酵母双杂交文库筛选与蛋白互作验证服务

酵母双杂交技术是研究蛋白质 蛋白质相互作用的一种蛋白组学方法 是基于对真核生物的 转录因子调控转录起始过程的认识而发明的技术 其基本原理是利用真核生物酵母的转录 激活因子 Gal4 可分为结构上分开并且功能独立的两个结构域 N 端 1 147aaDNA 结合结构 域 DNAbindingdomain BD 和 C 端 768 881aa 转录激活结构域 Activation Domain AD Gal4 的 N 端和 C 端可以分开构建表达质粒 将 N 端和诱饵蛋白 研究的目标蛋白 A 融合 表达 C 端和细胞 cDNA 或者猎物蛋白 X 融合表达 如果 cDNA 编码的蛋白 x 能和 A 互相作 用 就能把 Gal4 的 C 端和 N 端联系在一起 形成转录因子 激活 UAS 下游的基因表达 原理如图 1 所示 图 1 酵母双杂交技术原理图 引自 MATCHMAKER GAL4 Two Hybrid System 3 Libraries User Manual 公司选用的是美国 Clontech 公司 现为 Takara 公司收购 的 MatchMaker 系列酵 母双杂交系统 所用的 AH109 Y187 酵母菌株 是通过基因工程的方法突变了内源 Gal4 转录因子的工程菌株 并在 GAL4 UASs 和启动子的下游构建了 3 个报道基因 ADE2 HIS3 MEL1 或 LacZ 因此可以通过营养缺陷和显色报告基因的表达来筛选或验 证两个蛋白之间是否存在相互作用 菌株信息如图 2 所示 所用表达载体信息如下 酵母双杂交技术优点 高效 转化方法简单 转化效率高 便于操作 灵敏 可检测蛋白质之间的微弱作用 真实 酵母细胞是真核细胞 融合蛋白之间的相互作用是在真核细胞核内进行的 蛋白质经过 翻译后的修饰 多数可以保持蛋白质的天然空间构象和折叠状态 接近其真实的生理状态 一 定程度上可代表其在细胞内真实情况 简捷 只需要构建诱饵表达载体 可以省略蛋白质抽 提纯化或抗体制备的繁琐步骤 酵母双杂交服务内容介绍 1 酵母双杂交 cDNA 文库构建 服务内容 总 RNA 提取 纯化 mRNA 分离 cDNA 制备 cDNA 连接 AD 载体 连接产物转化大肠杆 菌 cDNA 文库效价测定 cDNA 文库扩增 cDNA 文库扩增后的质粒 DNA 纯化 纯化后 cDNA 文库质量的鉴定 如 PCR 和酶切鉴定等方法 等 合作方式 为客户构建指定的酵母双杂交基因文库 由客户提供 cDNA 或组织 细胞等 服务完成时提供详细的实验报告以及文库 2 酵母双杂交技术从 cDNA 文库中筛选相互作用蛋白 服务内容 l 诱饵质粒的构建及自激活作用和蛋白毒性检测 l 组织 cDNA 文库的构建 或客户提供 l 酵母接合效率的计算及接合后初步阳性克隆筛选的统计 l 阳性克隆文库质粒的提取 转化酵母后自激活作用检测 l 酵母双杂交筛选结果的质粒回转验证结果 l 阳性克隆文库质粒的提取 转化细菌 测序及登陆 NCBI 等网站进行序列比对 公布最 终筛选结果 合作方式 为客户对指定的基因文库进行酵母双杂交筛选 筛选完成后向客户提供详细的筛选报告和 阳性克隆实物 客户需要提供诱饵基因信息 3 酵母双杂交技术检测指定蛋白对之间的相互作用 技术服务内容 l 诱饵蛋白表达载体与猎物蛋白表达载体的构建 l 表达载体转化酵母的验证及自激活活性 毒性检测 l 诱饵蛋白质粒与猎物蛋白质粒共转化酵母的验证以及相互作用的检测报告 l 无相互作用时诱饵和猎物蛋白的表达情况的 Western blotting 检测 合作方式 为客户对指定的 2 个或多个蛋白之间进行酵母双杂交实验 验证其相互作用 由客户提供 基因克隆 抗体 或从公司购买抗体 实验完成后向客户提供详细的实验报告和相互作用 阳性的酵母共转化菌株 部分实验案例图示 克隆编号相似序列登录号蛋白功能描述相似百分比 56 Os02g50240 glutamine synthetase catalytic domain containing protein expressed 96 89 67 Os06g40640 fructose bisphospatealdolaseisozyme putative expressed 99 76 65 Os02g46520 hydrolase putative expressed 95 22 22 Os05g40180 serine threonine protein kinase stt7 chloroplast precursor putative expressed 77 27 45 Os04g54240 wound induced protein putative expressed 99 30 38 Os05g