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第三章灭活剂 保护剂 与免疫增强剂 第一节灭活剂一 灭活与灭活剂 一 灭活 杀死病原微生物 但不影响免疫原性 其次是破坏血清的补体 以免干扰血清学反应结果 灭活剂 灭活微生物的化学试剂 灭活方法 物理灭活 加热 超声波及射线灭活微生物 此方法免疫原性易破坏 现很少使用 血清56 C半小时灭活补体用此方法 化学灭活 用化学试剂将病原微生物杀死 此方法经常使用 二 常用的灭活剂种类和原理 一 甲醛 是最古老常用的灭活剂 现在我国用的26种灭活疫苗 均以甲醛为灭活剂 性质 甲醛为刺鼻的气体 水溶液叫福尔马林 浓度为36 40 10 C以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛 为白色沉淀 原理 甲醛的醛基起灭活作用 可使蛋白质的氨基 羟甲基胺羧基 亚甲基二醇单酯羟基 羟甲基酚巯基 硫代亚甲基二醇 浓度 需氧菌甲醛浓度到0 1 0 2 厌氧菌0 4 0 8 病毒0 05 0 4 原则是浓度低 时间短 温度低可以灭活细菌 尽量减少破坏抗原 通常加入量 以甲醛含量量计算 折合福尔马林浓度 二 烷化剂 将烷基引入 形成烷基取代物 使微生物变性死亡 原理 主要破坏病毒的核酸 作用于A G碱基 引起DNA单链断裂或双链铰连 此类常用于病毒灭活 种类有AEI N 乙酰乙烯亚胺 加入浓度到0 05 BEI 二乙烯亚胺 浓度0 02 EEI 2 乙基乙烯亚胺 GDA 缩水甘油醛 灭活后加硫代硫酸钠可终止灭活 防止抗原损失 保存 AEI 0 4 C一年 20 C二年 BEI0 4 C保存一个月 三 苯酚 石碳酸 人类用的第一个消毒药 具有特殊气味的无色结晶 易潮解成水溶液 与光 氧后颜色变紫色 原理 蛋白质变性以及抑制氧化脱氢酶 芽孢和病毒对它抵抗力强 灭活浓度 抑菌作用是0 2 0 5 血清防腐 杀菌是1 杀葡萄球菌是3 消毒常用它的衍生物 来苏儿 甲酚皂 3 5 浓度 特殊气味 覆盖其他气味 也是医院常用的 JosephLister 1827 1912 首创用石炭酸喷洒手术室和煮沸手术用具以防术后感染 为防腐 消毒 以及无菌操作奠定了基础 四 结晶紫 龙胆紫 也叫紫药水 碱性染料 也叫甲紫或甲基青莲 化学名 六甲基副玫瑰苯胺 原理 碱性阳离子可结合细菌阴离子羧基 干扰细胞壁粘肽合成 常作用于革兰氏阳性菌 生物制品的应用有猪瘟结晶紫疫苗 鸡白痢染色抗原 五 丙酰内酯良好病毒灭活剂 性状是无色有气味液体 易潮解和高温失效 5 C密封保存好 现主要用于狂犬灭活苗 另还有防治细菌霉菌生长的防腐剂 硫柳汞 乙基汞硫代水杨酸钠 叠氮钠 NaN3 它们使用浓度0 01 0 02 可防止血清腐败 三 影响灭活作用的因素 一 药物的特异性 酚类不能杀灭真菌和病毒 阳离子的结晶紫 主要作用于G 菌 二 微生物的种类和特异性 G 菌和G 菌对药物敏感不一样 繁殖体和芽孢对药物敏感也不一样 三 药物浓度 浓度愈大 灭活越快 抗原也损失大 但是 95 酒精没75 酒精杀灭细菌好 四 温度 温度与灭活成正比 每升高10度 金属类杀菌作用增加2 5倍 但高温超过40 C 抗原也损失大 五 时间 灭活时间与温度和浓度成反比 即灭活杀菌长 温度旧低 浓度也低 就可以杀灭细菌 六 pH 碱性快 酸性慢 酸性环境对抗原保护好 七 有机物存在 环境的有机物减低灭活的效果 微生物也是有机物 四 灭活疫苗时的注意事项 2人参加灭活 注意药品名和量 灭活后标记 37 C灭活一天后 接种适宜培养基 无菌检查 动物试验 灭活苗制成后 注射小白鼠0 2ml 两只 观察3天 使用试验 用户可先注射1 2头 观察1 2天 看有无过敏 应激等反应 证明安全 才全群使用 思考题 什么叫灭活和灭火剂 灭活剂的种类有哪些 影响灭活的因素是什么 灭活的注意事项有哪些 第二节保护剂 保护剂也叫稳定剂 是防止微生物在冻干过程中受到破坏 按作用原理分两类 渗透剂 能渗入细胞 使胞内外渗透压平衡 防止慢冻时损伤细胞 有甘油 蔗糖 二甲基亚砜 非渗透剂 防止细胞内外物质交换在速冻时保护细胞 有蛋白质 聚乙烯吡咯酮 按保护剂分子量分类 低分子量保护剂 糖 氨基酸类 高分子量保护剂 脱脂牛奶 明胶 按化学性质分类 复合物 脱脂牛奶 血清 糖类 蔗糖 乳糖 盐类 乳酸钙 谷氨酸钠 醇类 甘油 山梨醇 甘露醇 酸类 柠檬酸 氨基酸 聚合物 葡聚糖 聚乙烯吡咯酮 一 冻干保护剂的组成和作用 按组成将保护剂分为营养液 赋形剂 抗氧化剂 营养液 使受损细胞修复 脱脂牛奶 蛋白质 氨基酸 糖类 赋形剂 骨架作用 制品形成网孔结构 易溶解 蔗糖 乳糖 抗氧化剂 保护酶类 防止氧化 VC VE 硫代硫酸钠 保护剂的作用 防止细胞内水结晶和细胞失去水分 平衡细胞内外渗透压 防止细胞破裂 助于细胞修复以及冻干后复苏 二 影响保护剂效果的因素 判断保护剂的好坏 从冻干后的存活率 以及生物制品的保质期研究 然后对不同物质筛选不同配方 选出好的保护剂 1 保护剂的种类 不同微生物用不同的保护剂 2 保护剂的浓度 5 10 的葡萄糖保存大肠杆菌存活率高 3 保护剂配制方法 糖 血清 维生素不能高温灭菌 糖可以114 C30分钟灭菌 其他可以过滤除菌 4 保护剂的pH 一般为6 8 三 常用的保护剂 生物制品保护剂很多 各国家不同 如鸡新城疫苗 ND 我国是5 蔗糖脱脂牛奶 日本是5 乳糖 0 15 聚乙烯吡咯酮 1 马血清 一 不同微生物用不同保护剂细菌疫苗 10 蔗糖 5 蔗糖脱脂牛奶 5 蔗糖 1 5 明胶 10 20 脱脂牛奶 厌氧菌苗 0 1 谷氨酸钠 10 乳糖 10 脱脂牛奶 7 5 葡萄糖血清 病毒疫苗 多用混合保护剂 如5 蔗糖脱脂牛奶 二 几种常用的保护剂5 蔗糖脱脂牛奶 新城疫疫苗明胶蔗糖保护剂 禽霍乱疫苗聚乙烯吡咯酮乳糖 厌氧菌SPGA 蔗糖76 62g 磷酸二氢钾0 52g 磷酸氢二钾1 62g 谷氨酸钠0 83g 牛血清蛋白10g 去离子水1000ml 鸡马立克氏疫苗 三 保护剂的添加 一般是疫苗和保护剂1 1加入 5 蔗糖脱脂牛奶 新城疫疫苗 还有是按疫苗量加入保护剂到规定浓度 如5 蔗糖明胶保护剂 加疫苗是先配浓度高的40 的蔗糖 12 明胶 然后按疫苗7份 保护剂1份混合 弱毒疫苗饮水 加0 2 奶粉 以中和水中的有害离子和毒性物质 思考题 什么叫保护剂 组成和作用是什么 影响保护剂效果的因素有哪些 常用保护剂有哪些 第三节免疫佐剂 一 佐剂的概念和原理 一 概念 adjuvant一词来源于拉丁语 即辅佐之意 免疫佐剂是一种非特异免疫增强剂 先注射或和抗原同时注射 能明显增强免疫反应 最新概念 凡是增强抗原特异性免疫反应的物质 均叫佐剂 二 佐剂具备的条件1 安全无毒副作用 2 无致癌性 3 纯度高 吸附力强 易吸收 4 不含与动物交叉免疫的抗原物质 5 不引起机体对自身超敏性 6 耐储存 1年以上 不变质 三 作用机理 抗原递程 助于吞噬细胞的吞噬和抗原传递 引起细胞浸润 抗原寻找 增加抗原目标 改变抗原构型 吸引吞噬细胞 延长体内储存 免疫调节 增强免疫应答 包括细胞免疫和体液免疫 佐剂的分类 按物理性质 颗粒型佐剂 非颗粒佐剂 按生物学性质 微生物和非微生物佐剂 按存储时间 储存型和非存储型 一 颗粒型佐剂 将抗原包括成颗粒状 1 盐类佐剂 氢氧化铝胶 明矾 磷酸三钙等 2 油类佐剂A 弗氏佐剂 1935年 美籍匈牙利学者Freund发明 分弗氏不完全佐剂 矿物油75 85 加羊毛脂 乳化剂 15 25 充分乳化即成 简写FIA Freundsincompleteadvuant 弗氏完全佐剂 是在FIA中加入死结核杆菌或卡介苗即成 缩写FCA B 矿物油司本佐剂 现在经常用的 以后专讲 3 免疫刺激复合物佐剂 简写ISCOM佐剂 皂苷类 4 蜂胶佐剂5 脂质体佐剂其它佐剂 MF59 微胶囊佐剂 二 非颗粒佐剂肽类佐剂 胞壁酰二肽 结核杆菌细胞壁 脂肽及免疫调节多肽 表面活性剂 海藻糖合成的衍生物 核酸类 合成核苷酸聚合体 次黄嘌呤衍生物 免疫刺激序列DNA 含硫复合物 左旋咪唑 既可驱虫 又可免疫增强 高分子碳水化合物 香菇多糖 细胞因子 IL 1 2 4 干扰素 转移因子等 其它 霍乱毒素 类毒素 三 常规免疫佐剂 一 盐类佐剂1926年Gleny使用铝胶佐剂 几十年来 人畜疫苗已经广泛使用该佐剂 作用机理 a 储存和延缓吸收 b 增加抗原表面积 c 形成巨噬细胞肉芽肿 增强体液和细胞免疫 1 氢氧化铝胶合成方法 有三种 铝粉加烧碱 明矾加碳酸钠以及明矾加氨水等 明矾加氨水方法 20 澄清的明矾水 温度60度 边搅边加氨水 到pH8时停止 然后打磨均匀 清水漂洗多次硫酸根离子 到pH7时既可 装瓶高压灭菌 用时20 加入疫苗 2 明矾 有钾明矾和胺明矾 主要是吸附 沉淀 浓缩作用 精致10 明矾水 灭菌 25度保存 按疫苗量1 2 加入 摇匀即可 有沉淀作用 主要用于破伤风类毒素的沉淀和气肿疽灭活疫苗的使用 3 磷酸三钙佐剂 与铝胶同样作用 制作简便 将灭菌的20 氯化钙2 5ml加入100ml疫苗中摇匀 再加入20 磷酸氢二钠7 5ml 摇匀即成白色絮状沉淀 加的次序不能错 该佐剂沉淀作用比铝胶强 二 油类佐剂 矿物油司本佐剂 乳化剂是一种降低其它溶液表面张力作用的物质 可使一种物质分散混合于另一不相容的液体中 司本80或吐温80既是乳化剂 他们可使油类和水剂疫苗乳化均匀 疫苗水剂是分散相 内相 油类为连续相 外相 两者中间是乳化剂 可以做成油包水 W O 也可以做成水包油 O W 前者不易吸收 储存时间长 后者容易吸收和释放 最常用是白油司本佐剂方法 制备油相 94 杭州10号白油 加6 司本80 HLB 亲水亲油值 值高亲水强 值低亲油强 HLB是4 2 混合后加2 硬质酸铝 熬化溶解 高压灭菌备用 水相 疫苗加4 吐温80 HLB15 搅拌均匀即成 按油 水 3 1 1进行高速搅拌或胶体磨磨3遍就成 如果搅拌油中慢慢加入水相 制成是油包水 W O 反之是水包油 O W 油乳疫苗检验 1 粘度检测 口径 1 2mm吸管 吸1ml乳剂 放出0 4ml的时间在2 6秒为宜 不可多于10 15秒 注射困难 2 稳定性检查 加速老化试验 37度 10 30天 不破乳 离心3000转 分钟 15分钟不分层 可以保存一年 三 蜂胶佐剂 1 蜂胶的理化特性 蜂胶含树脂 蜂分泌物 蜂蜡 花粉及其它多种物质 为固体粘稠状 冷硬热软 灰褐色 20 40度发粘 15度下变硬脆 60 70度液化 等级 乙醇溶解后测含量 含66 70 为一级 61 65 为二级 56 60 三级 50 55 是四级 方法 2 5克蜂胶 加乙醇25ml冷浸24h 滤纸过滤 45度干燥 计算浸出物的含量 2 作用 抗菌抗病毒 抗肿瘤 消炎和免疫增强作用 3 蜂胶的使用 蜂胶处理 温度4 8度粉碎 过筛 1 4加入乙醇浸泡24 48h 滤纸过滤去渣 算出含量 4度保存 蜂胶的加入 一般按疫苗量的到10mg ml 摇匀成乳浊状 山东滨州兽医研究所生产蜂胶系列疫苗 第四节新型免疫佐剂 一 细胞因子佐剂 一 细胞因子的概念和分类概念 是细胞释放出类似激素作用的生物效应物质 在免疫应答中起重要作用 分类 经典细胞因子 淋巴毒素 肿瘤坏死因子 干扰素 免疫调节因子 白细胞介素 集落刺激因子 二 作用特点 三多一高一快 多效性 非特异免疫调节多源性 多种细胞可以产生一种因子多靶性 作用多个免疫靶细胞高效性 类似激素 少量就可以 也叫免疫激素快速性 快速反应 如速发变态反应 三 细胞因子的作用1 提高疫苗免疫效果 IL 2与蓝耳疫苗合用 2 预防治疗传染病 肿瘤 肿瘤坏死因子 干扰素 转移因子 3 构建新基因工程疫苗 细胞因子插入疫苗 可以增强免疫效果 四 几种重要的细胞因子IL 1 淋巴细胞活化因子 活化多种免疫细胞IL 2 T细胞生长因子 也促进B细胞增殖 应用多 IL 4 B细胞刺激因子IL 12 B细胞产生的 促进淋巴细胞成熟干扰素 抗病毒 抗肿瘤 免疫调节 二 CPGDNA 胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 是非甲基化的CPGDNA 也叫免疫刺激序列 作用是激活NK细胞 巨噬细胞及B细胞增殖 三 基因工程减毒素通过基因工程技术 切除毒素有害基因 然后在细胞中表达 无毒 还有良好免疫原性 种类 霍乱毒素 CT 粘膜免疫佐剂 口服免疫 大肠杆菌不耐热肠毒素 LT 也是粘膜免疫佐剂 破伤风类毒素 TT 注射疫苗