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核磁共振波谱NMRNuclearMagneticResonanceSpectroscopy 学术汇报汇报人 吴育 南京中医药大学 NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine 1 核磁共振波谱NMR 核磁共振波谱NMR的现代应用 NMR发展简史 核磁共振理论基础 核磁共振波谱仪 自旋 自旋耦合spin spincoupling 化学位移与化学结构的关系 影响因素 解析方法 去偶差光谱DDS NOE差光谱 INEPT谱 DEPT谱 二维NMR谱 2D分解谱 2D相关谱 2D INADEQUATE谱 HMQC谱及TOCSY谱 核磁共振氢谱 1HNMR 核磁共振原理及仪器简介 核磁共振波谱NMRNuclearMagneticResonanceSpectroscopy 2 核磁共振原理及仪器简介 1924年PauliW 假设 特定的原子核具有自旋和磁矩 放入磁场中会产生能级分裂 1952年Standford大学的Bloch和Harvard大学的Purcell独立证实了上述假设 获NobelPrize 1953年 第一台NMR仪器 FT NMR 1991 Ernst对高分辨核磁共振方法发展 获NobelPrize 2002年 生物大分子的核磁分析 美 日 瑞科学家同时获得二项诺贝尔奖 3 核磁共振原理及仪器简介 NMR 利用磁场中的磁性原子核吸收电磁波时产生的能级分裂与共振现象 原子核是带正电荷的粒子 其自旋将产生磁场 形成的这一小磁体称为磁偶极子 核磁共振理论基础 N S N S SN NS 自旋量子数I与原子核组成 质子数p与中子数n 的经验规律 核磁共振的产生的条件 4 核磁共振原理及仪器简介 I 0的核为磁性核 可以产生NMR信号I 0的核为非磁性核 无NMR信号 I 1 2的原子核 其电荷均匀分布于原子核表面 这样的原子核不具有四极矩 其核磁共振的谱线窄 最宜于核磁共振检测 5 核磁共振原理及仪器简介 一个自旋磁场方向与外加磁场 H0 方向一致 处于低能态 m 1 2 其能量E 1 2 HH0 自旋磁矩 外加磁场强度 另一个自旋磁场方向 磁矩 与外加磁场方向相反 处于高能态 m 1 2 其能量E 1 2 HH0 6 核磁共振原理及仪器简介 核磁共振的条件 二个频率相等 电磁波的频率与该核的回旋频率 相等 质子跃迁时需要的能量 E 2 HH0电磁波的能量 E h 发生核磁共振时 E E 所以h 2 HH0 H 自旋磁矩 2 79核磁子 1 41 10 23尔格 高斯 H0 外加磁场强度h 普朗克常数 6 6256 10 27尔格 秒 电磁波频率 7 核磁共振原理及仪器简介 数据处理及记录 探头 高频电磁波发生器及接受器 外加磁场 核磁共振波谱仪nuclearmagneticresonancespectrometer 8 核磁共振原理及仪器简介 9 超导磁铁superconductivemagnet 200MHz以上高频谱仪采用超导磁体利用铌钛合金在液氦中 温度4K 的超导性质 只要不破坏超导状态 及时补充液氦 则磁场强度不变 超导核磁共振波谱仪 200 400HMz 可高达600 700HMz 10 探头 产生固定频率的探头 作用 双核探头 1H 13C 四核探头 1H 31P 13C 15N 发射脉冲电磁波 圆柱形 在磁体中心 放样品管 样品管外径5mm的玻璃管 测量过程中旋转 磁场作用均匀 检测核磁共振信号 11 连续波NMR仪器 CW NMR 脉冲FT NMR 样品利用率低 灵敏度低 分辨率低 高频电磁波发生器 任一瞬间只有一种原子核处于共振状态 其它核处于等待状态 样品利用率高 灵敏度高 分辨率高 在脉冲作用下 该同位素的所有核同时共振 一般1H NMR测量累加10 20次 需时1分左右 13C NMR测量需时数分 测定时间短 12 样品的制备 标样浓度 溶剂 试样浓度 5 10 需要纯样品15 30mg 傅立叶变换核磁共振波谱仪需要纯样品1mg 氘代溶剂 四甲基硅烷TMS 1 1H谱四氯化碳 二硫化碳 氯仿 丙酮 苯 二甲基亚砜的氘代物 13 样品的制备 在测试样品时 选择合适的溶剂配制样品溶液 样品的溶液应有较低的粘度 否则会降低谱峰的分辨率 若溶液粘度过大 应减少样品的用量或升高测试样品的温度 通常是在室温下测试 对碳谱和氢谱 基准物质最常用TMS 四甲基硅烷 01 对于核磁共振氢谱的测量 应采用氘代试剂以便不产生干扰信号 对低 中极性的样品 最常采用氘代氯仿作溶剂 极性大的化合物可采用氘代丙酮 重水等 02 为测定化学位移值 需加入一定的基准物质 即内标 若出于溶解度或化学反应性等的考虑 基准物质不能加在样品溶液中 可将液态基准物质 或固态基准物质的溶液 封入毛细管再插到样品管中 称之为外标 03 14 核磁共振原理及仪器简介 测定方法 装有试样液的试样管放到磁场强度很大的两块电磁铁中间 用射频振荡器高度稳定地发出固定频率的电磁波 不变 在扫描发生器中 通直流电流 可连续的调节外加磁场的强度进行扫描 扫场 当磁场强度达到一定值H0时试样中某一类型质子发生能量跃迁 共振 然后 射频接受器通过射频接受线圈 接受共振信号 信号经过放大在记录器上绘出核磁共振谱图 15 核磁共振氢谱 1HNMR 1H 核磁共振谱 NuclearmagneticResonance 自旋 自旋耦合spin spincoupling 氢核自旋分裂原理示意图 这种相邻近氢质子之间相互干扰作用称为自旋 自旋偶合 简称自旋偶合 偶合是分裂的原因 分裂是偶合的结果 16 1偶合常数值的计算 J 单位 Hz 裂分峰之间的距离 1 2 J Hz 1 2 照 J Hz 2主要结构与 J 的关系 1 直链烷烃 偕偶 Jgem 12 15Hz 邻偶 Jvic 6 8Hz 远程偶合 Jlong 0 3Hz 核磁共振氢谱 1HNMR 2 烯烃 Jgem 0 3HzJvic 6 12Hz顺式cisJvic 12 18Hz反式trans 17 Jvic 9 1Hz 4 苯环 核磁共振氢谱 1HNMR 3 炔烃 18 5 环己烷型 6 杂环化合物 XJ2 3J2 4J2 5J3 4 呋喃O2 00 91 53 5吡咯N2 71 52 13 7噻吩S4 71 02 93 4 J2 3J3 4J2 4J2 5J2 6J3 5 吡啶5 67 91 30 7 1 10 2 0 51 4 1 9 核磁共振氢谱 1HNMR 19 核磁共振氢谱 1HNMR 化学位移与化学结构的关系 1H 核磁共振谱 NuclearmagneticResonance 20 核磁共振氢谱 1HNMR 影响化学位移因素 共轭效应 连接推电子基 p 共轭 电子云密度 向高场位移 诱导效应 电负性 电子云密度 向低场位移 VanderWaals效应 空间两核靠近时 带负电荷的核外电子云就会相互排斥 使核裸露 质子的 化学键的各向异性 感生磁场与外场相反 削弱了外场屏蔽作用 变小 1H 核磁共振谱 NuclearmagneticResonance 21 偶合系统的类型 一 等价质子与不等价质子 等价质子 化学等价质子凡是化学位移完全相同的氢质子 称为化学位移等价质子 简称化学等价质子 指化学环境相同 在相同的外加磁场强度下发生共振的氢质子 当然它们的 值应当是相同的如CH3 CH2 OH 磁等价质子如果一组质子中任何一个质子对组外质子的偶合常数都相等 这组质子则称为磁等价质子 如Ha与Hb为化学等价 而磁不等价 二者化学环境相同 但Ha对Hc与Hb对Hc的J值不同 因为Ha对Hc是邻偶 而Hb对Hc是对偶 等价质子如果一组质子即是化学等价又是磁等价 则称这组质子为等价质子 或磁全同质子 即它们的化学位移 值相同 同时对组外质子的偶合常数也相同 22 不等价质子 前手性碳原子上的氢质子是不等价的 指与手性C紧邻的C 即与不对称碳原子C 直接相连的C上的氢质子是不等价的 虽然是单键连接 但不管R CH2的旋转速度有多快 CH2质子还是不等价旋转很快时 下面三个构象的或然率可能几乎相等 但二个质子的化学环境还是不相同 在构象I中 Hb在Y和X之间时 R在X和Z之间 而在构象 中 Ha在Y和X之间了 但R又落在Y和Z之间 因此Ha和Hb的化学环境仍然不一样 成为不等价质子 23 分子不具有对称面 Ha与 CH3顺式 Hb与Br顺式 二者在空间的化学环境不同 2个H分别用X取代后 得到二个非对映体 为二种化合物 故Ha与Hb为不等价质子 互相之间要发生偶合 出现裂分峰 并对邻近氢质子的偶合作用也不一样 双键同碳质子处于不对称取代时 CH2质子成为不等价 2 溴丙烯 单键带有双键性时 会产生不等价质子如 由于p 共轭 使C N键带有 双键性 不能旋转 因此NH2上的2个质子是不等价的 产生四重峰 又如 由于C N键的双键性质 使2个 CH3不等价 图谱上出现2个单峰 24 单键不能自由旋转时会产生不等价质子很多烷烃在室温下单键可自由旋转 但在低温下单键不能自由旋转 造成氢质子的化学环境不同 而产生不等价质子 如 如环己烷 室温下 1 43ppm s 冷冻环固定a H与e H成为不等价质子 如甾体 0 8 2 5ppm之间有复杂信号 苯环上的邻位质子有时是磁不等价的 虽然a a 化学位移相同 但Ja b Ja b对甲氧基硝基苯 最后 当然化学环境不同的氢质子 肯定为不等价质子如 25 核磁共振氢谱 1HNMR 一级耦合系统 高级耦合系统 V J 10 AnXm系统 An系统 AMX系统 V J 10 AB2系统 AB系统 ABX系统 解析1H 核磁共振谱的过程 1H 核磁共振谱 NuclearmagneticResonance 26 核磁共振氢谱 1HNMR AB系统 AB谱的解析程序 即求出JAB A B 由图中读出四条峰的位置 1 2 3 4 频率 HZ 求出JAB JAB 1 2 3 4 用直角三角形法求出A与B化学位移之差 AB V V照 以JAB作一直角边把 1 3或 2 作斜边 另一直角边就是 AB a 接在手性碳原子的亚甲基b 烯键氢 根据勾股定理 a2 b2 C2 AB2 1 3 2 JAB2 由这组峰的中点往左右各量出1 2 AB 即为 A和 B 各峰强度有如下关系 I1 I4 I2 I3I2 I1 I3 I4 1 4 2 3 27 核磁共振氢 1HNMR AB2系统 二侧取代基一样 AB2谱的解析程序 即求出JAB A B 由图中读出8条峰的位置 1 8 Hz 第9条峰不管 求出JAB JAB 1 3 1 4 6 8 求出 A 第3条谱线的读数是质子A的化学位移 即 A 3 求出 B 第5 7二条谱线的中心点是质子B2的化学位移 即 B 1 2 5 7 28 核磁共振氢谱 1HNMR ABX系统 二侧为不对称取代 29 核磁共振氢谱 1HNMR 解析程序 需要求出JAB JAX JBX A B X 认出AB部分的2个组 根据向心法则 上图一组为1 3 5 6及X组9 14另一组为2 4 7 8 由图谱中读出X部分和AB部分各峰的位置 1 8 10 14 求出 XX部分6条峰 或4条峰 的中心点为X质子的化学位移 同一级偶合系统 求出JAB上图JAB 1 3 5 6 2 4 7 8 与AB系统一样 AB部分二组中心点之间的距离为S JAX JBX 2S 决定2D 2D 分别将AB系统的二组第1峰与第3峰之间的距离用2D 2D 表示 利用JAB 2D 2D 作图 求出 AB和JAX JBX若X部分由6条谱线组成 则以JAB作一直角边 画一线与JAB垂直 以2D 做一斜边 2D 向外作另一斜边 组成二个直角三角形 那么a b的距离即为 I 1 2 JAX JBX AB b c的距离即为 II 1 2 JAX JBX ABa c的距离即为 III JAX JBX 核磁共振氢谱 1HNMR 30 若X部分由4条谱线组成 则以JAB作一直角边 画一线与JAB垂直 以2D 作一斜边 2D 向内作另一斜边 组成二个直角三角形 那么a b I JAX JBXb c II AB 1 2 JAX JBX a c III AB 1 2 JAX JBX 再由I II式或II III 作二元一次方程 解出 AB和JAX JBX 由以上JAX JBX 2S和JAX JBX 联立 求出JAX JBX 由图谱求出二组AB系统的各中心点 这二数值的平均值 1 2 A B 并由 求得的 AB A B解此联立方程求得 A B 核磁共振氢谱 1HNMR 核磁共振氢谱 1HNMR 31 若X部分由4条谱线组成 则以JAB作一直角边 画一线与JAB垂直 以2D 作一斜边 2D 向内作另一斜边 组成二个直角三角形 那么a b I JAX JBXb c II AB 1 2 JAX JBX a c III AB 1 2 JAX JBX 再由I II式或II III 作二元一次方程 解出 AB和JAX JBX 由以上JAX JBX 2S和JAX JBX 联立 求出JAX JBX 由图谱求出二组AB系统的各中心点 这二数值的平均值 1 2 A B 并由 求得的 AB A B解此联立方程求得 A B 核磁共振氢谱 1HNMR 32 33 核磁共振波谱NMR的现代应用 解析结构 同核或异核J分解谱 化学位移相关谱 多量子跃迁谱及化学交换 NOE二维谱 二维J分解谱 二维相关谱 二维J分解谱是使重叠在一起的一维谱的化学位移 和偶合常数J分解在平面两个坐标上 便于解析 二维相关谱是检测核的自旋偶合及偶极相互作用等核自旋间的相互作用的 二维谱信号是二个独立频率 或磁场 变量的函数 记为S 1 2 共振信号分布在两个频率轴组成的平面上 34 核磁共振波谱NMR的现代应用 二维核磁共振时间轴 预备期 发展期 混合期 检出期预备期 预备期在时间轴上通常是一个较长的时期 它使实验前的体系能回复到平衡状态 发展期 t1 在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发 使之处于非平衡状态 发展期的时间t1是变化的 混合期 tm 在这个时期建立信号检出的条件 混合期有可能不存在 它不是必不可少的 视二维谱的种类而定 检出期 t2 在检出期内以通常方式检出FID信号 35 核磁共振波谱NMR的现代应用 Beforemixing Aftermixing Coupledspins 2DNMR CouplingistheKey 36 去偶差光谱DDS NOE差光谱 INEPT谱 二维NMR谱 2D分解谱 2D相关谱 DEPT谱 Modernapplication 核磁共振波谱NMR的现代应用 2D INADEQUATE谱 HMQC谱及TOCSY谱 37 化学位移相关谱 1H检测的异核多量子相干实验 1H检测的异核单量子相干实验 1H检测的异核多键相干实验 通过异核多量子相干实验把1H核和远程偶合的13C核相关联起来 都显示1H核和与其直接相连的13C核的相关峰 其作用相当于C H CosY谱 远程13C 1H CosY 38 NOESY谱空间相近的1H核关系 NOE NOE差光谱 NOESY谱 观察到整个分子中质子间在立体空间中的相互联系 推定分子结构 特别是分子的立体结构 当Ha与Hb空间靠近 通过照射Ha使其饱和 Hb强度增加 NOE效应 39 多量子2D NMR谱 2DINADEQUATE实验 2DINEPT INADEQUATE实验 多量子2D NMR谱 直接测定13C 13C间连接关系 横轴为13C化学位移 纵轴为双量子相干频率 相互偶合的两个碳原子作为一对双键排列在同一水平线上 40 极化转移增益法 用来克服偏共振实验中共振谱线发生重叠和指配复杂分子的谱时的一些困难 可以准确指配CH CH2 CH3和季碳测量时间比偏共振短 无畸变极化转移增益法 INEPT谱 DEPT谱 低灵敏核的极化转移增益法 把高灵敏核1H的自旋极化传递到低灵敏核13C上去 DEPT实验克服了INEPT实验中某些缺点 如INEPT实验中强度比和相位畸变等问题 各种碳的信号强度与 的关系为 CH I IoSin 2 JCH CH2 I IoSin 4 JCH CH3 I 0 75Io Sin 2 JCH Sin 6 JCH 信号强度仅与 脉冲倾倒角有关CH I IoSin CH2 I IoSin2 CH3 I 0 75Io Sin Sin3 季碳的信号不出现 41 核磁共振波谱NMR的现代应用 xanthatin苍耳亭 IrvingRamirez erosa 指出苍耳亭是抗癌活性成分 42 核磁共