【毕业学位论文】（Word原稿）VEGF和TGF-β1在肝再生过程中的表达研究

1 英文缩写索引 缩写 英文全称 中文全称 管内皮生长因子 化生长因子 瘤坏死因子 细胞生长因子 择性门静脉栓塞 胞外基质 管内皮细胞 肝窦内皮细胞 管活性物质内皮素 氧化氮 因子相关抗原 星状细胞 根过氧化物酶 白免疫印迹 道尔顿 丙烯酰胺胶电泳 酸盐缓冲液 偏二氟乙烯 膜缓冲液 甲基 磺酰氟 二烷基磺酸钠 2 在 肝再生 过程中的表达 研究 研究背景及 立题 依据 原发性肝癌是一种常见的肝脏疾病，尤其在我国发病率更高，在恶性肿瘤中男性占第三位，女性占第四位，每年约有 10万人死于该病 1。早期诊断与治疗是提高肝癌疗效的关键，肝部分切除是治疗肝脏肿瘤的首选方法 , 但临床上此类患者多以中晚期为主 , 过多的肝切除量易导致术后残留肝脏组织功能不足，不能代偿肝脏功能，易导致肝功能衰竭乃至死亡 , 因而仅有 15患者有机 会手术2，虽然肝脏手术的安全性已大为提高，但是切除术后残留肝脏的功能不足仍然是手术的一个主要风险。 1920年 现结扎兔子的门静脉分支，可以导致受累肝叶的萎缩和非受累肝叶的肥大这一现象。 1975年 等人发现对不能行肝脏切除的肝癌病人，试行门静脉分支结扎后，结果发现了门静脉分支结扎后的肝叶以及其中的肿瘤发生了萎缩而非结扎肝叶增生肥大现象。 80年代， 等人发现，若被切除一侧的肝叶的门静脉被瘤栓阻塞，则对侧的肝叶常发生增生肥大，同时发现术后过程平 稳，可以避免门静脉压骤升等现象的发生。到现在 5， 6， 7。 血管内皮生长因子 （ 是一种重要的血管生成因子，也是人体内最强的一种血管生长因子，是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原 8， 9，包括多种亚型： 等 10， 11， 12，其具有增加血管的通透性、促进内皮细胞的增殖、促进血管的生成尤其刺激肿瘤 血管生成等重要的生物学功能，在促进肝再生的过程中起重要作用 13。 转化生长因子 （ 是一类具有多种生物学功能的细胞因子，在肝纤维化的发生、发展过程中起着重要的作用，它可调控细胞增殖与分化，促进细胞外基质的合成和分泌，减少细胞外基质的降解，并在生物体血管形成、胚胎发育、组织修复、免疫调节、肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要作用，其高表达具有促组织发生纤维化的病理作用，且与病理上肝纤维化程度相平行。也有文献研究表明，转化生长因子 1与肝再生 的终止过程有关 14， 15。 3 肝脏的细胞由肝实质细胞和非实质细胞组成，其中实质细胞也就是肝细胞约占肝脏内细胞总数的 80%，而非 实质细胞（包括肝窦内皮细胞、星状细胞、树突状细胞、淋巴细胞、库 弗细胞等）约占 20%。这些细胞具有不同的分化来源和不同的结构功能，连同肝细胞一起共同调节着全身和局部的免疫功能、消化功能、解毒功能及内分泌功能等 16， 17。 肝脏作为人体的一个重要的消化器官，具有代谢、解毒和内分泌功能，同时具有强大 的 再生能力 18。肝再生是指因各种因素如肝脏切除、感染、中毒、肝移植等导致肝脏部分性 损伤而引起的肝修复过程。肝再生主要分为三个阶段，起始阶段即静止的肝细胞重新进入细胞周期；增殖阶段主要指肝细胞在多种细胞增殖因子的刺激下进入细胞周期的 细胞增殖事件完成后，肝脏的组织化学结构重新排列和恢复，肝再生便进入终止阶段 19， 20。 随着对肝脏再生的研究不断深入，逐渐认识到肝再生是一个既特殊又复杂的过程，正常静止的肝细胞重新进入细胞增殖周期，实质和非实质细胞进行分裂，逐渐恢复正常的肝脏结构 14， 21。在此过程中，伴随着血流动力学、肝脏非实质细胞、肝细胞及多种细胞因子的变化。复习文献研究发 现，大鼠肝脏部分栓塞后 3天，血窦内皮细胞开始增殖，术后 6天再生肝小叶血窦结构初步重建， 22， 23。 肝脏接受双重血液供应， 20%的血液来源于肝动脉， 80%的血液来源于门静脉。肝动脉和门静脉的血液汇入肝窦。门脉终支的血流缓慢进入肝窦，而肝动脉终支的血流以间歇性喷射状的形式进入肝窦，因两股血流内压力不同，共同进入肝窦前形成一条血压低、流速慢的血流。虽然肝动脉血流较少，但发挥着重要作用，为肝窦血流提供驱动力，维持其平稳性及连续性，并且为肝窦胆管、门静脉和肝门束 神经供氧 24。 本实验以 鼠的肝脏结构和人的肝脏结构不同，门静脉左支供应左叶、左中叶、右中叶和乳突叶，其左支供应肝叶约占全肝重量的70%。门静脉左支被栓塞后，约 70%的肝叶失去了约 80%的血流量和 50%的氧供应，更重要的是失去了供给肝组织代谢的富营养的肠道回流血液，使肝脏的的主要功能被剥夺，导致肝细胞发生一系列的萎缩、变性、凋亡、坏死等病理变化。同时，未被栓塞侧肝叶血流增加，肝叶出现代偿性增生 25， 26。 术前选择性门静脉栓塞 （ 是近年来肝脏外科的新进展，这一技术首先由 27于 1984年首先应用于肝门胆管癌，后来被逐渐应用于原发性肝癌、胆囊癌和大肠转移癌等。其常用技术方法有两种：（ 1）局麻后在 ） 经皮经肝门静脉穿刺途径，一般经栓塞侧门静脉分支进入；（ 2）开腹后，经回结肠静脉途径，该法特别适用 4 于结肠癌肝转移的患者，即第一次手术在切除原发灶的同时行经回结肠静脉插入导管栓塞病灶所在肝叶的门静脉 28，第二次再手术切除肝转移灶。 果相当 29。 目前常用的栓塞剂有明胶海绵、不锈钢圈 +明胶海绵、无水酒精、 碘油等。本实验选择无水酒精栓塞，其是一种永久性栓塞剂，呈液态，价廉、无黏性，可通过细小导管栓塞较粗血管。注射后可使血细胞破坏、血浆蛋白凝固、沉淀、集聚， 使 血管内皮细胞脱水、坏死、脱落后导致血栓形成，造成血管永久性栓塞。同时，无水酒精栓塞血管后， 可使栓塞侧肝叶的 80%栓塞， 不易建立侧枝循环，比较可靠稳定 30。 综上所述，选择性门静脉栓塞使栓塞侧肝叶萎缩 ,非栓塞侧肝叶代偿性再生 ,能有效增 大预计残余肝的体积 , 从而提高肿瘤切除率，降低术后肝衰发生率。肝再生的启动和增殖阶段：胰岛素等序贯激活，协同刺激成熟肝细胞通过细胞周期节点而增殖分裂，研究发现 再生终止阶段：肝细胞增殖活性下调，血窦重建，推测 31从临床角度出发，只有功能性的门静脉血流 流 经再生肝小叶，再生的肝组织才能发挥其生物学作用 24。因而探讨 中的相关因子的表达变化，以及这些因子如何影响肝再生的过程，具有重要意义，但目前该领域研究比较少。 本实验拟通过使用无水酒精选择性栓塞大鼠门静脉左支，构建 2/3讨 5 材料和方法 1 实验材料 料准备 鼠 （兰州大学 实验 动物中心 ,动物批号为 :兰大动检 (06)第 004 号） 无水乙醇（北京北化精细化学品公司） 乙醚（天津市富宇精细化工有限公司） 甲醛溶液（天津市致远化学试剂股份有限公司） 氯化钠（山东莱阳双双化工有限公司） 氯化钾（北京市朝阳区化肥厂） 磷酸氢二钠（无水）（广东汕头市红卫化工厂） 磷酸二氢钾（无水）（北京化工厂） 防脱磨砂载玻片（北京中衫） 各种规格的吸头、离心管（ 要试剂及耗材 (1)免疫组化试剂盒 北京中杉金桥生物有限公司 溶液 A， 内源性过氧化物酶阻断剂 溶液 B， 封闭用正常山羊或兔血清工作液 溶液 C， 生物素标记羊抗兔 /大鼠 /小鼠 /豚鼠 溶液 D， 辣根酶标记链酶卵白素工作液 (2)3% 京中杉金桥生物有限公司 (3)色剂 北京中杉金桥生物有限公司 (4) 司 (5)云天公司 (6)解液 碧云天公司 (7)敏发光液 北京普利莱基因技术有限公司 6 (8)克隆抗体 北京中杉金桥生物有限公司 (9) 纸 上海生工 (10)一抗：兔抗鼠 多克隆抗体 (11)一抗：兔抗鼠 克隆抗体 北京博奥森生物技术有限公司 北京博奥森生物技术有限公司 (12)记的山羊 抗鼠 体 北京中杉金桥生物有限公司 (13)记的山羊抗兔 体 北京中杉金桥生物有限公司 (14)海生工 (15)甲醇 天津市富宇精细化工有限公司 (16)浓盐酸 北京北化精细化学品公司 (17)国 司 (18)州鹏程生物有限公司 (19)氨酸） 兰州鹏程生物有限公司 (20) 巯基乙醇） 兰州鹏程生物有限公司 (21)烯酰胺） 兰州鹏程生 物有限公司 (22)过硫酸铵 兰州鹏程生物有限公司 (23)二烷基硫酸钠） 上海生工 (24)海生工 (25)显影粉 北京中杉金桥生物有限公司 (26)定影粉 北京中杉金桥生物有限公司 (27)不同浓度的二甲苯与乙醇、苏木素、分化液 兰州大学第二医院病理科提供 要配制试剂 (1) 称取 g， 2O 超纯水 1000其 为 温高压灭菌后保存。 (2)10%过硫酸铵： 称取 硫酸铵干粉，加入 1纯水 中溶解后， 4保存，一周内使用。 7 (3) 30% 烯酰胺）： 称取丙烯酰胺 29g，甲叉丙烯酰胺 1g，加超纯水至 100 室温保存。 (4)10% 称取 粉 1g，加入 10纯水， 5060加热至完全溶解后，室温保存。 (5) 10 称 4g， 0g， 浓盐酸 4加 超纯水定容 至 5004保存备用。 (6) 称取 入 100纯水中，浓盐酸调其 为 温高压灭菌后室温保存。 (7) 称取 入 100纯水中，浓盐酸调其 为 温高压灭菌后室温保存。 (8) 5 品缓冲液 ： 取 取 粉 5甘油 超纯水定容至 5分溶解混匀 ， 分装 后 4保存备用。用时每 500l 的 5 品缓冲液 加入 25l 的 (9) 1 取 10 0加 超纯水 稀释 至 100混匀 。 (10) 膜封闭液 (5%脱脂奶粉 )： 脱脂奶粉 1 0全溶解后 4保存，现配现用。 (11) 2 阳极转膜缓冲液： 称取 醇溶液 100超纯水定容至 500 H 值至 室温保存。 (12) 2 阳极转膜缓冲液： 称取 醇溶液 100超纯水定容至 500 其 至 室温保存。 (13) 1阳极电泳缓冲液： 取 2 阳极转膜缓冲液 10超纯水稀释至 20混匀。 (14) 1阳极电泳缓冲液： 取 2 阳极转膜缓冲液 10超纯水稀释至 20混匀。 (15) 1阴极电泳缓冲液： 8 取 4 阴极转膜缓冲液 5超纯水稀释至 20混匀。 (16) 4 阴极转膜缓冲液 ： 称 取 g，甲醇溶液 200超纯水定容至 500 其 至 室温保存。 (17) 10 称取 粉 入异丙醇 10粉状 分溶解后，2分装， 存备用。 (18) 1 取 10 0 超纯水 稀释 至 100混匀 。 (19) 10 称取 粉 5g，加超纯水至 500温保存。 (20) 显影液： 小袋定影液 药粉加入 200纯水， 50充分溶解后，加入大袋定影液药粉，再用超纯水定容至 1000室温保存。 (21) 定影液： 定影液药粉中加入超纯水 100025充分溶解后室温保存。 要仪器 (1)电子天平（ 日本 A&D 公司 (2)轮转式切片机漂烘片机（ 上海徕卡仪器有限公司 (3)电热恒温培养箱（ ） 常州市雅博电子设备有限公司 (4)微量振荡器（ 姜堰市新康医疗器械有限公司 (5)台式高速冷冻速离心机（ 长沙湘仪离心 机仪器有限公司 (6)低速台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司 (7)微型离心机（ 长沙湘仪离心机仪器有限公司 (8)0低温冰箱 (9)温冰箱 青岛海尔股份有限公司 青岛海尔股份有限公司 (10)温冰箱 青岛海尔股份有限公司 (11)温冰箱 青岛海尔股份有限公司 9 (12)医用超声波清洗机 宁波海曙科生超声设备有限公司 (13)半干转膜仪 美国 司 (14)电泳槽 美国 司 (15)电泳仪 美国 司 (16)恒温培养摇床（ ） 上海一恒科技有限公司 (17)恒温金属浴（ 上海蓝豹实验仪器有限公司 (18)电热恒温培养箱（ ） 北京科伟永兴仪器有限公司 (19)立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂 (20)恒控磁力搅拌器（ ） 温州市医疗电器厂 (21)电热鼓风干燥箱 （ ） 上海一恒科技有限公司 (22)超纯水仪 爱思泰克（ 司 (23)可调式微量移液器 德国 司 (24)微量核酸蛋白检测仪 美国 司 2 实验方法 物分组、构建 型及标本采集 （ 1） 清洁级健康雄性 鼠 50 只，体重 150 200g(兰州大学实验动物中心 )，饲育在 22 室温，光照周期 12h： 12h 环境，随意进食及饮水。随机分为 按照术后 1分为 9 组，每组 5 只；正常组对照组 5只。 （ 2） ：采用乙醚吸入麻醉大鼠，固定妥当后，碘伏消毒后，选腹正中切口，显露肝脏，分离门静脉左支，临时阻断左外叶、左内叶门静脉，注射无水乙醇 塞组织约占全肝 70%， 不完全性阻塞被栓塞 侧 80%叶的血供， 构建 2/3 型 36。 （ 3） 分别在术后 1处死 大鼠，获取不同时间段的再生后肝脏组织。正常组不行任何特殊处理，直接获取肝脏组织。将获得的肝脏组织在无菌生理盐水中轻轻漂洗，将血液漂洗干净后，将部分肝叶放入事先配置好的 10%甲醛中固定，浸泡 4 小时后换新鲜 4%甲醛中固定，浸泡 2后，行免疫组化检测 10 达。 （ 4） 将在无菌生理盐水中漂洗后剩下的肝组织剪为大小相等的组织后，放入事先灭菌的冻存管中，标记组号及组织名称， 温冰箱保存，留作 疫组织化学方法检测肝脏组织 表达 将 10%甲醛中固定的肝组织，经过取材、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，按照免疫组化试剂盒 （ 1） 取材：用锋利的 刀片 切取规格为 20织块 。 （ 2） 冲洗： 将 10%甲醛中固定的肝组织 取出后， 在纯水中冲洗 3次 。 （ 3）脱水与透明：将漂洗好的材料依次从 35%酒精开始进行脱水，每梯度 70%酒精过夜，次日将组织从 70%酒精中取出，依次放入 85%乙醇、 95%乙醇、 100%乙醇（浸泡两次）、 1/2二甲苯 、二甲苯（浸泡两次），每次 2小时，然后透蜡。 （ 4）透蜡：选取适当熔点的石蜡，熔化，分装在 1号、 2号、 3号三个蜡杯内，置入烘箱（ 55 65 ）。 1号蜡杯为 1/2二甲苯和 1/2石蜡， 2号和 3号蜡杯为熔化好的石蜡。另外再备一杯石蜡，供包埋使用，也置于烘箱内，控制好烘箱的温度，保持恒定。将已透明的组织从二甲苯中取出，放入蜡杯 12小时后，再放入蜡杯 2、蜡杯 3中 2小时即可包埋。 （ 5）包埋：将包埋用的吸管、小镊子等放 入熔蜡箱内，使之温热。将石蜡通过温热吸管注入折好的纸盒内，用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置。将纸盒一半浸入冷水中，待表面石蜡凝成一层膜后，将纸盒迅速全部浸入冷水中，待石蜡全部凝结变硬后取出。 （ 6）修切蜡块：把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形，组织四周留有少许石蜡，蜡块两边切成平行的直线，以免切下的蜡条弯曲。 （ 7）石蜡切片：将蜡块夹在轮转式切片机上的蜡块钳内，确保蜡块与切片刀刃平行后旋紧，连续定向切片，厚度为 3 m，附于预先消毒并经脱片剂处理过的载玻片上后，放入 60 烤片箱中烤片 30分钟； (8) 脱蜡水化：切片依次放入二甲苯、二甲苯及梯度乙醇中（ 100%、95%、 80%）各 5分钟进行脱蜡水化后，依次用自来水和蒸馏水充分冲洗，并置入 分钟 ； (9) 去除内源性过氧化物酶：甩干水后，滴加 3% ）室温孵育 10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性； 11 (10) 抗原修复：将切片放入配置好的柠檬酸缓冲液中在高压锅内修复10分钟后待自然降温后，取出切片并用自来水充分冲洗； (11) 清洗： 于振荡仪上 2分钟 3次； (12) 封闭：滴加封闭 液（即 ），室温孵育 10分钟，倾倒血清，勿洗； (13) 孵育一抗：按照工作液浓度 1:400，将浓缩型的兔抗鼠 入 37 孵箱中孵育 2小时； (14) 清洗： 于振荡仪上 2分钟 3次； (15) 孵育二抗：滴加生物素标记的二抗工作液（即 ，放入 37孵箱中孵育 20分钟； (16) 清洗： 于振荡仪上 2分钟 3次； (17) 滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液（即 ）后，放入 37 孵箱中 孵育 20分钟； (18) 清洗： 于振荡仪上 2分钟 3次； (19) 显色剂显色（ 使用 1、B、 匀后适度滴加于切片上，室温放置数分钟，显微镜下观察显色结果，阳性部位出现特异性显色而背景无着色时，自来水充分冲洗，终止染色； (20) 复染：将冲洗后的切片放入苏木素染液中轻度复染后以盐酸酒精分化数秒； (21) 脱水，透明后用中性树脂胶封片； (22) 同法行 的免疫组化。 (23) 显微镜下观察，照相 并计数 。 白样品的制备 (1) 组织总蛋白提取： 取 箱保存的组织块，将少量组织块置于 1干净的剪刀将组织块尽量剪碎，手工研磨后每例标本加入 1355入冰水超声清洗仪中振荡裂解 30分钟。 4 下 12000 心 30 分钟后，取上清，分装于 心管中，样品编号后保存于 低温冰箱。 (2) 总蛋白浓度测定： 用美国 000）测定提取 12 的蛋白样品浓度。 泳 (1) 清洗玻璃板： 指尖蘸取适量肥皂水轻轻擦洗玻璃板两面，直至感觉无异物后，用自来水充分冲洗无滑腻感，再用蒸馏水冲洗数遍，用吹风机吹干两面后立于自制支架上备用。 (2) 制胶与灌胶： 两个玻璃板对齐后垂直插入玻璃板夹中卡紧，卡在架上并确保底部紧密，配置好胶后准备灌胶。 配制 12%分离胶，混匀后灌胶至距玻板顶端约 2，较厚度为 超纯水封顶压线约 30 分钟；待胶凝固后（即水与胶之间有一明显的折射线时）， 倾斜胶槽倒去超纯水并用滤纸吸干水；配制浓缩胶，并灌胶至玻板顶端，快速插入梳子；当浓缩胶凝固后（即梳齿和胶之间出现可见的空隙），两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拔出，用蒸馏水冲洗后放入电泳槽中。（配制分离胶、浓缩胶的试剂和用量见表 1；） 表 1 分离胶、浓缩胶配制表 试剂 用量 (分离胶 0% 0%0%过硫酸铵 缩胶 0% 0%0%过硫酸铵 13 (3) 上样： 取 60g 样品稀释成 16l，与 4l 5加样缓冲液混匀，金属浴锅 100煮沸5 分钟，低速短时离心；电泳槽中加入足够的电泳液后用微量移样器加样，并留一孔加蛋白分子量 (4) 电泳： 先在 80V 恒压条件下电泳，待样品跑出浓缩胶 (即 始分离 ) ，换120V 恒 压电泳直至样品移至分离胶底时停止； (5) 转膜： 准备五个废弃的 96 孔板盒的盖子，洗干净用蒸馏水充分冲洗后吹干备用； 分别往上述准备好的盖子中倒入适量的 1阳极电泳缓冲液、 1阳极电泳缓冲液、 1阴极电泳缓冲液、无水甲醇和超纯水并进行标记； 取下凝胶，按 志切下内参或目的蛋白所在的凝胶带用直尺测量其长宽后，放入 1阴极电泳缓冲液中浸泡 20 分钟； 裁剪和切下的凝胶一样大小的 6 张滤纸，三张浸泡于 1阴极电泳缓冲液中，两张浸泡于 1阳极电泳缓冲液中，一张浸泡于 1阳极电泳缓冲液中； 裁剪和切下的凝胶一样大小的 1 张 ，将膜在无水甲醇中活化 15 秒后放入超纯水中 2 分钟，最后放入 1阳极电泳缓冲液中浸泡 5 分钟； 将浸泡的滤纸、凝胶和 按照从底层到顶层为阳极到阴极的顺序置入半干转膜仪中：两张浸泡于 1阳极电泳缓冲液中的滤纸、一张浸泡于 1阳极电泳缓冲液中的滤纸、 、凝胶、三张浸泡于 1阴极电泳缓冲液中的滤纸。各层的各边要精确对齐并用玻璃棒均匀碾压排除各层间的气泡以防止短路； 按照 15V 的恒压电流转膜 15 分钟； 转膜完成后，将 取出并剪掉右上角作为标记 （以便明确正反面和所加样品顺序）。 (6) 封闭： 将 放入有封闭液的培养皿中置入恒温摇床以室温、 60 转 /分钟条件下封闭 2 小时； (7) 孵育一抗： 将封闭好的 分别放入抗体为 克隆抗体 (工作浓度为1:1000)、兔抗鼠 克隆抗体和兔抗鼠 多克隆抗体 (工作浓度为 1:1000)的 5抗稀释缓冲液中， 4孵育过夜或恒温摇床以室温、 60 转/分钟条件下孵育 2 小时； (8) 洗膜： 14 用 1 膜液在恒温摇床以室温、 60 转 /分钟条件下洗膜 5 次， 5 分钟/次； (9) 孵育二抗： 将洗好的膜分别放入抗体为 根过氧化物酶） 标记的山羊抗鼠 工作浓度为 1:5000)和 根过氧化物酶） 标记的山羊抗兔 体 (工作浓度为 1:5000)的 10抗稀释缓冲液中，置入恒温摇床以室温、60 转 /分钟条件下孵育 2 小时； (10)洗膜： 用 1 膜液在恒温摇床以室温、 60 转 /分钟条件下洗膜 5 次， 5 分钟/次； (11)色： 用微量移液器取 剂盒中的试剂 A 和试剂 B 等体积移至小培养皿中混匀后室温放置 1 分钟； 在暗盒中按照 平铺适量大 小的的保鲜膜，将膜从培养皿中取出，以含有蛋白的面朝上的方向放在平铺的保鲜膜上并用滤纸吸走 多余 的液体； 将配制好的试剂 A 和试剂 B 混合液用微量移液器均匀滴到 上； 用保鲜膜包好 并确保无气泡，如果有液体从保鲜膜周边流出，应用滤纸吸干净；然后在暗室内曝光。 (12)显影和定影： 在暗室内，准备好三个大小适中的容器，分别倒入配好的显影液、定影液和蒸馏水； 在红灯下裁剪长宽略比 胶片放在包有 的保鲜膜上，关上暗盒并开始计时，根据信号的强弱调整曝光时间； 曝光 结束后，打开暗盒取出 其浸入显影液中约 40 秒，然后取出放入蒸馏水中清洗几遍，再浸入定影液中约 40 秒，用蒸馏水冲洗几遍后，室温晾干。 (13)用数码相机给胶片拍照后用 件扫描 灰度值进行定量分 析。 计分析 所得数据均采用均数标准 差 （ x s）表示，采用 计软件进行数据处理。组内采用单因素方差 分析 比较，组间比较采用配对 t 检验，p差异有统计学意义。 15 结 果 1 后肝脏组织变化的 肉 眼 观察： 大鼠肝脏门静脉的左支主要供应全肝约 70%的左外叶和左内叶。 后约 10见被栓塞的左外叶和左內叶立即变为暗红色缺血状态，而未被栓塞的肝叶仍为鲜红色，对比明显。 栓塞后一天，腹腔内 开始出现 少量渗出，肝组织轻微肿胀，栓塞的肝叶呈现局灶性灰白色改变，质地稍微变硬。栓塞后第三天，可见较为明显的 肝叶萎缩 ，主要是栓塞侧肝叶，与周围组织纤维素性粘连，被栓塞的肝叶可见局灶性的坏死点，轻度萎缩，质地变硬，未被栓塞的肝叶增生肥大约 1/3。术后第五天，可见被栓塞的肝叶明显萎缩变硬，呈纤维化改变，未被栓塞 的肝叶增生肥大约达正常肝脏的 70%。术后第七天及第九天，可见栓塞侧肝叶萎缩，硬化，体积明显缩小，未被栓塞的肝叶增生至约正常肝脏体积大小，腹腔内 伴有明显的粘连 。 2 疫组化检测结果 ： 常肝脏 组织 内可见含量极少的的棕黄色颗粒，在 后第一天， 达开始升高，在术后第五天达到最高水平，可见广泛的肝组织内阳性着色，随后开始逐渐下降，约在术后第七天，降低到正常水平。与对照组相比，实验组术后第一天和第三天， 达开始升高，在第五天明显升高， 达到高峰，随后开始下降（表 2、图 1、图 5）。 免疫组织化学染色及图像分析：正常肝脏血窦内皮细胞内可见含量极少的的棕黄色颗粒，在 表达亦开始升高，但升高速度较慢，在术后第七天达到最高水平，可见广泛的肝组织内阳性着色，随后约在术后第九天开始逐渐下降，但其下降速度较 对照组相比，实验组术后第一天和第三天升高不明显，在第五天和第七天表达明显升高，并达高峰，第九天，其开始下降 ，逐渐恢复正常水平 （表 2、图 2、图 6）。 16 表 2 疫组化检测结 果（ x s， n=5） 组别 术后 1 天 术后 3 天 术后 5 天 术后 7 天 术后 9 天 手术组 常组 1 疫组化表达条状图 图 2 免疫组化表达条状图 17 3 测结果： 术方法检测 在 及正常肝脏组织中的表达情况。 蛋白分子量是 34 后 1及正常组的肝脏组织为材料，用蛋白免疫印迹方法检测 含量表明， 后， 达第一天即开始出现升高，其表达水平明显高于 ，约在第五天达到高峰水平，随后逐渐下降，约在术后第九天开始逐渐接近正常水平（表 3、图 3、图 7）。 的蛋白分子量是 25样以 后 1及正常组的肝脏组织为材料，用蛋白免疫印迹方法检测 的含量表明， 后， 表达较 慢升高且表达高峰时间出现较迟，约在 后第三天开始升高，第七天开始达到高峰水平，随后缓慢下降，在 后的增生后期下降较 慢（表 3、图 4、图 7）。（内参 子量 43 7) 表 3 白表达水平（ x s， n=5） 组别 术后 1天 术后 3天 术后 5天 术后 7天 术后 9天 手术组 常组 18 图 3 达条状图 图 4 达条状图 19 讨 论 肝再生的研究对肝功能衰竭的预防、肝功能的恢复及指导外科肝切除术具有非常重要的意义，而直接行肝脏切除术，术后容易出现肝功能衰竭 37。近年来，通过选择性门静脉栓塞（ ，既可以 使 病变肝叶萎缩，又能够使代偿肝叶 增生肥大 ，从而降低肝切除术后肝功能衰竭的发生率。肝再生过程和肝再生机制非常复杂，肝再生如何启动又如 何终止？目前仍不清楚。 一、肝窦内皮细胞、 肝再生 肝窦内皮细胞（ 数量最多的非实质细胞，占非实质细胞的44%具有特殊的窗孔化结构，具有吞噬功能、抗原提呈功能、血流调节功能。 肝细胞再生的“感受器”，其位置特殊，肝窦能够最先感受血流的急剧变化而导致剪切力的改变，从而激活肿瘤坏死因子 转化生长因子 血管内皮生长因子（ 白介素 一氧化氮合酶、肝细胞生长因子（ ，正是由于这些细胞生长因子和细胞因子在在肝再生 过 程 中发挥了重要的作用 38， 39。 选择性门静脉栓塞术 阻塞被栓塞侧肝叶 80%血流供应， 导致肝内微环境的改变，通过某种方式激活 泌产生多种循环物质，这些细胞因子能够在早期促进肝细胞的 成，促进肝细胞分裂。 肝脏微循环、内分泌代谢等密切相关。肝窦内皮细胞除了在正常肝组织具有重要的生物学功能外，在急慢性肝损伤及肝纤维化发展中、特别是在肿瘤形成中具有重要作用40， 41。 ， 未 栓塞侧肝叶不断肥大，肝细胞增生活跃，门静脉分支显著扩张， 42用彩色多普勒超声证 明， 未栓塞侧肝叶体积的增长速率与其门静脉血流速率的提高密切相关。推测 ，未栓塞侧肝叶的体积增大并非单纯淤血、水肿的缘故，可能与富含促肝细胞生长的各种成分的门静脉血供增加，未栓塞侧肝叶的肝细胞增殖、肥大所致 42， 43。增生部分的肝脏具有正常的功能，所以术前 以增加肝脏的储备功能，有利于减少术后肝衰竭的发生，同时有利于扩大肝癌的手术指征。 关于能够维持正常肝脏功能的的 剩余 肝脏最小体积，目前尚无一直观点。4等报道的 16 例患者中，尽管有 8 例的 剩余 肝脏体积不足 25%（最 小者仅占 ，但仍成功进行了手术切除，术后仅有 1 例出现肝功能衰竭，其余均未出现肝功能衰竭。 5等认为肝脏功能正常者， 25%的 剩余 肝脏可能 20 已足够。杨维竹 46等研究显示，采用门静脉穿刺插管的方法，对 36 例肝癌患者成功施行门静脉右支栓塞，成功率 100%， 2较 左肝体积显著增大。其中 28 例（ 在 后 4 周左侧肝叶 /整个肝脏比例达到 25%，具备手术指征。其中 2 例 最终接受右肝切除，未出现肝功能衰竭等并发症，切除后肝脏继续代偿增生。 二 的表达 肝癌治疗的首选方法是手术切除。但目前微小肝癌的早期发现率仍然很低，多数病人就诊时已属晚期 47，肿瘤较大而余肝过小，或伴有严重的肝硬化，术后极易出现肝功能衰竭而失去了手术机会，而造成这一并发症的主要原因是残留肝脏组织一时不足以代偿肝脏功能。 在发展成为肝脏外科的一个重要的辅助措施，近年来 研究工作受到重视，临床上门静脉结扎或栓塞已广泛应用于肝癌病人的治疗 48，结合化疗药物和手术切除，已取得较好的疗效。此外， 可提高规则性肝段切除的准确性，预防癌细胞经门静 脉途径播散，减少术中出血量，提高中晚期患者的生存率，临床上已得到初步证实 49， 50。 肝脏有肝动脉和门静脉的双重供血，门静脉的结构与肝动脉有许多不同之处，门静脉系统缺乏血管平滑肌，没有小的括约肌来调节血流量，也没有像肝动脉那样的侧枝循环存在，内腔直径大于同水平的肝动脉分支， 肝动脉血流较少，但 发挥着重要作用，为肝窦血流提供驱动力，维持其平稳性及连续性，并且为肝窦胆管 、 门静脉和肝门束神经供氧 51。 吴晓凤 39等研究表明， 使 被栓塞侧肝叶明显萎缩。原占肝重近 70%的肝叶， 7d 降至 30%， 14d 后降至 15%， 30d 后降至 8%。光镜下见门静脉分支内血栓形成，肝组织大片凝固性坏死，周围炎性细胞浸润，纤维组织增生，最后全部被纤维网状结构 组织 代替。 肝功能有一定的损害，主要表现为血清转氨酶的一过性升高，多在两周内恢复至术前水平。 本研究也表明对于正常大鼠的 70%肝叶门静脉分支 栓塞 是安全可行的，提示先经过门静脉分支栓塞的预处理，