蛋白表达纯化实验步骤.doc

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。2、 设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、 RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、 双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。5、 转化到DH5感受态细菌中扩增，提质粒。6、 将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。7、 蛋白的诱导表达。1） 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25M到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。2） SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。3） 将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。4） 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成50l一管，每次用一管，避免反复冻融。8、 包涵体检测。方案见 附件29、 如有上清表达，则扩大摇菌。1） 取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。2） 将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约2.5h3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。3） 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18左右），转速140rpm左右。4） 将菌液6000rpm，4min，4度 离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。10、 超声波裂解。1） 用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。11、 取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。）12、 纯化上清-摸洗脱条件。1） 镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。2） 将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20l过柱后的样品，以备跑胶。3） 分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。4） 加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。5） 加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。（尿素可能对NI柱有损伤。）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。13、 跑胶验证。1） 跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。2） 跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3） 300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。）4） 考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。5） 脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。14、 纯化上清-收集目的蛋白1) 将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。2) 重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。15、 跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。16、 透析。1） 配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。2） 透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。3） 用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4冰箱1.5h后换液。透析3次即可。注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。17、 浓缩。1） 将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。2） 30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。3） 每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。4） 透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4存放。注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。18、 超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。1） 将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。2） 配平。3） 7400g，30min，4离心，结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。4） 加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。5） 收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度（测量后），制备日期。注：超滤管的使用方法见附件419、 蛋白浓度测定。见附件320、 蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。21、 抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。22、 注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。23、 收集免疫血清。提取抗体。24、 抗体效价评定。附件1所需溶液配方：1) 20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g）1L059285.80219217.5322) Equilibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.4 3) Wash Buffer（清洗缓冲液）: PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 pH 7.44) Elution Buffer（洗脱缓冲液）: PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.45) MES（再生缓冲液）: 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodium chloride; pH 5.0。即0.3904g MES+0.5844g NaCl.6) 透析袋处理液： 2%（w/v）碳酸氢钠和1mmol/L(pH8.0)EDTA7) 透析液：20mM PBS+50 mM NaCl（2.92g）试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g）1L059285.8021922.92gTIPS:14的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS，用500ml水将试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml，Equilibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml。附件2包涵体检测1. 摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。在离心前取500l菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。2. 诱导完成后，用2ml EP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。1.5mlPBS(50m M PBS,300m M NaCl )重悬细菌。3. 裂解细胞。 用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。裂解3s，停止6s，裂解时冰上放置。4. 分离上清。5000rpm，4min，4除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm，10min，4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5微5*SDS loading buffer混匀，煮沸10min。5. 重悬包涵体。 用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloading buffer，煮沸10min。6. 正负对照的收集。离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40l,加入10l5*SDSloading buffer,煮沸10min裂解。7. 跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: -,+,上清,包涵体.附件3蛋白浓度定量测试方案1将染色剂稀释。稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44m的滤膜过滤于另50ml离心管中。(此剂量可测4个样品。)2牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备 1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500l/支(可以室温放置60天，-20度长期保存)。 2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180l，另外加一管水为零对照。 浓度0.2mg/ml0.4 mg/ml0.6 mg/ml0.8 mg/mlBSA（1mg）36l72l108l144lH2O144l108l72l36l3染色。 1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。4个梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品(或1+n个样品)和1个blank，共10支EP管(或10+n支)，分别对应标记。2）将30l样品和30l标准BSA及30l H2O分别加入上述EP管中。涡旋混匀。3）室温孵育5min到60min。5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为Absorbance wil increase over time。4. 吸光度的测量。 600nm处测量，并记录吸光度。注意：1. blank是染色液加30微升的水。2.从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测量顺序。5. 比色皿的洗涤。 用100%乙醇浸泡洗涤。6. 标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。附件4. 4ml millipore超滤离心管使用注意事项1. 用前用miliq 水润湿。2. 4度预冷。3. 离心力不能超过7500g。加速度设定为8.4. 离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一致。5. 使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存。如果要短期保存几天，也可加水浸泡。附件5聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法附件6.包涵体蛋白的提纯与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后，离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer