分子医学实验方法

,如何在体外表达一个基因？如何检测一个基因的表达？,如何在体外表达一个基因？,如何在体外表达一个基因,基因的获取基因的克隆重组DNA技术基因的表达基因产物的鉴定表达产物的纯化,获取目标基因常常是基因操作的首要步骤。常规方法有PCR法，基因组文库或cDNA文库法以及化学合成法。应根据具体的研究目的和实验条件选用合适的方法。,基因的获取,获取基因的序列,在获取基因之前如果能知道基因的序列将使这一过程变得非常方便。人类基因组数据库提供了所有已知基因的序列。地址为/,化学合成法,较短的基因（100 base）用途：PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针,基因组文库,限制性内切酶,克隆、转化、培养、鉴定,基因组DNA,基因组文库,10,PCR,引物,引物,3,5,5,5,PCR扩增目的基因,基因组,引物设计：（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制,PCR技术的基本过程,模板DNA dNTP 引物Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合酶,循环仪,94oC5,9455 72 ,加样孔,琼脂糖凝胶电泳图谱,PCR产物,DNA Marker,以基因组DNA为模板，得到的PCR产物是含有内含子的基因,逆转录酶PCR（RT-PCR）,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngug水平）比基因组DNA少了内含子cDNA文库,RT-PCR,/Courses/genomics/RTPCR/RT_PCR.html,基因的克隆重组DNA技术,重组DNA技术作为分子医学中最重要、最基本的技术之一，是许多分子医学实验实施的基础，在基因诊断、治疗和预防中具有举足轻重的意义。,20,人体基因克隆,Restriction enzyme EcoRI,Bacterial enzyme that stops viral reproduction by cleaving viral DNAAct as molecular scisssors (cut plasmids and foreign human DNA)Produce short single stranded “sticky ends” where insertions of foreign DNA can be made,基因重组技术需要：,一个载体：质粒、噬菌体、病毒、cosmid、BAC和YAC等二个酶：限制性内切酶连接酶,质粒是最常用的载体,ori,复制起点ori筛选基因多克隆位点（Multiple cloning site ，MCS）,限制性内切酶“分子剪刀”,限制性内切酶和连接酶共同作用可将不同的DNA分子连接形成重组DNA分子,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,切,接,转,筛,质粒转入细菌转化 (transformation)质粒转入真核细胞转染 (transfection)病毒转入细胞感染 (infection),转,1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,筛：重组体的筛选,(插入失活法) 抗药性标记选择,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,重组DNA技术,基因的表达,优点：简单、经济、产量高不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶性蛋白。,1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用),优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、费钱、产量低,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）,表达载体的选择,表达载体必需具备转录和翻译必需的元件：启动子、起始密码子、终止密码子等原核表达载体：S-D序列真核表达载体：增强子、Poly A元件cDNA是首选对象，既可在原核细胞又可在真核细胞中表达基因组DNA只能在真核细胞中表达,表达产物的鉴定,蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,对照 样品 分子量 Marker,表达蛋白生物学功能检测,淀粉酶基因表达,表达产物的纯化,分子筛亲和柱离子交换抗原抗体,目的蛋白,安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC）,如何检测一个基因的表达,mRNA的检测northern blotRT-PCRmRNA的定量检测实时定量PCR蛋白质的定性与定量western blot和ELISA细胞内mRNA的定位检测原位杂交细胞内蛋白质的定位检测免疫组化细胞内蛋白质的定位检测荧光显微分析细胞内蛋白质的定量检测流式细胞技术,核酸分子杂交,序列互补的单链DNA与DNA、DNA与RNA及RNA与RNA间可按照碱基互补配对原则形成杂交分子如果将杂交分子中的一条单链连上标记物就成了核酸探针标记可以是同位素标记或非同位素标记,mRNA的检测RNA印迹（Northern blot）,用DNA探针来检测特异基因的mRNA，以分析该基因的表达情况及mRNA分子的大小，特别用于分析细胞生长、分化、发育过程中有关基因的表达。,/v_show/id_XMTQ1NDg1NDcy.html,RT-PCR,mRNA的定量检测实时定量RT-PCR（real time RT-PCR）,Real time PCR是一种定量PCR技术，用于定量测定特定基因的起始模板数。当模板为来自mRNA反转录的产物cDNA时，可用于定量测定mRNA的模板数，从而确定特定基因的表达水平,蛋白质的检测Western blot,这是一种利用特异抗体来鉴定相应蛋白质的技术蛋白质首先经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维素薄膜上，用带标记的抗体进行结合鉴定抗体标记可以是同位素标记或非同位素标记常用的非同位素标记物为辣根过氧化酶,http:/Western-blot,蛋白质的定量ELISA,酶联免疫吸附法（ELISA）是利用了抗原抗体特异识别与结合的特性而设计的蛋白质定量测定方法，可用于测定蛋白质混合液中特定蛋白质的浓度，是常用的蛋白质测定方法。,/video/280/Enzyme-Linked-ImmunoabSorbant-Assay-reveald,原位杂交,一种用单链RNA或DNA探针通过分子杂交对细胞或组织中的基因或mRNA分子在染色体、细胞、组织或整个生物体上进行定位的方法。可