高中生物专题5dna和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增dna片段课件新人教版选修1

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 课题背景 在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析 PCR技术能快速扩增DNA片段 在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝 有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题 现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和基因测序 课题目标 1 理解PCR的原理和反应过程 2 尝试PCR技术的基本操作 3 讨论PCR技术的应用 PCR仪 以 DNA复制 为背景材料 设计问题 导入新课 首先回顾DNA的结构和复制的有关知识 然后了解PCR技术的原理和应用 接着讲解PCR技术的反应过程及具体实验操作步骤 后以视频观看来再次学习实验的知识点 最后通过课堂检测完善所学内容 通过对PCR反应过程的教学 应以读图识图为主 教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分 每一轮反应的三个基本步骤 变性 复性 延伸 每一步骤的作用 在教学中分析图形的同时 结合教科书中的文字说明来加深理解 1 胞内DNA复制的基本体系 一 基础知识 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸 一 PCR原理 2 DNA双链方向与复制关系 2 DNA聚合酶只能从3 端延伸DNA链 故DNA复制需要引物 1 DNA的羟基 OH 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 DNA合成总是从子链的5 端向3 端伸 3 端 5 端 3 PCR原理 1 DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 变性 80 100 C的温度范围内 DNA双螺旋结构解体 双链分开 加热变性 复性 温度缓慢降低后 两条彼此分离的DNA链重新结合成双链 缓慢冷却复性 2 耐高温的TaqDNA聚合酶 3 缓冲液为PCR反应提供的物质 DNA模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 方法点拨 细胞内复制和PCR不同点 PCR过程需要的引物不是RNA 而是人工合成的DNA单链 其长度通常为20 30个脱氧核苷酸 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 二 PCR的反应过程 PCR一般要经历三十多次循环 每次循环分为变性 复性和延伸三步 1 变性 温度上升到90 以上时 双链DNA解旋为单链 2 复性 温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 A T C G 在DNA聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 3 延伸 方法点拨 1 72 左右时 TaqDNA聚合酶有最大活性 可使DNA新链由5 端向3 端延伸 2 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列 使该段固定长度的序列呈 指数式 扩增 标准的PCR过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 A 92 50 72 B 72 50 92 C 50 92 72 D 80 50 72 栏目链接 典型例题 A 方法点拨 1 变性 温度上升到90 90 96 以上时 双链DNA解旋为单链 2 复性 温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 3 延伸 溶液中的四种脱氧核苷酸 A T C G 在TaqDNA聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 二 实验操作 1 PCR仪 一 设备及用具 一台能够自动调控温度的仪器 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 1 准备 2 移液 二 实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 3 混合 过程 盖严微量离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 注意 A 离心管口的盖子一定盖严 防止实验中脱落或液体外溢 B 手指轻轻弹击微量离心管的管壁 目的是使反应液混合均匀 4 离心 过程 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 目的 使反应液体集中在离心管底部 提高反应效果 5 反应 将离心管放入PCR仪上 设置好PCR仪的循环程序 注意事项 避免外源DNA等因素的污染 隔离操作区 所用微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌 分装试剂 简化操作程序 使用一次性枪头 在PCR实验操作中 下列说法不正确的是 A 在微量离心管中添加各种试剂时 只需一个枪头B 离心管的盖子一定要盖严 防止液体外溢C 用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D 离心的目的是使反应液集中在离心管部 提高反应效果 变式训练 栏目链接 典型例题 A 3 离心10s的目的是使反应液集中在离心管部 提高反应效果 方法点拨 1 在微量离心管中添加各种试剂时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须更换 以确保实验的准确性 2 离心管的盖子一定要盖严 防止实验中脱落或液体外溢 一 理论上DNA扩增数目的计算 1 一条DNA 复制n次 DNA为2n 2 a条DNA 复制n次 DNA为a 2n 二 实验中DNA含量的测定 1 原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与DNA的含量有关 三 课题成果评价 2 过程 稀释 2uLPCR反应液 加入98uL蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 计算 取DNA稀释液100uL至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 DNA含量 g 50 x 260nm的读数 x稀释倍数 50 1 g mL的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0 02 紫外分光度计 比色杯 四 课题延伸 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出特点 例如 PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环扩增量达230个拷贝 109拷贝 课堂小结 一 PCR原理 1 变性 温度上升到90 90 96 以上时 双链DNA解旋为单链 2 复性 温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 3 延伸 溶液中的四种脱氧核苷酸 A T C G 在TaqDNA聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 二 PCR操作 1 准备 2 移液 3 混合 4 离心 5 反应 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比 主要有两点不同 它们是 PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA PCR过程不需要DNA聚合酶 PCR过