【毕业学位论文】（Word原稿）乳中乳果糖测定方法的优化及其在乳品质量评定中的应用动物营养与饲料科学硕士论文终稿

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 乳中乳果糖测定方法的优化及其在乳品质量评定中的应用 I 摘 要 本研究 在优化 法的基础上，进一步探讨 了 乳果糖在液态乳不同加工条件 下的变化规律 。 试验一 本试验以快速稳定的检测乳中 乳果糖 含量 为目的， 采用析因实验 在 11285法的基础上 ， 将其中的乳果糖水解步骤条件 修改为培养时间 1h、培养温度 50 、 半乳糖苷酶添加量 300U。新方法 平均回收率为 与 法（ 11285定结果差异不显著 (P= 比 的测定周期缩短 9小时，并显著降低微生物污染的几率。 试验二 研究不同杀菌温度、杀菌时间及复原乳添加量对 巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳中 乳果糖含量的影响。 结果表明： 在 巴氏杀菌条件下，牛乳中的乳果糖含量随着杀菌温度 （ 85、 90、 95、 100 ） 和杀菌时间 （ 15s、 30s、 45s、 75s、 90s） 的升高 呈线性上升趋势（ 且 杀菌温度对乳果糖值的影响大于杀菌时间对它的影响。复原乳 （ 85 ， 15s） 添加比例 （ 2%、 5%、 10%、 20%） 与乳果糖含量呈正相关（ 2 ； 在 菌条件下， 牛乳中的乳果糖含量随着杀菌温度（ 137142 ）和杀菌时间（ 2s、 5s、 15s）的升高 呈 曲线 上升趋势 （ 。可根据 菌乳 中的 复原乳 （ 139 ，4s） 添加比例 （ 10%、 20%、 30%） 与乳果糖含量呈负相关 （ 。 试验 三 研究 4种商业 19 2 条件下储存 2个月间的乳果糖含量变化情况。结果表明： 菌乳中乳果糖含量在货架前期 （ 42d 以前） 相对稳定，后期随储存时间的延长而增高 (P 具体增高幅度与生产工艺有关。 关键词 乳果糖 ， 牛乳 ， 巴氏杀菌， 菌 ， 酶法 on SO in to of in A of in by SO to 0 h 00 in of 90；（ W：待测 菌乳样品中每 100g 蛋白质中所含糠氨酸的毫克数； t：待测 菌乳贮存天数） b） 当 菌结束时乳每 100g 蛋白质中糠氨酸含量为 140190，乳果糖含量（ ）与糠氨酸含量（每 100值小于 2。 农业部行业标准 糠氨酸在储存期间变化较剧烈。 ， 1990；， 1992； ， 2000； ， 1994 乳果糖 可用于区别乳品的热处理程度，还可作为鉴定 菌乳是否含有复原乳 欧盟规定巴氏杀菌 乳中乳果糖的含量应该低于 50， 1993）和 1992）对区分 菌乳和二次灭菌乳做了规定： 00 农业部行业标准 酶法测定方法较烦琐。 ， 1996； ， 2000； ， 2003 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 6 果糖的生成与结构 乳果糖（ 4名半乳糖苷果糖、 1 4 半乳糖苷果糖、乳酮糖（ 含有一分子半乳糖和一分子果糖。它是在牛乳热处理过程中，乳糖在酪蛋白的游离氨基集团的催化条件下碱基异构化而形成的一种合成双糖(1984； ， 1986)。乳果糖与乳糖是同分异构体，两者的 结构式 见图 1 图 1果糖与乳糖的结构式 he of 1958 年首先发现牛乳中存在乳果糖，并指出乳果糖是由 运而形成的，并可以由乳果糖苷赖氨酸的 排反应生成。 1960）在 55 下贮存脱脂乳粉 21 天后检测乳果糖、甘油醛、塔格糖和酸性产物。他们发现游离乳果糖在碱性条件下 降解产生，这种降解反应是在乳蛋白中游离氨基催化下进行。 随后的研究表明乳果糖的形成主要有两个条件： 运和 排反应。 乳中乳果糖含量的测定方法 由于乳果糖可以 作为衡量牛乳热处理效应的指标，国 内外关于测定牛乳中乳果糖含量的方法也逐渐成为研究热点。目前检测乳果糖含量 存在 的主要问题是：牛乳中乳糖含量很高（约 4%）而乳果糖含量很低 （ ，在测定乳果糖时高含量的乳糖会对其产生干扰。因此不同 的 测定方法针对这一问题提出了不同的解决方案（表 1从表中可以看出各种方法均有各自的缺点，其中 法是目前较成熟且应用广泛的一种方法，它被国际标准化组织 （ 2004 年列为标准方法，我国的农业部行业标准巴氏杀菌乳和 菌乳中复原乳的鉴定中也规定使用该方法测定液态乳中乳果糖的含量。但 酶 法也有一定的缺点 ， 需要 进一步 的改进。 乳果糖 乳糖 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 7 表 1果糖的各种测定方法 o f an is in 方法 原理 检出限 优点 缺点 资料来源 法 用 半乳糖苷酶 将牛乳样品中的乳糖和乳果糖分别水解为葡萄糖和果糖，通过添加葡萄糖氧化酶除去葡萄糖，从而降低测定干扰，然后将所产生的果糖在磷酸葡糖异构酶作用下转化为葡萄糖 6磷酸，利用己糖激酶和葡萄糖 6磷酸脱氢酶水解葡萄糖 6磷酸，产生定量的 过测定 340吸光值可以准确测定牛乳样品中乳果糖的含量 1 测定准确，检出限低（ 1）、稳定性和可靠性强 成本 高；测定时间长，；检测样品具有局限性；操作过程中易受微生物污染而造成乳果糖测定值偏低。 1285效液相色谱法 利用沉淀剂沉淀牛乳中的蛋白质和脂肪，然后利用高效液相色谱测定滤液中乳果糖的含量。示差检测器（噪音水平 510色谱柱：87（ 30保护柱：阳离子柱和阴离子柱；洗脱液： 水（ 并用 气；流动相流速 标法定量。 2001500 操作简 便、测定周期短 由于乳糖和乳果糖为同分异构体，二者出峰时间十分相近，各种乳制品中乳糖的量远大于乳果糖的量，使乳果糖峰容易包含在乳糖峰之内，出现拖尾现象。 11868:1997 气相色谱法 沉淀牛乳中的蛋白质和脂肪，然后过滤，使用 基 谱条件为： 色谱柱：30m壁涂层为 子固定相为 50联二苯和 50二甲基硅氧烷；进样器温度 300 ；氢火焰离子检测器温度 300 ；色谱柱温度：程序升温 175 (2 3 (3进样体积： 1 2L。 50100 操作简便、测定周期短；适用于检测蔗糖含量比较高的乳制品中的乳果糖含量 由于乳糖和乳果糖为同分异构体，二者的出峰时间十分相近，加之各种乳制品中乳糖的量远大于乳果糖的量，使乳果糖峰容易包含在乳糖峰之内，出现拖尾现象。 005 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 8 方法 原理 检出限 优点 缺点 资料来源 离子色谱法 00 离子色谱仪配以 度泵， 化学检测器带金工作薄层电化学检测池；参比 电极为 谱条件为： 250离柱， 20护柱，脉冲安培检测； 操作简便、测定周期短；灵敏度高 离子色谱仪的普及程度限制了该种方法的推广 曾文芳等， 2006 微分 法 利用 半乳糖苷酶分解乳中乳糖与乳果糖为葡萄糖和果糖，己糖激酶分解葡萄糖和果糖产生 H ，通过 化反应测出被分解乳果糖的量。然后通过对 号和乳果糖溶液信号之间线性相关分析，求得回归方程，从而计算出 乳果糖的含量。 L 测定周期短；灵敏度高 尚处在各自试验室研究阶段，并且操作较为繁琐并没有得到大范围的推广 ， 2003 色法 用 半乳糖苷酶分解乳中乳果糖为果糖和半乳糖，在有四甲基偶氮唑盐（ 在时，果糖进一步被果糖脱氢酶水解后与吩嗪甲硫酸酯（ 生反应，溶液中产生带有颜色的 物质利用分光光度计在 570件下可定量检测。 10 测定周期短；灵敏度高 操作较为繁琐；不能测定本身含有果糖的牛乳样品。 ， 2000 安培电流计法 利用 半乳糖苷酶将乳果糖水解为果糖后，果糖在铁氰化钾e(介导下被固化的果糖脱氢酶水解反应生成 5此过程中将 N)63 转变为 N)64 ,后者再得到电子转化为N)63 ，在该过程中采用 参比电极可定量测定氧化产生的电流，从而推出样品中乳果糖的含量 测定周期短；灵敏度高 尚处在各自试验室研究阶段，并且操作较为繁琐并没有得到大范围的推广 1996 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 9 乳热处理过程中乳果糖的生成规律研究 鲜牛乳中的乳果糖含量 研究表明，生鲜牛乳中乳果糖的含量很低，在 之间 （ ,1994； 1996） 。 氏杀菌乳中乳果糖的变化规律 目前国外对巴氏杀菌乳中乳果糖含量随具体热处理程度变化情况的研究较少，只将其作为区分巴氏杀菌乳和 菌乳的辨别指标。从表 1可看出，在研究早期，由于检测方法灵敏度的局限性并未检出巴氏杀菌乳中含有乳果糖。随着新的、更加灵敏的检测方法的陆续涌现，这一问题得到了解决。巴氏杀菌乳中乳果糖含量范围分布在 间，而高温巴氏杀菌乳中的乳果糖含量范围为 58， 巴氏杀菌乳中的乳果糖含量低于高温巴氏杀菌乳的乳果糖含量。 随着生产工艺的不同，巴氏杀菌乳中的乳果糖含量也有所差别。而从 （ 1995）和 （ 2006）的试验可以看出巴氏杀菌乳中的乳果糖 会随加工温度和时间的增高而增高，但乳果糖在巴氏杀菌乳中随温度和时间的具体变化规律目前尚不清楚。 表 1氏杀菌乳中乳果糖的含量范围 h e o f in p 巴氏杀菌乳类型 热处理工艺 （温度 /时间） 乳果糖含量 （ ） 资料来源 巴氏杀菌乳 检出 1984 巴氏杀菌 50/15检出 ， 1995 巴氏杀菌 60/15检出 巴氏杀菌 70/15检出 巴氏杀菌 70/603 巴氏杀菌 80/15检出 巴氏杀菌 80/602 巴氏杀菌 90/157 巴氏杀菌 97/1540 巴氏杀菌乳 ， 1999 高温巴氏杀菌乳 氏杀菌乳 .5 ， 2004 高温巴氏杀菌乳 8 高温巴氏杀菌乳 85/30s 50 ， 2000 巴氏杀菌乳 ， 2005 巴氏杀菌乳 74 /30s 15 ， 2006 高温巴氏杀菌乳 85 /30s 31 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 10 菌乳 中乳果糖的变化规律 目前针对 在 菌乳中乳果糖含量检测 的 报道较多， 但 乳果糖随热处理温度和时间的变化规律的研究较少（表 1 菌乳中乳果糖含量为 50 ， 其中 直接 20 , 间接 菌乳中乳果糖含量为 。 尽管直接 菌温度为 150 ，而间接 有 140 ，但由于间接 过预热、冷却的强度大，是非瞬时灭菌过程，受热损害更大，因此 直接加热法 菌乳的乳果糖含量 比间接加热法 菌乳低 。 表 1菌乳中乳果糖的含量范围 h e o f HT 菌乳类型 热处理工艺 （温度 /时间） 乳果糖含量 （ ） 资料来源 菌乳 00 510 ， 1983 菌乳 0 720 1984 直接 菌乳 ， 1994 间接 菌乳 接 菌乳 39998 间接 菌乳 48277 直接 菌乳 65 ， 2004 间接 菌乳 41 直接 菌乳 150 /4s 12010 ， 2000 间接 菌乳 140 /3s 25015 间接 菌乳 140 /10s 45624 菌乳 ， 2005 直接 菌乳 140 /2s 144， 2006 间接 菌乳 137 /4s 400 乳果糖与复原乳的关系 “复原乳 ”又称 “还原乳 ”（ 指炼乳或 /和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳。市场上常见的复原乳通常是由工业乳粉制成的。乳粉和炼乳的生产过程中的浓缩和干燥阶段热处理强度均低于 保持法灭菌工艺的热处理强度，处理温度相对比较温和，因此乳果糖的形成比较少。 近几年国内外对复原乳中的乳果糖含量进行了研究。 （ 1994）研究结 果表明，复原乳中乳果糖的含量在 之间，而 （ 2005）利用气相色谱法测定复原乳中的乳果糖含量为 。 （ 1995）研究表明由于牛乳干燥过程中的热处理温度相对超高温灭菌工艺温和，乳果糖的形成比较少。因此含有复原乳的 菌乳中乳果糖含量小于直接由生鲜牛乳生产的 菌乳中的乳果糖含量。目前我国已经将乳果糖作为测中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 11 定 菌乳中是否含有复原乳的指标之一，但是，巴氏杀菌乳中乳果糖含量与复原乳间的关系以及 复原乳在巴氏杀菌乳和 菌乳中添加比例与乳果糖含量的关系尚不清楚。 菌乳在储存期间的乳果糖变化规律 由于 有些 菌乳的货架期长达 180d 以上，因此 菌乳中的乳果糖在整个储存期间的变化情况值得研究。国外研究表明，贮存条件（储存温度和时间）对 菌乳中乳果糖的含量有影响，但由于各自国家 菌乳的生产工艺千差万别，其研究结果不尽相同。 1984） 的研究指出，牛乳中乳果糖含量随储存期变化的趋势受牛乳中乳果糖含量的多少而决定，他的研究表明 菌乳储存 6 个月后，乳果糖含量保持不变，而保持法灭 菌乳在储存 40 天后乳果糖含量逐渐增高。他在 1987 年的研究进一步表明不同加工工艺的 菌乳在室温、黑暗条件下储存 70 天后的乳果糖变化趋势不同，既有逐渐增加的也有保持不变。 ， 1994 证明 菌乳在 22 和 30 下分别贮藏 90 天后， 乳果糖 增加量分别为204 和 9510。 （ 1995）利用乳果糖作为反应乳糖异构化和初级美拉德反应的指标，来评价牛乳中杀菌过程的过度热处理。他对保持法灭菌乳样品在 4 、 23 、 35 温度条件下每储存 60天的乳果糖含量进行 了测定，结果表明乳果糖异构化反应仅在 35 有发生：每储存 60 天，灭菌乳中乳果糖增加 129。 （ 2005）将 菌乳在室温条件下（ 20）储存了 24 星期 ,结果表明 间接 微小的浮动。 (2006)采用 1997 酶法研究了储存时间对牛乳中乳果糖含量的影响，结果表明乳果糖异构化反应在 25 和 35 均能发生。 目前我国对此研究尚属空白。 果糖在乳品质量评价中的应用 国际奶业联合会（ 欧盟（ 规定乳果糖为区别 菌乳和保持法灭菌乳的参数，并相继出台了对应的标准和检测方法标准。此外欧盟（ 规定巴氏杀菌乳中乳果糖含量应低于 50 ， 菌乳中乳果糖含量低于 600 。德国更将欧盟限制的 菌乳中乳果糖含量降到 400。 我国于 2005 年出台的农业部行业标准 939氏杀菌乳和 菌乳中复原乳的鉴定中也规定 菌乳中乳果糖含量应低于 600，并将其作为判定 菌乳中是否含有复原乳的指标之一。该标准规定：若 菌乳中糠氨酸 含量在 140 到 190mg/白质时，用乳果糖与糠氨酸的比值来判定是否含复原乳。若乳果糖 /糠氨酸含量比值 2 时则判定含有复原乳，反之亦然。这是因为乳粉中糠氨酸含量都在 200mg/白质以上，而乳果糖含量很低（ 50，按 制 成复原乳计算）。在 110 150 乳果糖异构化程度是梅拉德反应的 3 4 倍。但在贮存期间梅拉德反应的程度大于乳糖异构化（ 993）。如果 菌乳中掺入复原乳，则糠氨酸含量增加，而乳果糖含量下降，所以乳果糖 /糠氨酸含量比值降低。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 12 在的问题和有待进一步深入研 究的领域 综上所述，尽管国外对牛乳中的乳果糖含量作了大量的研究工作，但仍然存在如下问题： 1） 从国内外研究技术来看，现有的 酶法测定 乳果糖效率较低，限制了其推广，迫切需要有高效、低成本和抗干扰的替代方法； 2）乳果糖在牛乳热处理时间和温度的条件下的具体变化规律并不清楚； 3）复原乳在 巴氏杀菌乳和 菌乳中添加比例与乳果糖含量的关系尚待研究； 4）乳果糖在储存期间的变化规律目前我国研究尚属空白。 究目的和意义 由于液态乳质量和复原乳问题，我国已经开始通过测定乳品中乳果糖的含量来进行液态乳质量评价。但目前 乳 果糖测定 方法的缺点限制了其推广，迫切需要有高效、低成本和抗干扰的替代方法。本研究通过对乳果糖测定方法的优化，探讨乳果糖在不同加工条件 下 的变化规律，进而建立评价牛乳热处理效应的体系指标， 并 为乳品企业质量控制提供理论依据。中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 13 第二章 乳果糖 酶法 测定方法的优化 法具有准确度高、检出限低的优点。但该方法也具有明显的缺点：利用 半乳糖苷酶水解乳果糖是该方法的关键步骤， 该步骤中的 培养温度为 40 （ 1285而该温度正是微生物适宜生长的温度。牛奶中绝大多数微生物都属于中温微生物，其最适生长温 度一般在20 45 之间。在采用 法对牛乳中乳果糖含量进行测定时发现若试验器皿的洁净度不高，或试验环境中微生物较多，极易产生微生物污染而造成乳果糖测定值偏低；此外该步骤中培养时间规定为 10h 以上，也造成整个测定周期过长，不利于 该 方法的推广和大批量测定。 酶水解反应完全程度受温度、反应时间、酶量和 的影响。为了尽量缩短培养时间，减少测定周期，本试验根据酶促反应动力学的原理：升高培养温度和加大酶的添加量可加速酶的反应速度而对水解条件进行优化，从而建立出一种快速 检测乳果糖的 方法。 料与方法 验 内容 验一 半乳糖苷酶 的筛选 通过对两种 半乳糖苷酶 的筛选和用量确定，选出最适宜乳果糖测定的 半乳糖苷酶 ； 验二 乳果糖水解步骤各条件对水解率的影响 探讨培养温度对乳果糖水解步骤的影响，在此基础上进一步确定乳果糖水解步骤的酶添加量与培养时间的关系，确定优化条件，从而建立快速测定乳果糖含量 的方法 。 验三 回收率的测定 在新鲜生乳中添加不同浓度（ 5 600）的乳果糖标准液，采用乳果糖快速酶法进行乳果糖标准的回收率测定，检测 该 方法的可靠性。 验四 快速酶法与 法比较研究。 对市场上采购的 菌乳进行快速酶法与 法对比试验，采用配对样品 t 检验对结果数据进行统计。并研究试验环境对两种方法的影响。 验五 快速酶法在乳中乳果糖含量检测中的应用。 采用快速酶法对市场上购买的不同种类牛乳和自己制备的不同加工工艺的牛乳样品进行测定，探讨该方法的应用。 料来源 试验 一至 试验 五的 牛乳样品来源见表 2 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 14 表 2测样品来源 he of 样品名称 热处理工艺 (温度 /时间 ) 样品 数量 样品来源 试验 生鲜牛乳 11 中国农业科 学院北京畜牧兽医研究所试验牛场 试验三及试验五 巴氏杀菌乳 巴氏杀菌 25 超市随机购买的商业牛乳 试验五 85 15S 4 自己制备：生鲜牛乳经 65 ， 15S 预热、均质后，在 85 的水浴锅中加热 15S 菌乳 超高温灭菌 74 超市随机购买的商业牛乳 试验一、试验二、试验四及试验五 137 5S 3 自己制备： 采用 型加工设备按照不同加工温度和加工时间加工生产 138 2S 3 139 5S 3 140 5S 3 141 2S 3 142 15S 3 奶粉 3 市场上购买的工业奶粉。测定时按照总固形物为 12配制成复原乳 试验五 要试剂 半乳糖苷酶 ( 5635 ；5160)；葡萄糖氧化酶 ( 9180)；过氧化氢酶 (C 0630) ；己糖激酶葡萄糖 酸脱氢酶 (s E. C. 8629 )；磷酸葡萄糖异构酶 (C 2688)；其他试剂均为分析纯。 要仪器 紫外 /可见光分光光度计 司）；生化培养箱 9050 剂配制 冲液 A ( ( 2O)和 国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 15 溶解于 80中，用 1 氢氧化钠溶液调整 20 ）稀释到 100匀。 冲液 B 称取 乙醇胺盐酸盐 N(和 酸镁 (解于80中。用 1L 氢氧化钠溶液调整 20 ），稀释到 100匀。 冲液 C 将 冲液 B 用水稀释到 100匀。 半乳糖苷酶悬浮液 以 300mg/度保存于 L 硫酸铵溶液 (活性为 10U/37 ）。 萄糖氧化酶悬浮液 将 20230U 37 ）的葡萄糖氧化酶溶于 1，该溶液现配现用。 氧化氢酶 悬浮液 保存于 20mg/溶液中， 65000IU/25 ，以过氧化氢为底物）。 糖激酶 葡萄糖 浮液 保存在 硫酸铵溶液。 2mg/140U/25 ；以葡萄糖和 底物）；mg/140U/25 ；以葡萄糖 6 酸葡萄糖异构酶 (浮液 保存于 硫酸铵溶液中。磷酸葡萄糖异构酶 2mg/350IU/25；以果糖 液 50 50酸氢钠溶于 1中。 10于 1。 果糖测定方法 乳果糖测定方法采用 法 （ 11285。只在乳果糖水解步骤中的 半乳糖苷酶 来源、半乳糖苷酶 添加量、培养时间、培养温度的条件有所不同。 品制备： 移取 测 乳 样于 100量瓶，用蒸馏水定容，摇匀。 品纯化： 取 制备的样品 50角瓶中，依次加入 度为 150 g/L 的亚铁氰化钾 (e()溶液、 度为 300g/L 的硫酸锌（ 液和 冲液 A。每加一次试剂后要充分摇匀，全部加完后静置沉降 30滤。弃去最初的几滴滤液，收集纯化好的试样溶液。称为样品的 “澄清液 ”。 果糖的水解： 取样品澄清液 10量瓶中，加入 100l（ 300U）的 半乳糖苷酶 悬浮液，摇匀、加盖，在 50 下培养 1 小时。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 16 萄糖氧化步骤： 在 养好的试样中，依次加入 冲液 C、 100l 葡萄糖氧化酶悬浮液、 1 滴正辛醇、 氢氧化钠溶液、 5030%）和 100加一种试剂要摇匀，全部加完后，在 40 水浴或烘箱中培养 3h。冷却后用蒸馏水定容至 10滤，弃去开始的几滴滤液，收集氧化后的试样溶液。称为 “待测滤液 ”。 白试样： 每个样品都要做空白测定。空白试样步骤同 是在 骤中省去加 半乳糖苷酶 悬浮液。 色测定：以下测定步骤按表 2 表 2色步骤所添加试剂顺序 ce i n 步骤 空白 样品 比色皿中依次加入： 缓冲溶液 B 液 液 测滤液 馏水 匀，静置 5入 浮液 20l 20l 混匀，静置 10 340 入 浮液 20l 20l 混匀， 15测 吸光度 ：（ 1）以上反应在同一比色皿中进行。 （ 2）如果加 1样滤液吸光度超过 适当减少待测滤液体积，增加水体积，保持最后总体积为 果计算 样品吸光值差值 空白吸光值差值 品净吸光值差值 果糖含量 C（ ）： 0g / ）（乳果糖含量 式中： 乳果糖的摩尔质量（ 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 17 340摩尔吸光度（ 比色皿中液体总体积（ 比色皿中加入的滤液体积（ 1 d比色皿的光径（ 1 V乳样总体积（ 50 据统计分析 数据处理采用 有数据采用最小二乘均数 重比较利用 对比试验数据采用可量资料两样本平均数配对法 T 检验。 果与讨论 半乳糖苷酶的筛选及其用量的确定 图 2同半乳糖苷酶及其添加水平对乳果糖测定的影响 （ 米曲霉源， 大肠杆菌源） of of 2004 年出台的酶法测定牛乳中乳果糖的方法中明确规定乳果糖水解步骤的 半乳糖苷酶 为大肠杆菌（ E. 源。但 （ 1996）， （ 2003）均 指出在乳糖存在的情况下， E. 半乳糖苷酶 对乳果糖的水解活力仅为乳糖的 6%，米曲霉源的 半乳糖苷酶对乳果糖的水解活力则为乳糖的 210%。本试验也通过比较这两种酶的不同添加量（ 5 U、 5U、 50U、 75U、 150U、 200U、 300U）对乳果糖水解的影响发现（见图 2在 准推荐的反应条件下，米曲霉源的 半乳糖苷酶具有更高的乳果糖水解效率：添加量为 50U 时乳果糖便中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 18 可完全水解，然而依照 准推荐每样品添加 75U 大肠杆菌源的 半 乳糖苷酶的方法所得结果显著偏低（ l 和 l， P这也说明 荐的标准方法中 半乳糖苷酶的添加量有可能导致测定结果偏低。目前，米曲霉源的 半乳糖苷酶的价格约为 大 肠杆菌源的 1/10 倍，选用米曲霉源的 半乳糖苷酶还可显著降低 测定 成本。因此，以下试验均选用米曲酶源的 半乳糖苷酶。 果糖水解步骤各条件对水解率的影响 养温度对乳果糖水解步骤的影响 （ 1986）研究表明在相同条件下，乳果糖水解步骤的培养温度 40 与 50 无显著差异。 1978）也证明多种 半乳糖苷酶 对乳糖水解作用的最适宜温度为 43 53 ，较低温度会影响果糖的生成。 （ 2000）试验表明 半乳糖苷酶 在 65 、培养时间5加量为 30U、水解液 为 条件下就可以水解完全，该试验同时证明温度越高，乳果糖完全水解所用的培养时间越短。本试验（见表 2明在水解液 为 情况下，65 的培养温度是及其不合适的， 65 最低与 30 、 40 、 50 都有显著差异（ P怀疑65 的温度使米曲霉源的 半乳 糖苷酶 失活。而 50 时乳果糖含量最高且与 40 无显著差异，同时可从表中看出随着温度升高，乳果糖含量呈上升趋势。根据酶动力学原理：升高温度会使酶反应速率提高。因此，本实验选用培养温度 50 后，继续进行了酶添加量与培养时间的析因实验，寻找二者间的互作关系。 表 2养温度对乳果糖水解程度的影响 on of by 养温度（ ） 30 40 50 65 乳果糖（ ） ：同行数据右肩标有不同小写字母者为差异达到显著水平 (P 定温度下，培养时间与酶添加量对乳果糖水解步骤的影响 乳果糖水解步骤的进一步优化试验采取 54 析因试验，各因子的水平见表 2果见表 2 表 2素与水平 he of 目 培养时间 (h) 酶添加量 (U) 培养温度 ( ) 1 5 50 2 1 150 50 3 4 300 50 4 7 600 50 5 10 50 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 乳果糖酶法测定方法的优化 19 表 2因子对实验处理组乳果糖浓度的影响 he of on of 养时间 酶添加量 显著性水平 培养时间 酶添加量 两者交互 乳果糖（ ） 1 注：同 列 数据右肩标有不同大写字母者为差异达到极显著水平 (P 表 2定酶添加量 300U 下，不同培养时间的乳果糖含量变化 he of in by 00U in 养时间（ h） 4 7 10 乳果糖（ ）