片置于被pH64 68 磷酸盐缓冲液 （同瑞氏染色） 稀释10 20 倍的 姬姆萨染液中，浸染10 30 分钟 （标本较少可用滴染法）。取出用水冲洗，待干后镜检。3瑞氏姬姆萨混合一次染色法I 液：取瑞氏染粉1g 、姬姆萨染粉03g ，置洁净研钵中，加少量甲醇 （分析纯） 研 磨片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上液。如此连续几次，共用 甲醇500 ml ，收集于棕色瓶中，每天早、晚各振摇3 分钟，共5 天，以后存放1 周即能使用。液：pH64 68 磷酸盐缓冲液磷酸二氢钾 （无水）664g 磷酸氢二钾 （无水）256g 加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH ，加水至1000ml。操作平置玻片于染色架上，滴加染液3 5 滴，使其迅速盖满血膜，约1 分钟后， 滴加缓冲液5 10 滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混合，5 10 分钟后 用水冲去染液，待干。（四） 血涂片的质量控制1血膜片的质量要求是厚薄均匀适度，低倍镜下观察全片，细胞不重叠，头尾及 两侧有一定的空隙，血膜头部有明确的病人标志。2些体积较大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此蜡笔划线时应注意保存血膜 尾部细胞，血膜必须充分干燥，否则在染色过程中容易脱落。3配制染料须用优质甲醇，稀释染液用缓冲液，因为缓冲液的pH 对细胞染色的影响很重要。在偏酸性环境中正电荷增多，在偏碱性环境中负电荷增多，又因为细胞着色 对氢离子浓度十分敏感。如果染色偏碱，原是紫红色的中性颗粒则染成深蓝色，造成识 别困难。冲洗须用中性水，虽亦可用自来水 （但不能保持稳定）。4对所用染液应进行预染试验，新配制的染液放置一段时间后其中的美蓝逐渐氧 化成天青B ，天青B 对细胞核的着色效果比美蓝好，因此，瑞氏染液放置时间越长染色 效果越好，临床上称之为成熟。判断染液成熟程度的简易方法是用正常优质血片做预染 试验，先用低倍镜观察载有染液的血片，认为着色满意后，再按照染色后冲洗顺序最后 用油镜镜检，这样不仅可了解染液的成熟程度，而且还可以选择合适的染色时间，供临 床标本染色时参考。5染液与缓冲液的比例要适当，以127 为宜。一般说来缓冲液稀释度愈大，染色 时间愈长，细胞着色愈匀称、鲜艳。缓冲液和染液量要充足，否则染液很快蒸发，染料 沉淀于细胞上，使细胞深染