Beckman MoFlo XDP超速流式细胞分选系统操作规程.docx

MolFlo XDP流式细胞仪操作流程一、开机及光路调节1 开机前打开空调，保持持室内温度22左右2 开机前确认鞘液桶液体量，倒空废液桶，将鞘液桶拧紧3 打开UPS4 开主机电源，和aXcess Control Panel5 打开负压泵，打开增压和负压阀，确认鞘液压力达到正常值6 开激光、液流7 调整液流，至最佳平稳状态8 开启电脑，打开Summit 软件，按需要设定光路调节窗口9 待激光开启预热半小时后，调节光斑，按需要调节488nm、633nm（405nm）和305nm激光通路的光斑10 光斑调制最佳状态后应用多色微球调节光路，按每个通道所要求调整CV值至最佳状态二、样本制备推荐方法1、实验准备阶段：s 目标细胞的MARKER, 对应的抗体和荧光选择：了解需要检测的目标细胞的特异性标记和对应的抗体,选择商品化的抗体(荧光标记或未标记,合适的荧光素或二抗)s 选择合适的荧光和抗体对照2、 样本处理 必须是单细胞悬液. 外周血和骨髓收集时加抗凝剂即可进行染色,可溶解红细胞或直接进行检测和分选。. 培养细胞需要消化(推荐用混合蛋白酶消化,按照说明书浓度), 过滤和洗涤至少一次后才能染色.组织样本必须通过研磨成单细胞并过滤后才能进行染色. 通常 100-300 目滤网(一次性, 不锈钢或尼龙网都行) .3、荧光染色： 按照 106 有效细胞与1ug 抗体进行染色或按照抗体说明书推荐的量进行。如果商品化抗体指明实验次数,也要对标本的细胞浓度进行计数. 染色通常室温30 分钟或冰上1 小时即可完成, 染色体系体积通常在100-500ul,可以适量加入去处非特异性染色的BSA 或其它血清。部分有特殊要求的抗体按照说明书进行染色. 避光保存任何加有荧光的样本可以保护荧光素不被其它因素引起的淬灭。 稀释和过滤：在染色完成后通常加入 PBS 稀释样本至500-1000ul 备检,在上机前最好再行过滤以防部分细胞(如肿瘤细胞)聚集成团.堵塞仪器喷嘴4、 细胞荧光检测：要求单个核细胞，细胞数量510551065、细胞分选： 如果样本细胞需要分选，保证样本处理和染色过程在无菌环境进行并尽量低温保证细胞活性，推荐细胞重悬在培养基/生理盐水/PBS 尽量浓缩分选的起始样本，推荐起始样本体积 1 ml; 推荐样本中细胞浓度 1 X 108/ml 收集分选细胞的试管或多孔板也要无菌，最好使用之前 10% 小牛血清封闭4 度过夜，使用前弃去，加入1 ml 培养液待用5、 细胞分选所需的时间与样本细胞浓度有关，如果要快速分选，可以减少样本体积，10um 以下的小细胞适合更高浓度6、 MoFlo XDP 可提供不同的分选要求组合逻辑来满足不同的实验需求三、检测1、检测标本按上述要求准备2、应用summit软件，建立所需要的protocol3、根据单染、blank和同型对照调节补偿4、检测样本四、分选1、分选收集管准备s 如果样本细胞需要分选，保证样本处理和染色过程在无菌环境进行并尽量低温保证细胞活性s 收集分选细胞的试管或多孔板也要无菌，使用之前10% 小牛血清（稀释于PBS）加满整个试管于4 度封闭过夜，使用前弃去，加入1-2 ml 培养液待用s 收集结束后，立即离心样本管内细胞（300g，3-5 分钟），弃上清，加入温（37 度）培养液立即s 放置于适合的培养条件s 目的：能减少收集管壁对细胞的非特异性吸附，提高实际产量和细胞活性2.2、分选s 分选前管道消毒s 选择分选收集模式s 选择液滴偏向角度s 确定Drop Delays 标本上机，标本按上述要求准备s 放置合适的收集器门、获取数据，进行分选五、清洁和保养1、每日检测或分选结束后需对仪器进行清洁维护2、先用无菌双蒸馏水上机，清洗10分钟3、再用专用清洗液清洗10min4、最后用无菌双蒸馏水再清洗30min5、将喷嘴取下，在超声仪中进行清洗15min六、关机1、清洗结束后关闭液流和激光2、关闭增压