过氧化氢酶活测定.doc

过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与设备与试剂】 1、材料小麦叶片等。2、仪器设备 研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计； 3、试剂 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入23ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5下保存备用。2. 酶活性测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S1S2S3管号S0S1S2粗酶液(ml)0.20.20.2蒸馏水/ml1.01.01.0pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5 将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。 过氧化氢酶活性U/(g.min)= A240= AS0 式中 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2样品管吸光值； Vt粗酶提取液总体积（ml）； V1测定用粗酶液体积（ml）； FW样品鲜重（g）； 0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 【注】 所用H2O2溶液及KMnO4一溶液临用前需重新标定。 【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 高锰酸钾滴定法一、原理 过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 小麦叶片 （二）仪器设备 1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。 （三）试剂：1. 10%H2SO4。2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液。3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液 取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定。4. 取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。 三、实验步骤 （一）酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 （二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。 （三）、用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 四、结果计算 酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示： 过氧化氢酶活性（mg/(g.min)（AB） 式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后K