抗体工程要点.ppt

抗体工程 抗原的来源 生物组织纯化蛋白的纯化方法 1 离子交换2 凝胶过滤3 亲和层析4 输水作用层析等 抗原的来源 人工合成 化学方法 1 半抗原的合成2 抗原多肽的合成 多肽合成仪 抗原的来源 蛋白的重组表达1 原核细胞的表达方法 大肠杆菌 枯草杆菌 2 酵母细胞的真核表达方法 甲醇毕赤酵母的重组表达 3 昆虫细胞的表达 杆状病毒表达载体 4 哺乳动物细胞的表达 CHO HEK293 5 抗原的单独表达和融合表达 6 表达标签 TAG Fc标签 HIS标签 FLAG标签 DYKDDDDK C MYC标签 GST标签等 原核表达系统 质粒 1 多克隆位点 MCS 2 抗性基因3 启动子 P 4 复制起始位点 Ori 原核细胞的表达 操纵子表达模型与启动子 酵母真核细胞表达系统 酵母表达系统的优缺点 操作简便 表达量高 培养条件简单 易于纯化 N 端可能会有氨基酸缺失 存在过量糖基化的可能 昆虫杆状病毒表达系统 哺乳动物细胞表达系统 稳定表达细胞系 CHO细胞瞬时表达细胞系 293细胞载体 原核载体骨架真核启动子增强子多克隆位点PolyA信号真核细胞筛选标志加压筛选基因 哺乳动物细胞表达系统的特点 可以分泌表达 活性高 纯化步骤可能比较复杂 糖基化比较正常 成本较高 表达量偏低 周期较长 可以建立无血清培养的方法 第三章抗体分子的结构和分类 CDR区 互补决定区FR区 框架区重链分子量 450 550个氨基酸残基构成 45 70kd轻链分子量 大约214个氨基酸残基构成 22 24kd 抗体分子片段 抗体分子的分类 IgA和IgM的J链 IgA的分泌片IgG 1 2 3 4 bacteria Ab antigenaggregatesareingestedbyphagocyticcells Whatcanantibodiesdo Xenotransplantation Autoimmunodiseases 特殊的抗体分子 卵黄抗体IgY 由两条重链 H 和轻链 L 组成 重链 由一个可变区 V 和4个恒定区 C 组成 没有铰链结构 完整分子量为180KDa 7 8S 重链为67 70KDa 轻链为25KDa 但还存在一个小体积副本 120KDa 5 7S 发现于野鸭和某些龟类中 克隆IgYH链表明 较小的IgYH链缺乏C3 C4区 称为IgY Fc 单域抗体 特点 1 见于驼类动物 软骨鱼类2 没有轻链多肽 3 CDR3区较长 4 驼类单域抗体没有CH1 5 去除Fc片段后称为纳米抗体 抗体的生物学功能 特异性的结合抗原激活补体结合Fc受体1 调理吞噬作用 巨噬细胞 2 介导过敏反应 肥大细胞 3 ADCC作用 NK细胞 单核细胞 4 穿过胎盘和粘膜5 免疫调节 抗体的来源 抗体的定义抗体的发现 1888年EmileRoux和AlexanderYersin发现了白喉毒素 1890年VonBehring发现 白喉毒素或者破伤风毒素免疫动物后 血液中可以产生阻止毒素诱发疾病的物质 称为抗毒素 antitoxin 电泳分析gamma球蛋白 并不全是抗体 1972年世界卫生组织和国际免疫学联合会把具有抗体活性及化学结构与抗体类似的一类球蛋白 统一命名为免疫球蛋白 immunoglobulin 人血清球蛋白的电泳图谱 白蛋白a1a2bg 白蛋白a1a2bg 抗体生成的理论 1897年 PaulEhrlich提出了侧链学说 他认为细胞表面有特异性受体分子 可以释放的血液里面 就是抗毒素 抗体 1930年 Breinl和Haurowitz提出模板学说 认为抗原是抗体合成的模板 1955年 Jerne提出天然抗体选择学说 抗原抗体的复合物刺激细胞产生更多针对该抗原的抗体 1958年 Macfarlane Burnet DavidTalmadge和Joshua提出了克隆选择学说 每一个产生抗体的细胞克隆 B细胞 只能产生一种抗体 抗原与B细胞表面的膜型抗体分子结合 刺激B细胞的增殖分化 浆细胞 生产更多的抗体 Clonalselectiontheory 细胞凋亡 apoptosis Caspase 细胞自噬 autophagy 溶酶体 人体内可以产生10E12以上不同的抗体分子 为什么 第四章抗体的基因及其表达 抗体重链基因簇 IgH 14号染色体 1 5Mb抗体轻链Kappa基因簇 IgK 2号染色体 800kb 抗体轻链Lamda基因簇 IgL 22号染色体 700kb 抗体重链的基因及其表达 V基因 51个J基因 6个D基因 27个C基因 10个 RNAalternativesplicing 轻链的基因与重排 V基因 30个J基因 4个C基因 4个V基因 40个J基因 5个C基因 1个 抗体基因重排的机制 RSS rearrangementsignalsequence重排信号序列12 23规则RAG recombinationactivatinggeneRAG1和RAG2异源二聚体TdT terminaldeoxynucleotidyltransferase末端脱氧核苷酸转移酶 抗体类别的转换 S区介导的二次重排 switchingregion 除了Cd外 其它C基因前都有S区序列 抗体多样性的原因 多种不同的基因片段 不同重链和轻链的随机取用和组合 VDJ基因片段重组时连接的多样性 连接区的核苷酸插入 体细胞的高突变频率 抗原与抗体的相互作用 6个CDR区 非共价结合抗原 空间可变结构的结合 作用特点 特异性可逆性有量效关系 抗体的制备 多克隆抗体 抗血清血清与血浆抗体的滴度单克隆抗体 由单一细胞克隆分泌的 识别同一个抗原决定簇 结构与功能都完全相同的抗体 基因工程抗体 通过基因工程方法生产或者改造过的抗体分子 一般采用工程细胞进行表达 免疫血清的制备方法 免疫血清的要求 效价高 特异性强 抗原的纯度免疫佐剂抗原的分类 颗粒型 可溶胶体 抗原和半抗原 40kd 半抗原6000以下 抗原的纯化方法 层析 电泳 半抗原与载体蛋白的偶联 常用的载体蛋白 BSA OVA KLH偶联机制 1 形成酰胺键2 氨基间形成连接桥 NH R NH 3 形成偶氮键 N N 如酪氨酰 组氨酰 赖氨酰残基间 4 对于没有羰基和氨基的半抗原 引入连接基 spacer 再与蛋白偶联 甲醛等 佐剂的使用 氢氧化铝佐剂 适合人用疫苗 明矾佐剂石蜡油 羊毛脂等 抗原的乳化方法 1 研磨法2 注射器乳化法3 超声乳化4 复合乳剂 增加2 的Tween 20生理盐水 机械或者超声乳化 动物的免疫 需要考虑动物种系 抗原剂量 免疫途径 加强免疫的时间 免疫次数和佐剂的使用 用于免疫的动物 兔 大鼠 小鼠 豚鼠 绵羊 山羊 鸡 山羊 马 驴 猴等 1 抗原与动物种属的关系2 动物的生理状态3 血清的用量抗原的用量 兔0 5 1mg kg体重 小鼠 10 100ug 免疫途径 静脉 脾脏 淋巴结 腹腔 肌肉 皮下 皮内 加强免疫 boost 每隔2 3周免疫1次 2 3次后 1周后检测血清中的抗体滴度 然后可以放血 制备抗体 免疫方案 皮下多点注射 第1次福氏完全佐剂 后面福氏不完全佐剂 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分 福氏完全佐剂的制备 使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌 抗体在动物血清中的表达水平 多克隆抗体的制备和保存 动物的放血 心脏取血 耳缘静脉采血 兔 尾尖取血 眼底取血 小鼠 大鼠 颈静脉取血 大型动物 羊 羊驼 处死动物取血的方法 颈动脉取血 摘眼球取血 血清的分离 冰箱放置过夜 3000rpm 30min 吸取血清 加入叠氮钠或者硫柳汞防腐剂 20或者 80度长期保存 多克隆抗体的粗提 辛酸饱和硫酸铵沉淀法 将待提取样品用60mmol L pH4 0醋酸缓冲液稀释3 4倍 调pH至4 5 对含脂质较高的标本可采用二氧化硅粉或玻璃纤维吸附法除去脂质 在室温下边搅拌边缓慢加入正辛酸 按每ml样品中加25 l 若样品体积小于5ml 则每ml样品内加入30 l正辛酸 搅拌30min 10000 g离心30min 取上清液通过定性滤纸过滤 装人透析袋 用20倍体积的PBS 4 透析过液 中间换液3 4次 然后每毫升混合液加0 27g硫酸铵 搅拌30min 以5000g离心15min 收集沉淀物 溶于少量PBS中 再以15000 g离心20min 上清液即为提取的Ig 其中大部分为IgG 约占90 少量为IgA及IgM 回收率 80 整个操作可在24h内完成 DEAE纤维素精制多克隆抗体 蛋白标本对0 005mol L pH8 6Tris PO4透析 DE52装柱 并以0 005mol L pH8 6Tris PO4平衡 加样 以0 005mol L pH8 6Tris PO4洗脱 紫外监测直至洗脱液280nmOD回到基线 这一步骤可除去血清中其他蛋白 以350ml 0 055mol L pH6 0Tris PO4洗脱 这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM 以125ml 0 055mol L pH6 0Tris PO4和125ml0 5mol L pH5 1Tris PO4梯度洗脱 总量收集250ml 重复步骤 5 根据280nm峰值合并蛋白峰 对PBS透析 PEG浓缩 20度保存 蛋白质纯化系统 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的定义 序列 结构 功能 抗原结合性质都完全相同的抗体 来源 杂交瘤细胞表面展示抗体文库单一B细胞 单克隆抗体来源的图示 骨髓瘤细胞SP2 0 1 HGPRT基因缺陷2 TK基因缺陷3 不分泌抗体 细胞融合的方法 病毒介导的细胞融合PEG介导的细胞融合电融合 HAT培养基在杂交瘤细胞筛选中的作用 HAT选择培养基的作用是筛选出 杂交瘤细胞 HAT选择培养基含有次黄嘌呤 氨基喋呤和胸腺嘧啶 其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径 主要途径阻断后 依靠应急途径即在HGPRT 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 和TK 胸苷激酶 作用下 利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA 缺少其中一种 DNA合成不能发生 用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞 细胞内均无TK或HGPRT 所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡 B细胞虽然有HGPRT和TK 但在体外通常培养条件下 尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代 因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖 单克隆的筛选 液体有限稀释法 细胞计数 半固体培养基法 单克隆抗体的鉴定 ELISA方法的原理 包被抗原加入培养基酶标二抗 小鼠单克隆抗体的制备 杂交瘤细胞的体外培养 RPMI1640培养基产量较低 条件要求比较严格 可以放大 小鼠腹水的生产方法 1 腹腔接种降植烷或液体石蜡 每只小鼠0 3 0 5ml 2 7 10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞 每只小鼠5 105 0 2ml 3 间隔5天后 每天观察小鼠腹水产生情况 如腹部明显膨大 以手触摸时 皮肤有紧张感 即可用16号针头采集腹水 一般可连续采2 3次 通常每只小鼠可采5 10ml腹水 4 将腹水离心 2000r min5分钟 除去细胞成分和其他的沉淀物 收集上清 测定抗体效价 分装 70 冻存备用 或冻干保存 噬菌体抗体库Surfacedisplayantibodylibrary 噬菌体展示库Phagedisplaylibrary M13噬菌体的组装 M13噬菌体抗体展示载体 重链和轻链在大肠杆菌膜周质组装成Fab 酵母展示技术Yeastdisplaylibrary 筛选方法 FACS 核糖体展示文库Ribosomedisplaylibrary 抗体文库筛选的优缺点 优点 周期短 成本低缺点 抗体库的容量有限 亲和力低 需要体外突变以提高抗体的亲和力 invitromaturation 可能引入新的免疫原性 单一B细胞筛选的方法 B细胞筛选的优缺点 优点 来源于人体 免疫原性最低 缺点 来源有限 可能只适用于一些传染性疾病抗体的筛选 对于自身免疫病和肿瘤相关的抗原筛选比较困难 转基因小鼠筛选全人单克隆抗体 小鼠内源基因的敲除 knockout EScell Chimericmouse EScellsinmedium Homologousrecombination Blastcystmicroinjection 抗体的标记技术 同位素标记酶标记 碱性磷酸酶 AP 辣根过氧化物酶 HRP 荧光素标记 FITC 罗丹明 quantumdot 量子点 AlexaFlor488 650nm 生物素标记 biotin avidin strepavidin 链亲和素 胶体金标记技术 氯金酸 柠檬酸还原 抗体的应用 检测 RIAEIAELISA免疫荧光免疫组化 EIA和ELISA 抗原或抗体的检测 竞争性EIA 胶体金试纸条 定性检测 电化学发光检测 ECILA 是利用电化学发光剂标记的抗原或抗体与待测物经过一系列的免疫反应和洗涤等理化步骤 最后用光学仪器测量免疫反应前后电化学发光信号强度的改变 从而对抗原或抗体物质进行定量分析的一种方法 当反应体系中加入电子供体三丙胺后 在电场作用下 钌分子和三丙胺在电极表面分别被氧化成三价钌和带阳离子的自由基三丙胺 后者很不稳定 迅速失去一个质子形成强还原剂自由基三丙胺 将三价钌分子还原成激发态的二价钌 其自身则被氧化成二丙胺和丙醛 接着激发态的钌分子衰减成基态钌分子 同时放出一个波长为 的光子 这一过程在电极表面以每毫秒几十万次的速度循环进行 产生的光子经光电倍增管检测光强度 从而测出待检抗体或抗原的含量 免疫 PCR PCR免疫检测方法 噬菌体免疫PCR 组织切片与免疫组化 荧光 冷冻切片 石蜡切片1 取材2 固定3 水洗4 脱水包埋5 切片6 展片7 捞片8 铺片9 染色10 封片11 观察 FACS florescenceactivatedcellsorting MACS magneticactivatedcellsorting 蛋白质芯片的原理与检测 1 二抗检测 显色 荧光或发光 2 质谱检测 不同水平的基因表达调控 microRNA Alternativesplicing Histoneacetylationandmethylation DNAmethylation 1 Phosphorylation2 Glycolysation3 ubiquitination 免疫共沉淀 Co IP Ch IP 染色体免疫共沉淀 Westernblot 抗体药物 治疗领域 传染性疾病 埃博拉病毒自身免疫性疾病 类风湿性关节炎肿瘤 乳腺癌 胃癌 结肠癌作用机理 1 ADCC作用杀死肿瘤细胞2 CDC作用3 阻断肿瘤细胞内的血管新生4 阻断肿瘤生长的信号通路5 解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制作用代谢性疾病 骨质疏松 糖尿病 抗病毒作用 自身免疫性疾病 肿瘤的治疗 ADCC作用 肿瘤治疗 CDC效应 肿瘤的血管新生 肿瘤自分泌生长因子 肿瘤的免疫检查点 代谢性疾病的治疗 抗体药物的研发 选择疾病类型选择相关的抗原选择研发的方向 仿制药 创新药 选择抗体的来源 鼠源 人源 选择抗体的表达方式 酵母 CHO 转基因植物 藻类细胞 人源细胞 选择生产的工艺 不锈钢 一次性袋子 选择细胞培养的工艺 灌流 流加 发酵罐 WAVE 细胞培养的方式 灌流 流加 抗体的纯化 抗体仿制药的研发 文献的调研 化合物专利 纯化专利 制剂专利 组合物专利等 原研药的鉴定 氨基酸序列 原研药的采购 蛋白质的N 端测序 Edman化学降解 其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N 端残基的偶联 苯氨基硫甲酰酞 PTC 肽 环化裂解 和噻唑呤酮苯氨 ATZ 转化为苯异硫尿氨基酸 PTH 氨基酸 三个主要的化学步骤 每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基 同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个Edman降解 最后通过转移的PTH 氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定 高表达细胞株的构建 cellpool 高表达细胞株的构建 单克隆的筛选 抗体编码DNA序列的优化原则 GC含量密码子使用偏性随机性RNA的二级结构终止密码子的选择 双终止密码子 DNA的人工合成与序列分析 人基因组DNA的GC含量 40 抗体分子DNA序列的优化 密码子偏性 抗体DNA序列的优化 RNA二级结构 表达载体的构建 GCCACCATGG Kozaktranslationinitiationsequence 信号肽的选择 抗体的分泌步骤 CHO细胞的DNA转染 1 阳离子脂质体转染方法 2 电转法 CHO细胞培养 CD培养基的主要成分 Theconstituentsofachemicallydefinedmediainclude abasalmedia suchasDMEM F12 orRPMI1640 containingaminoacids vitamins inorganicsalts buffers antioxidantsandenergysources whichissupplementedwithrecombinantalbumin chemicallydefinedlipids recombinantinsulinand orzinc recombinanttransferrinoriron seleniumandanantioxidantthiolsuchas2 mercaptoethanolor1 thioglycerol 氨基酸 氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位 不同种类的细胞对氨基酸的要求各异 但有几种氨基酸细胞自身不能合成 必须依靠培养液提供 这几种氨基酸称为必需氨基酸 其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸 在缺少谷氨酰胺时 细胞生长不良而死亡 因此 各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺 但是 由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定 应置于 20 冰箱中保存 在使用前加入培养液内 已含谷氨酰胺的培养液在4 冰箱中储存2周以上时 还应重新加入原来量的谷氨酰胺 碳水化合物和无机盐 碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源 其中有的是合成蛋白质和核酸的成分 主要有葡萄糖 核糖 脱氧核糖 丙酮酸钠和醋酸等 无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡 此外 通过提供钠 钾和钙离子 帮助细胞调节细胞膜功能 培养液的渗透压是一个非常重要的因素 细胞通常可耐受260mOsm kg 320mOsm kg 标准培养液的渗透压在此范围内波动 特别注意 向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压 特别是溶于强酸或强碱中的物质 向培养液中添加HEPES时需调节钠离子浓度 缓冲系统和维生素 缓冲系统大多数细胞所需pH在7 2 7 4 但是 细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同 成纤维细胞喜欢较高pH 7 4 7 7 而传代转化细胞系则需要偏酸pH 7 0 7 4 由于多数培养液靠碳酸氢钠 NaHCO3 与CO2体系进行缓冲 因此 气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡 如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5 培养液中NaHCO3的加入量为1 97g L 如果CO2浓度维持在10 培养液中NaHCO3的加入量为3 95g L 细胞培养瓶盖不应拧得太紧 以保证气体交换 HEPES是一种非离子缓冲液 在pH7 2 7 4范围内具有较好的缓冲能力 但是非常昂贵 在高浓度时对一些细胞可能有毒 HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠 0 34g L 共用 以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加 在这种培养条件下 细胞培养瓶的盖子应拧紧 以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中 大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂 酸性培养液呈橙黄色 碱性培养液呈深红色 维生素在细胞培养中 尽管血清是维生素重要来源 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长 CHO细胞的培养工艺优化 培养工艺的放大 温度 搅拌转速 PH 溶氧 泡沫和液面水平 培养工艺优化和放大的DOE软件 培养基成分的优化 氨基酸成分分析 全自动生化分析仪 培养基的澄清过滤 碟片式离心机 1 进料 2 排出口 轻相 3 向心泵 4 碟片 5 储渣空间 6 排渣口 7 排渣活塞阀 8 离心捕集器 9 排出口 重相 10 喷嘴 11 计量注水 开启水 12 定时器 在离心工艺开发过程中 有很多参数需要优化 如补料的速度 离心机转速 滤饼层的去除频率等 这些参数会影响到细胞的稳定性 处理的时间以及抗体收率等 可用通过优化这些参数合理地使各种诉求达到平衡 切向流过滤 切向流过滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式 传统的液体死端过滤 deadend 是大部分微孔过滤 MF 微滤 包括除菌过滤所采用的过滤形式 其液体的流动方向与过滤方向一致 随着过滤的进行 过滤膜表面形成的滤饼层或凝胶层厚度逐渐增大 流速逐渐降低 只能处理小体积的料液 对于较大规模的料液过滤时 就需要采用切向流过滤方式 液体流动在过滤介质表面产生剪切力 减小了滤饼层或凝胶层的堆积 保证了稳定的过滤速度 切向流微滤系统主要应用于生物工程领域下游处理 如取代离心机从发酵液中收集细胞及去除细胞碎片等 特别是赛多利斯的切向流MF系统因其能够整体在位蒸汽灭菌 还可以应用于动物细胞连续培养的无菌换液以及提高菌体分泌物表达收率 在培养过程中无菌条件下的连续换液 抗体的纯化 蛋白A亲和层析阴离子交换树脂阳离子交换树脂除菌过滤去病毒 低pH值 纳滤 抗体原液 抗体的质量分析 ProteinConcentration 70 9mg mL 63 0 77 0 Potency 100 80 125 ID immunoassay PassSE HLC MP 99 8 HMW 0 2 LMW 0 0 MP 99 CE SDS reduced HC LC 98 9 HC 66 8 LC 32 1 LC HC 98 CEX HPLC MP 89 6 Acidic 2 7 Basic 7 7 80 CEX HPLCID PassOsmolality 314mOsm kg 300 50 pH 5 2at24 6 C 5 0 5 4 Appearance ReportVolume 1 2mL average1 1525mL n 5 1mL Sub visibleParticulate 29particles container 10 m nomorethan6000 particles container 25 m nomorethan600 Sterility PassBacterialEndotoxin 0 2EU mL 5 0 CHOPELISA 4 4ppmProtein AELISA 0 5ppm 抗体的糖基化检测 利用毛细管电泳和质谱 CEMS 对重组单克隆抗体 mAb 糖基化进行分析 此方法包括利用N 糖苷酶F PNGaseF 酶解mAb得到多糖 对多糖进行荧光标记 8 氨基吡 1 3 6 三磺酸三钠盐 ATPS 并利用CE串联精确质量Q TOFLC MS进行分析 抗体糖基化的MS检测结果 抗体质量分析相关的指导原则 1 cde 人用单克隆抗体质量控制技术指导原则2003 2 EP7 monoclonalantibodyforhumanuse 3 ICHQ6B 测试方法和接受标准 生物技术和生物药品 4 FDA AssayDevelopmentforImmunogenicityTestingofTherapeuticProteins 5 FDA PointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse 抗体的生物学活性检测 分子水平的活性鉴定细胞水平的活性鉴定动物水平的活性鉴定 诱导 移植 基因修饰 阻断活性杀伤肿瘤细胞活性 自发瘤 肿瘤细胞株 移植瘤 激活免疫细胞活性 原代培养的免疫细胞 白血病细胞株 THP 1 Jurkat细胞等 实验动物疾病模型 抗体的制剂研究 冻干制剂液体制剂高浓度液体制剂 抗体制剂的辅料 药用辅料是指在制剂处方设计时 为解决制剂的成型性 有效性 稳定性 安全性加入处方中除主药以外的一切药用物料的统称 药物制剂处方设计过程实质是依据药物特性与剂型要求 筛选与应用药用辅料的过程 药用辅料是药物制剂的基础材料和重要组成部分 是保证药物制剂生产和发展的物质基础 在制剂剂型和生产中起着关键的作用 它不仅赋予药物一定剂型 而且与提高药物的疗效 降低不良反应有很大的关系 其质量可靠性和多样性是保证剂型和制剂先进性的基础 辅料在制剂中作用分类有66种 抗体制剂的辅料 海藻糖或蔗糖 冻干保护 磷酸盐或者柠檬酸盐缓冲系统Tween 20 助溶 组氨酸 保护剂 冷链运输的问题 抗体制剂的稳定性分析 ProteinConcentration 70 9mg mL 63 0 77 0 Potency 100 80 125 molecularandcelllevelsSE HLC MP 99 8 HMW 0 2 LMW 0 0 MP 99 CE SDS reduced HC LC 98 9 HC 66 8 LC 32 1 LC HC 98 CEX HPLC MP 89 6 Acidic 2 7 Basic 7 7 80 Osmolality 314mOsm kg 300 50 pH GlycolyzationAppearance ReportVolume 1 2mL average1 1525mL n 5 1mL Sub visibleParticulate 29particles container 10 m nomorethan6000 particles container 25 m nomorethan600 Sterility PassBacterialEndotoxin 0 2EU mL 5 0 aggregationContainerandstopperAccelerativestabilitytestLongtermstabilitytestImpuritytest 抗体的免疫治疗方法概览 免疫脂质体 双功能抗体和多功能抗体 Antibodydrugconjugation ADC 第一代ADC 随机偶联第二代ADC 定位整合Ambrx公司 稀有氨基酸掺入RedwoodBiosciences 延长多肽链 偶联药物半胱氨酸偶联 肿瘤的转移和浸润 Probody技术 抗EGFR抗体治疗的副作用 CAR T治疗急性淋巴细胞白血病 CAR T的定义 ArtificialTcellreceptors alsoknownaschimericTcellreceptors chimericimmunoreceptors chimericantigenreceptors CARs areengineeredreceptors whichgraftanarbitraryspecificityontoanimmuneeffectorcell Typically thesereceptorsareusedtograftthespecificityofamonoclonalantibodyontoaTcell withtransferoftheircodingsequencefacilitatedbyretroviralvectorsorlentivirusvectors Thereceptorsarecalledchimericbecausetheyarecomposedofpartsfromdifferentsources CAR T的技术原理 CAR T治疗技术的发展 CAR T治疗的临床研究 ALL treatedwithalfaCD19 CD3zetaCARs modifiedTcells Bcelllymphoma treatedwithalfaCD20 CD3zetaCARs modifiedTcell neuroblastomapatients treatedwithScFv CD3zetaCARs modifiedTcell CAR T治疗的优缺点 HLA independentrecognitionofantigen broadapplicabilityformanypatientsandtherapiddeliveryofCAR modifiedTcells SuccessfulapplicationofthesemodifiedTcellswillrequiretheidentificationofthetumor associatedantigen thatareexpressedonlyontumorcells therebyminimizingtheriskoftoxicity significantreleaseofpro inflammatorycytokines pulmonarytoxicity multi organfailureandeventualdeathofthepatient Socalled cytokinestorm unlikeantibodiesagainsttumor associatedantigens thesecellsarenotclearedfromthebodyquickly 抗体药物的临床申报 临床前研究 i 临床前研究 1 药物靶点的确认 这个是所有工作的开始 只有确定了靶点 后续所有的工作才有展开的依据 2 化合物的合成 这个阶段的工作主要负责新化合物的合成 现有化合物的结构改造和优化 或者抗体的筛选 3 活性化合物的筛选不是所有合成出来的化合物或者抗体都能有理想的活性 在这个阶段需要通过生物实验手段筛选出初步有活性的化合物用作备选 这些化合物叫先导化合物 lead 得到的活性数据可以结合化合物结构得到初步的构效关系分析 构效关系可以有效的指导后续的化合物结构优化 这一步工作主要在细胞实验层面展开 4 评估药物的药理作用 安全性与毒性 药物的吸收 分布 代谢和排泄情况 ADME 这部分的实验需要在动物层面展开 细胞实验的结果和活体动物实验的结果有时候会有很大的差异 这一步的目的是确定药物的有效性与安全性 GLP中心 5 制剂的开发 制剂后药物的吸收 分布 代谢和排泄情况 制剂的稳定性试验 分析数据 6 连续三批生产的药品 申报文件的准备 抗体药物的申报 I期临床试验 在新药开发过程中 将新药第一次用于人体以研究新药的性质的试验 称之为 期临床试验 即在严格控制的条件下 给少量试验药物于少数经过谨慎选择和筛选出的健康志愿者 对肿瘤药物而言通常为肿瘤病人 然后仔细监测药物的血液浓度 排泄性质和任何有益反应或不良作用 以评价药物在人体内的性质 期临床试验通常要求健康志愿者住院以进行24小时的密切监护 随着对新药的安全性了解的增加 给药的剂量可逐渐提高 并可以多剂量给药 通过 期临床试验 还可以得到一些药物最高和最低剂量的信息 以便确定将来在病人身上使用的合适剂量 可见 期临床试验是初步的临床药理学及人体安全性评价试验 目的在于观测人体对新药的耐受程度和药代动力学 为制定给药方案提供依据 抗体药物的申报 II期临床试验 通过 期临床研究 在健康人身上得到了为达到合理的血药浓度所需要的药品的剂理的信息 即药代动力学数据 但是 通常在健康的人体上是不可能证实药品的治疗作用的 在临床研究的第二阶段即 期临床试验 将给药于少数病人志愿者 然后重新评价药物的药代动力学和排泄情况 这是因为药物在患病状态的人体内的作用方式常常是不同的 对那些影响肠 胃 肝