病毒概论

病毒学总论,3000BC，埃及孟非思壁画中长老患小儿麻痹症,Variolation involved inhalation of the dried crusts from smallpox lesions like snuff, or in later modifications, inoculation of the pus from a lesion into a scratch on the forearm of a child.,体积微小，结构简单，只含有一种类型的核酸，只能在活的、敏感细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物,病毒概念,病毒的发现1892年发现第一个病毒即烟草花叶病毒1898年发现动物口蹄疫病毒首先被证实对人类有致病性的是黄热病毒（1901年发现）,烟草花叶病毒的发现Iwanowski于1892年首次证明了这个病害是由滤过性病原体即病毒所引起的。Stanley于1935年首先从病叶榨汁中分离到病毒体结晶，并了解其含有蛋白质和核酸，并肯定病原就是这个病毒。,体积微小，可通过滤菌器，电子显微镜观察结构简单：非细胞结构“一包基因” 基因组：只有一种核酸（RNA或DNA）严格活细胞内寄生以复制方式繁殖对抗生素不敏感，耐冷不耐热,病毒的特点,病毒引起疾病的特点,涉及面广：75%由病毒引起传染性强、传播迅速：如流感病毒病死率高：如狂犬病病毒后遗症严重：如脊灰病毒持续感染：如乙肝病毒引起肿瘤：如爱滋病毒致畸性：如风疹病毒特效药少，对抗生素不敏感预防是重点,病毒的基本性状,一、病毒的大小与形态,病毒体（virion）完整的成熟病毒颗粒，具有典型的形态结构，并有感染性病毒的大小测量单位 ：纳米（nm） 100,000 released by poliovirus,病毒的异常增殖,缺损病毒（ defective virus ） 基因组缺损，必须依赖于辅助病毒才能复制，它不是由其辅助病毒的基因缺失产生的，是存在于自然界中一种绝对缺损病毒，形态结构和抗原性都与辅助病毒不同，基因组很少有同源性。 辅助病毒：辅助缺损病毒复制具有感染力的完整病毒,病毒的异常增殖,缺损干扰颗粒 是病毒复制时产生的一类亚基因组的缺失突变体，必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。其基因组比其完整病毒小，复制更迅速，在与其完全病毒共感染时易占据优势，从而干扰其复制。 顿挫感染（流产感染）： 细胞条件不合适，病毒进入细胞但不能复制出感染性病毒颗粒,非容纳细胞（如猴肾细胞对人腺病毒）顿挫感染容纳细胞（如猴肾细胞对脊髓灰质炎病毒）,病毒的干扰现象,干扰现象interference 当两种病毒同时或先后感染同一细胞时，可发生一种病毒的增殖抑制另一种病毒增殖的现象可发生在异种、同种、同型甚至同株病毒之间灭活病毒也可干扰活病毒,病毒的干扰现象,产生原因 干扰素interferon，IFN 竞争干扰（细胞表面受体、底物、酶） 改变细胞代谢途径 （抑制第二种病毒mRNA的转译）,干扰现象的意义1、非特异性免疫的构成部分抗病毒作用2、指导正确使用疫苗,一、病毒的遗传特点病毒复制周期短，复制过程中变异率高。一般情况下，RNA病毒比DNA病毒更容易变异病毒容易变异，同种甚至同型病毒若从不同人、不同地点分离，仍有一定差异，因此把来自不同人、不同地点的同型病毒称为不同的病毒株甚至在一个宿主体内，同一株病毒在不断复制后可同时存在序列组成不同但有很高同源性的变异病毒群体，称为准种。,病毒的遗传与变异,二、病毒变异的类型,1、突变点突变、缺失突变和插入突变突变株mutant：能稳定地存在，可在相应的宿主或细胞中传代与存活温度敏感突变株（temperature sensitive，ts）：2835可以复制，3740不能复制，如脊髓灰质炎减毒活疫苗,二、病毒变异的类型,2、基因重组（recombination）两种或多种病毒同时感染同一细胞，新合成的病毒核酸分子间相互交换后出现的变异。核酸序列的重新安排发生在一个分子内，即分子内重组，通常见于双链DNA病毒。分节段的RNA病毒之间的基因重组以节段进行交换，称为重配（ reassortment ）。基因重组可以发生于活病毒间，也可以发生于灭活病毒间（多重复活），还可以发生于死、活病毒间（交叉复活）。,二、病毒变异的类型,3、表型重组1）表型混合：两种病毒混合感染时，产生的子代病毒可含有双方衣壳或包膜的特点，但其核酸未改变2）基因型混合：两种病毒的核酸混合装配在同一个病毒衣壳内或两种病毒的核衣壳包在一个包膜内3）表型交换：两种病毒混合感染时，子代病毒中衣壳蛋白可发生完全的互换4）互补：如辅助病毒与缺损病毒间，两个缺损病毒间，活病毒与死病毒间,病毒的抵抗力,一、耐冷怕热二、紫外线敏感，但不宜用紫外线制备灭活病毒疫苗，因其光照后可能复活（光复活作用）。光复活作用：光解酶在黑暗中专一地识别嘧啶二聚体并与之结合，形成酶复合物，当给予光照时，酶利用光能将二聚体拆开，恢复原状，使损伤得到修复。将经紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下时，其存活率大幅度提高，突变率相应降低的现象即光复活作用，是一种酶促反应。 三、包膜病毒对脂溶剂敏感,病毒的抵抗力,四、氧化剂敏感五、酚类敏感六、甘油不敏感（因病毒体不含水分）七、抗生素不敏感,Viral infection and immunity,病毒感染与免疫,感染：病原体侵入宿主体内，进入组织生长繁殖引起 病理改变的过程 免疫：病原体侵入机体后，宿主免疫系统产生抗感染免疫应答的过程,病毒感染的传播方式,一、水平传播,水平传播(horizontal transmission)：人群中不同个体之间的传播，也包括从动物到人的传播，是大多数传染病的传播方式。,一、水平传播,1、通过黏膜表面传播2、 通过皮肤传播 昆虫叮咬乙脑病毒 动物咬伤狂犬病毒3、医源性传播 注射、输血、拔牙乙肝、丙肝,呼吸道流感病毒,消化道甲肝病毒,泌尿生殖道爱滋病毒,眼结膜腺病毒,二、垂直传播,垂直传播(vertical transmission)：从亲代到子代，主要通过胎盘或产道传播，病毒多见。宫内的胚胎或胎儿被感染以及经生殖细胞的基因遗传称为先天性感染（congenital infection）,垂直传播方式及常见微生物,病毒的感染过程,1 侵入：初步增殖2 扩散：经血流或淋巴（最终还要经血流），一般病毒全身性感染要经历两次病毒血症；经神经系统（狂犬病毒及原发感染后定位于神经节的病毒）3 靶器官细胞损伤导致临床疾病4 结局：恢复或死亡5 感染过程中病毒排放：主要经黏膜,病毒感染的致病机制,一、病毒对宿主细胞的直接作用, 细胞水平上致病机理,二、病毒感染的免疫病理损害, 机体水平上致病机理,1、杀细胞效应2、稳定状态感染3、细胞凋亡4、细胞增生与转化,一、病毒对宿主细胞的直接作用,1 杀细胞效应(cytocidal effect) 病毒在靶细胞内复制后，一次释放大量病毒，细胞裂解死亡。主要见于无包膜病毒如脊灰病毒、鼻病毒、腺病毒。 在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经一段时间后，可用显微镜观察到细胞变圆、坏死，从瓶壁脱落等现象，称为致细胞病变作用（cytopathic effect，CPE）。,2 稳定状态感染(steady state infection)病毒进入靶细胞后复制，以出芽方式释放病毒，不引起细胞裂解死亡，但可使靶细胞发生变化，见于有包膜病毒。细胞表面出现病毒基因编码的新抗原：如流感病毒感染的靶细胞表面出现血凝素，能吸附某些动物的红细胞。,2 稳定状态感染(steady state infection)(2)细胞融合：是病毒扩散的方式之一，细胞融合的结果是形成多核巨细胞或合胞体，如麻疹病毒。(3)细胞内出现包涵体,包涵体(inclusion body)某些病毒感染的细胞内，用光学显微镜可观察到与正常细胞结构和着色不同的圆形或椭圆形斑块，称为包涵体。有的在胞质内（痘病毒），有的在胞核内（疱疹病毒），或两者都有（麻疹病毒）。意义病毒感染的鉴别。,细胞质内嗜酸性包涵体（H-E染色）,3 细胞凋亡(cellular apoptosis):腺病毒、HIV等细胞鼓泡、细胞核浓缩DNA降解（电泳：阶梯式DNA条带) 凋亡小体(apoptic body),Kerr 1972年发现， 2002年获诺贝尔奖,4 细胞增生与细胞转化整合（integration）细胞增生(hyperplasia)或转化(transformation)1911年，Rous; Rous sarcoma virus, RSV1966年获诺贝尔奖,( Rous18791970）,某些DNA病毒和逆转录病毒在感染中可将基因整合于宿主细胞基因组中逆转录病毒经逆转录合成cDNA，再合成双链DNA，此双链DNA全部整合于细胞染色体DNA中DNA病毒在复制中，偶然将部分DNA片段随机整合于细胞染色体DNA中两种方式均可能导致细胞转化细胞转化也可由病毒蛋白诱导发生,与人类肿瘤相关的病毒,二、病毒感染的免疫病理作用(机体水平上致病机理),病毒病中常见,1、抗体介导的免疫病理作用 靶细胞+抗体+补体 型超敏反应 Ag+AbAg-Ab沉积型超敏反应2、细胞免疫介导的病理作用型超敏反应3、免疫系统的功能被抑制,若抗原清除，DTH消退；若抗原持续存在，则单核巨噬细胞呈慢性活化，局部出现纤维化和肉芽肿,病毒感染的类型,病毒感染,隐性感染,显性感染,持续性感染,慢性感染,潜伏感染,慢发病毒感染（迟发感染）,急性感染,持续性感染,隐性感染(inapparent infection or subclinical infection)隐性感染虽不出现临床症状，但仍可获得免疫力而终止感染。部分隐性感染者一直不产生免疫力，这种隐性感染者称为病毒携带者，是重要的传染源。,显性感染(apparent infection or clinical infection),急性感染(acute infection)病毒侵入机体后，在靶细胞内增殖，经数日或数周的潜伏期后，由于靶细胞损伤和死亡导致器官损伤和功能障碍而发病。除死亡病例外，患者一般在发病后的一段时间内清除病毒进入恢复期，因此称为病原消灭型感染。病后患者获得牢固性免疫力。,持续性感染(persistent infection)病毒可在体内持续数月至数年，甚至数十年，可出现症状，也可不出现症状而长期带毒如HIV、HBV，成为重要的传染源。,持续性感染,慢性感染(chronic infection):病程长病毒可检出，如HBV潜伏感染(latent infection):可反复激活，急性发作，病毒只有在急性发作时才被检出,如 HSV、VZV HSV机体急性口炎三叉神经节细胞口角疱疹,持续性感染,慢发病毒感染(slow virus infection):病毒感染后增殖缓慢，有很长的潜伏期，症状出现后呈进行性加重，大多数患者在一年内死亡，如HIV、朊病毒感染。较为少见但后果严重。,持续性感染,急性病毒感染的迟发并发症(delayed complication after acute viral infection): 急性感染后一年或数年（通常8-11年），发生致死性病毒病，如亚急性硬化性全脑炎（SSPE）。,慢性感染：,病程长，病毒可检出 如HBV,潜伏感染：,可反复激活，急性发作病毒只有在急性发作时才被检出如 HSV、VZV,慢发病毒感染：,潜伏期长，发病后呈进行性加重直至死亡,如HIV、狂犬病毒及prion,持续性感染,急性病毒感染的迟发并发症如麻疹病毒(SSPE),急性和持续性病毒感染类型比较,抗病毒免疫,一、非特异性免疫,二、特异性免疫,非特异性免疫(non-specific immunity),遗传因素(hereditable factor),屏障作用皮肤屏障,粘膜屏障,胎盘屏障,母体子宫的基蜕膜，另一部分是胎儿的绒毛膜。,血脑屏障,吞噬细胞(phagocyte),血液中单核细胞和组织中巨噬细胞血液中病毒的消除，主要依靠单核细胞。病毒进入巨噬细胞以后命运如何，是被消灭还是继续存活？某些病毒感染中，巨噬细胞的吞饮作用呈现明显的抗感染过程。但在另一些病毒感染中，巨噬细胞却是保护病毒使之不被特异性抗体破坏的窝藏所，甚至是病毒增殖的理想场所。将病毒抗原递呈给T细胞。中性粒细胞对病毒感染无防御作用,NK细胞,病毒感染细胞后，细胞膜发生变化，成为NK细胞识别的靶细胞。其杀伤作用特点：杀伤过程不受MHC限制，也不依赖抗体对靶细胞无特异性杀伤作用出现早；4h部分细胞因子可激活如IFN,干扰素( interferon,IFN ),病毒或其他干扰素诱生剂如LPS、poly I:C等刺激人或动物细胞所产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性的糖蛋白。,干扰素产生机理,操纵基因,结构基因,A:DNA,转录,转录,mRNA,mRNA,翻译,翻译,A阻遏物,干扰素,病毒,A阻遏物与病毒结合失去活性,干扰素种类,抗病毒作用机制,干扰素首先与敏感细胞表面的受体结合，通过信号转导诱导细胞产生抗病毒蛋白 2-5A合成酶和PKR。dsRNA激活2-5A合成酶，使ATP多聚化，形成寡聚2-5A，2-5A再活化RNaseL，RNaseL切断病毒mRNAdsRNA激活PKR，活化PKR使eIF磷酸化，病毒蛋白质翻译受阻,IFN抗病毒作用的特点,间接抗病毒广谱抗病毒抑制病毒而不是杀病毒抗病毒作用具有种属特异性作用迅速（早期中断病毒复制，阻止病毒扩散）,特异性抗病毒免疫,1、体液免疫：2、细胞免疫：,体液免疫的保护作用,1.中和抗体(neutrolizing antibody):IgG、IgM、IgA（SIgA）2.非中和抗体(non- neutrolizing antibody):由病毒内部抗原或表面非中和抗原诱发3.抗体介导对靶细胞的作用:靶细胞+抗体+补体细胞溶解 靶细胞+抗体（ IgG-Fc）-NK细胞、巨噬细胞靶细胞裂解：ADCC or 调理作用,细胞免疫的保护作用,感染细胞内病毒的清除，主要依赖于细胞免疫1. CD4+Th1细胞释放IFN、TNF等，激活 M 和NK；诱发炎症反应；促进CTL增殖和分化2. CTL经TCR识别靶细胞，通过细胞裂解和细胞凋亡两种机制，直接杀伤靶细胞；CTL还可通过分泌IFN、TNF等发挥抗病毒作用,抗病毒免疫持续时间,终身免疫有明显病毒血症全身感染抗原性单一稳定,短暂免疫无明显病毒血症局部感染抗原性多变,病毒感染的检查方法和防治原则,病毒感染的检查方法一、标本采集与送检二、病毒的分离培养与鉴定三、病毒感染的快速诊断,一、标本采集与送检标本采集： 急性期；不同病毒取不同标本标本处理： 无菌操作；杂菌标本+抗生素冷藏速送：血清学标本： 取双份血清（早期和恢复期冷藏-20），效价升高4倍有诊断价值,常见分离病毒标本的选择,二、病毒的分离培养与鉴定,病毒的分离培养 动物接种（Animals） 鸡胚培养（Embryonated eggs）,细胞培养（cell culture）,尿囊腔接种,羊膜腔接种,流感病毒,流感病毒,尿液,羊水,血凝及血凝抑制试验 鉴定病毒,流感病毒+红细胞 血凝,流感病毒+特异抗体 血凝被抑制,初次,再次,常用的细胞培养,常用于病毒分离的细胞,1.细胞培养的结果观察病毒增殖后导致细胞发生细胞病变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等。,病毒的鉴定,正常细胞,CPE,狂犬病毒包涵体（Negri body）,巨细胞病毒包涵体,2.红细胞吸附某些包膜病毒（如流感病毒或某些副流感病毒）感染单层细胞培养，虽不产生明显的，但它们在受染细胞内复制时所合成的血凝素蛋白，可插入受染细胞膜中，从而使受染细胞获得吸附红细胞的能力。此现象常用以检测具有血凝素的包膜病毒的存在。,病毒的鉴定,3.中和试验如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应或红细胞吸附，则该病毒为特异性抗体的同型病毒。4.干扰现象,病毒的鉴定,病毒数量和感染性测定,1、蚀斑试验 将病毒悬液稀释后加入细胞培养，待病毒吸附至细胞后，覆盖一层融化的琼脂。病毒在细胞内增殖产生细胞病变，由于琼脂限制病毒的扩散作用，形成肉眼可见的局限性病灶，即蚀斑。一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖后形成的，称蚀斑形成单位（plaque forming unit,PFU）。常用中性红将活细胞染色，留下未染上颜色的蚀斑，则结果更为明确。病毒悬液中的感染性病毒量以PFU/毫升来表示。,病毒数量和感染性测定,2、ID50 或 TCID50 病毒感染鸡胚、动物或组织细胞后，引起 50% 发生死亡或病变的最小量。,三、病毒感染的快速诊断,1、形态学检查2、检查病毒性抗原3、检查病毒抗体4、病毒核酸的检测,光镜大病毒、包涵体 电镜直接电镜、免疫电镜,免疫标记技术荧光素、放射性核素、酶,ELISAIgM,核酸杂交技术 Southern、Nouthern PCR,光镜检查法 观察病毒感染细胞出现的包涵体，根据特点可作出辅助诊断。狂犬病病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体。巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体。,形态学检查,电镜检查法 电镜直接检查：适于检查含高浓度病毒的标本。如“秋季泻”患儿粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液，HBV患者血清，均可观察到特征性病毒颗粒。,形态学检查,电镜检查法 免疫电镜检查：在标本中加入抗体，使病毒聚集成块，更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍。,形态学检查,免疫荧光法可快速检测难以培养的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等适合检测肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测,检查病毒性抗原,ELISA 适合测定标本中游离的抗原。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗原等。,检查病毒性抗原,血凝抑制试验 用于流感、副流感和流行性乙型脑炎，因这些病毒可凝集动物红细胞，加入相应抗体后可抑制血细胞凝集现象中和试验 用于人群免疫水平的调查补体结合试验酶联免疫吸附试验,检查病毒抗体,常用的血清学试验,原位杂交,检测病毒核酸,聚合酶链反应（）,选择病毒的特异保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。选择病毒的易变区，结合RFLP、测序等技术可以对病毒进行分型和突变的研究。,Southern blot,Southern印迹法用于DNA的杂交。提取D