【毕业学位论文】（Word原稿）细胞分裂素在植物体内的信号传导

1 第一章 引 言 外界温度在四季变化和昼夜交替的过程中不断的变化。而植物的生理活动也会因感受温度的改变相应的做出调整（ et 2008）。有研究表明温度的受体存在于质膜上（ . et et 2006)(et 2006)( ., et 度对植物生长发育的影响 温度是影响植物生长发育的一个极其重要的因素。植 物在感应高温和低温后，其本身的生长发育也会此而产生变化（图 1） (et 2008）。植物对于温度变化的感受非常灵敏，例如莴苣的种子在温度为 32 的条件下萌发正常，但当转到高 1 的温度条件下其萌发率受到了强烈的抑制（ et 2005）。温度也会通过其他途径参与植物的生理活动并对植物生理活动产生一定促进或抑制的效应。现今对于温度的急剧变化而引起的植物物候学这一系统的研究知之甚少（ et 2006）。但对于温度变化范围较小时， 它对植物生理活动产生影响的研究却有一定的了解，这种温度的变化会对植物种子的萌发速率和开花时间等产生一定的影响 (et 2008)（图 2）。全球变暖之所以成为世界性话题是因其会影响到植物的生长发育，尤其是对经济作物育性的影响并进一步引起经济体系的改变（ et 2008），所以现阶段对温度的研究大部分集中在高温影响植物生长方面。 图 1 模式植物对外界环境温度的响应范围示意图 2 (79:615 图 2 温度影响植物模式图（ 23: 25682580, 2011） 温对植物生长发育的影响 低温会导致植物一部分生理和生化特性的改变 ( F et 2007)。它通过热力学效应来影响酶的催化反应，例如通过降低膜的流动性使得物质跨膜运输速度的减缓或降低其他细胞的活性等 (Z et 2000)，或通过细胞代谢重组影响基因的表达，蛋白的组成和膜结构的成分 (S.J et 2000)。当植物被暴露在非冰冻的低温环境中，它们会通过提高自身冷耐受的能力来适应温度的降低。在最近几年的研究中，我们注意到植物对于冷的耐受与碳水化和物的主要代谢途径的改变有十分密切的关系 (C.L et 1992) ( et 2001) ( et 2004) 。其中糖作为细胞膜的抗冷冻剂可能起到主要的作用但更多的是作为其他抗冷冻保护剂的底物发挥作用，例如已被证实的棉籽糖在冻害环境下对光合作用机制的保护 (M et 2011)。大部分参与低温信号的响应因子在其它胁迫条件下的途径中也会涉及到 ( et 2002)，其中可能涉及到包括 道，双元件组氨酸激酶和 G 蛋白受体等 ( et 2002)。参与组成细胞骨架的微丝和微管不仅会参与细胞的生命活动而且也会对低温信号做出响应。例如 道活力由于感受较低温度而发生的改变导致细胞膜的形态的变化 ( et 2000) (.L et 2000)(. et 2003)。 植物体对低温的响应主要通过低温响应蛋白来实现，其途径主要为应途径。其中 过转录本水平的迅速增加来响应温度的降低，它在黄昏后 8 小时对低温的感受最敏感（ et 因此处于低温3 环境中的植物，其 录本在几分钟内就能诱导产生。低温信号中的胁迫响应中的 个结合蛋白是 列的主要转录因子 (. et 也包括 水响应因子 )/ A. 2010）它是主要该信号途径中的反式调控元件。通过研究发现低温响应途径中的 有可能在非低温条件下产生而在低温条件下激活(. et 003)。而 表达渗透响应基因）可以负调节 A. et 2010)。 温对植物生长发育的影响 随着全球温室效应的加剧，植物的高温受损已变成全世界最关心的问题之一。对于维持全球的生态稳定，研究认识植物内部由于高温条件而产生的具体的应答机制具有至关重要的意 义（ et 2011）。与动物相比，植物必须通过改变自身的生长发育来适应环境的变化（ et 2009）。在长期的进化演变过程中植物形成了应对外界不利环境的一系列机制，例如在受到高温刺激时，在造成热损伤前植物会适时的激活一系列的分子信号来对其进行保护。例如植物细胞会产生热激蛋白 抵抗热损伤（ et 2011）和维持细胞功能。植物对于高温的响应也包括植物的轴线迅速 伸展、叶子的偏上性，以及早花等现象的产生（ et 1998)（ S et 2006) 。同时在高温的生长环境下，植物的组织器官也会通过时刻精确得监控温度变化来能得以存活 (. et 2008)。当外界环境温度上升时，植物会产生诸如庇荫以及通过内源生长素的变化来保护自身不受高温伤害（ 2008) 。 在最近几年的研究中发现染色质和光敏色素 植物对外界温度改变的重要响应因子（ et 2009）。 验室通过研究证实植物的染色体在感知外界环境改变中起到至关重要的作用（ et 2010）。他们构建了小热激蛋白 动子驱动荧光蛋白 突变体库，筛选由较低温度转到较高温度环境下 (正常条件下培养了 6天的苗移到 12 先处理 48小时然后转移到 27 处理 3 小时 )，检查荧光异常高表达的突变体，利用该体系筛选得到变体。 色体结构复合体的一个亚基，它可以改变核小体中 蛋白的比例（ B. et 2005）。研究表明 调节 植物生长的环境温度较低时， 合在 ，抑制一些基因表达使得植物生长减缓，而当温度升高时，这种蛋白就会脱离 关基因就可以正常表达 (S. et 2009)（图 3）。许多报道称温度的变化会引起植物质膜的流动性的改变（ et 2004）。光敏色素作用因子 活性可以通过高温 改变，进而改变植物在高温条件下发育形态（ et 2009）（ et 2009）。在缺失 突变体中植物并没有因为生长在高温条件下而对高温应有的反应如叶柄的伸长和叶子的偏上性。但在缺失突变体中，在高温条件下的仍出现早花了现象（ et 2009）。这说明因高温致使植物形态发生变化和对开花的影响是两个分开独立的信号通路。但总得来说， 因它在植物响应高温信号这个途径中是一个必不可少的组成原件，在复 杂的生长环境中起到对植物生长发育调节的作用（ et 2009）。 在小麦，大麦等其他经济作物中，他们在发育早期的花药对于温度的变化十分敏感。有研究报道高温虽会刺激生长素的生物合成 ,但植物的生殖发育会因为高温而受到影响。在一些植物例如有小麦，马铃薯，豇豆和拟南芥中检测出高温使雄性败育从而引起的花粉的不育（ S et 1983) （ M, et E et 1992)（ Y et et 2008)。 米和大麦这三种经济农作物对于温度的升高和作物产量之间负调的关系（ et 2010）。高温伤害也会导致植物形态异常的机率增大，其中包括线粒体增大以及空泡的形成，大量的转录子在相邻细胞中产生变化（ , et 2007) 。到目前为止，由于高温伤害引起的分子以及生理机制的改变还没有完全被鉴定出来。而植物对于高温的响应和开始产生热耐受性时热诱导基因之间相互作用网 络因其复杂性也未完全掌握（ , et 010）。 5 图 3 植物感知外界温度的信号途径（ 2010,140:26 温对叶片生长的影响 叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官。它生长发育的变化对于整个植株的生育能力产起到决定性的因素 (, et 2007) 。植株叶片对高温的响应表现在叶片表型特征的变化上 (K et 2006) 。通过实验观察相对高温对植物叶片生长产生的影响，对我们研究植株响应高温产生的群体 性效应提供了非常好的依据。叶片向性生长的变化是展现由于高温而产生的可塑性表型变化的表现之一。植物的向性生长分为偏上性生长和偏下性生长，偏上性是指植物的叶片和侧枝的向上生长快于向下生长，而偏下性生长一般指的是斜向地性。其中叶偏上性是叶片响应高温的普遍表型 (F.F et 2005)。 固着在地面上的陆生植物为了更好的生存而建立了发达的根系系统。植物的根系决定了有机体固着获得养分和水分的能力，并且像监视器一样监视着外界环境的变化。根的生长方向变化 包括对回旋运动和震荡的响应，这些响应主要依赖植物的物种和生长条件的限制 (et 1990)（ et 1997) （图 4）。 图 4 拟南芥根生长方向的模式图 (in 001 在响应环境变化方面，向性影响对植物根系的生长发育起到了决定性作用，主要体现在根生长方向的变化这一方面。此外，根对于重力刺激，光刺激，水（水6 分梯度），机械刺激（触摸），温度刺激，电场，磁场和化学品刺激分别 产生了向重力性，趋光性，向水性，向触性，向温性，向电性，向磁性等响应（ et 1990）（图 5）。在这些与根生长方向和运动相关的环境条件中，向重力性被认为是直接影响根生长方向的主要因素。因为向重力性和内源的相互调节决定了根的生长形式及方向，最终使得植物根在各种胁迫条件下得到最佳生存状态。除了向重力性的向性运动，向光性也是决定根生长方向的另一因素。对于向光性的研究是通过已分离到的识别光感受器的缺失突变体 (来分析 (. et 1995)（ et 1998）（ . . et 2001.）（ et 2007）（ et 2008)。 此外对向触性的研究也有了进一步的了解，向触性发生通过细胞质对 离子通道的敏感响应来实现（ V. et 1997) （ et 2003）（ et 2007）（ et 2008) 。关于向水 性的研究现在已经有大量的报道，我们可以知道植物的根依据水位的高低或者含水量的高低而改变生长方向。 图 5 根偏转与向性变化的关系图（ 009 69:489502） 长素和拟南芥根生长发育的关系 植物组织的生长发育始终由生长素在各组织中分布的不同控制着 ( et 生长素它的合成及细胞间的运输和分布同时受到外源环境和内源信号的共同调节，在植物的生长过程中它充当启发器这一重要角色。植物体内的生长素信号通路和其它激素 信号通路间相互调节并最终一起决定植物的生理反应(et 由于生长素大量的被报道，同时也出现了这类激素和根系发育之间的紧密关系研究的文章。研究生长素的功能是通过细胞实验证明生长素分布梯度对根系发育过程中生成和维护的重要性，细化了生长素的水平在根细胞中起到监控和衡量的作用，参与控制根系发育的重要贡献（ et 2010)。 生长素调节植物根系的生长和发育，其中包括了对向重力性的响应。对于根响应重力来说一般有三个步骤：一是对重力的感受 ，二是信号转导过程的改变，三是根的不对称生长 (B. et 根所产生的弯曲迫使生长素在根形态学的上端和下端的分布产生梯度变化并且使生长素的极性运输发生变化 ( et 长素在植物体内的极性运输 生长素在植物中的运输途径有别于其它植物信号分子，在细胞间沿一个方向移动。这种运输通过细胞间的极性运输的来完成 (R, et et 。 这种运输机制通过生长素输入载体 及生长素输出载体 族或 白等来完成。在模式植物拟南芥的根中，生长素存在两种流动方向。第一种流动的方向是生长素从茎衍生的地方流向根的小柱细胞，这种运输方式是通过微管系统完成的。而这种流动方向通过生长素的输出载体 实现流动方向的极性化（ . et 2001)（ J. et 2002)。在流动方向相反的运输中，生长素的流动方向从背向小柱细胞最终到达根的伸长区，这种流动方式通过最外层的根冠细胞和表皮细 胞来完成。通过化学因素或遗传改变了第二种生长素的流动方向的组织和结构，会造成植物生长素在横向形成不对称分布。其中根的生长会受到重力影响而造成生长素的不对称分布而产生弯曲 (G. et 2008)。显而易见，这种运输方式并不能让生长素长距离的运输（ R. et 1998)（ C. et M A. et K. et 1998)。而生长素的长距离的源库运输，来自于幼嫩芽组织。在成熟的韧 皮部通过主要的次级代谢产物途径载入发生。 生长素极性运输具有两个明显的特点，第一是普遍存在于高等植物，第二个是能被 一些化学物质所抑止，导致生长素的运输出现异常，如极性被破坏或抑制花芽形成（ A et 早期通过对生长素外源施加极性运输抑制剂 方法来研究，并建立了化学渗透假说。药理8 学抑制实验也揭示了生长素在调节生理和发育过程中生长素极性运输的重要性。但抑制生长素运输的机制仍不清楚（ P. I. et 在植物中存在两种运输生长素的途径：一种是长距离的源库运输，这种运输一般是很快速的，它主要存在于植物生长活跃的组织中（ A. et 还有一种是短距离运输是细胞间的运输，一般来说速度较慢，但不可或缺。这两种途径都是通过依靠特定的免疫学蛋白来调节的生长素运输，例如 白等。控制方向同时被一个特定的组织调控是其最主要的特点。很多的研究结果显示，生长素的这种极性运输的机理就是化学渗透假说 （ et 1974）（ J. et 1975）（图 6）。 图 6 生长素极性运输的化学渗透假说（ 36:1005 长素的分布与根生长方向变化的关系 生长素的向基式运输通过生长素的输入和输出蛋白来把生长素从小柱细胞运输到伸长区。这种向基式运输在生长素的重新分布起到了重要的作用。在拟南芥的根中，生长素的运输方向是从根尖流向伸长区，也是通过生长素的运输方式对 体内的生长素进行重新分布从而达到管理根弯曲的目的 (et 9 2010) 。生长素受重力的影响使得它在植物的根中的分布产生变化，从而执行一个特定的发育程序最终导致根生长方向的变化。在响应重力的根中一部分生长素顺着重力方向流到处在低势的伸长区，就像生长素的输出蛋白被定位在低势，生长素运输载体 过再定位即向重力方向运输生长素（ J. et 导致生长素的不对称分布即在重力方向聚集更多的生长素。最后导致主根生长的不对称，最终至使根向下弯曲 。根生长方向依赖生长素的极性运输，其中生长素输出载体 白会导致生长素的特定重新分布，从而改变一些基因的表达（ et 2005）（ D. et 2003）。根中不仅存在重力感应器官并且在根尖的淀粉粒也会在 3钟内迅速对重力变化作出响应。这些例子清楚表明根的生长方向依赖生长素调节发育（ et 图 7 根的向重力性（ 009 69:489502） 胞分裂素的生物学功能 1955 年在椰奶中第一次分离到能促使细胞分裂活动的激素 命名为细胞分裂素（ O, , et 1961 年在玉米胚乳中分离到反式玉米素是第一个内源细胞分裂素（ O et 1961）。其他细胞分裂素陆陆续续的从各种植物品种（ W et 化得到。 通过研究发现了许多细胞分裂素的生物学功能。在早期观察中发现细胞分裂素功能包括：培养组织到原发器官的形成（ , et 刺激叶柄的展开和种子的萌发（ E et 1957）以及延缓衰老，在枝条和根上过多积累产生的顶端优势（ et 1958）（ B . et 现在利用10 先进的分子、遗传，生化和基因组技术研究发现细胞分裂素在细胞增殖和分化，根瘤的发生，生物钟、光响应和改变花期，免疫，胁迫延迟植物器官衰老各类过程中起到的作用（图 8）。细胞分裂素的生物合成和代谢在特定组织中它的基因表达也不同，例如细胞分裂素的生物合成基因异戊基转移酶（ 5异构酶（ 细胞分裂素的酶或脱氢酶（ ,它们分别解释了细胞分裂素在胚珠，茎顶端和花这一广大的范围内细胞分裂素的功能 (, T et 2008)（ et （ et ）（ , et 。 图 8 细胞分裂素在植物的地上部分和地下部分的调节作用 (009, 12:527538) 胞分裂 素在植物体内的代谢 植物体内有两条合成细胞分裂素的路径：从头合成路径和转运 解路径。研究表明第一条细胞分裂素的合成途径是主要的合成途径，它产生了大量的细胞分裂素。在植物体内异戊基转移酶类（ 决定合成细胞分裂素类产物的限速酶（ C. et 2000）（ , et 1 （ , et （ et 2008）（ G. et 2002）。而人们在拟南芥体内一共发现了 9 个编码异戊基转移酶类的基因（ ）。细胞分裂素在植物体内的含量不同是由于在不同的组织及不发育阶段引细胞分裂素的分解所引起的。拟南芥中存在 7 个细胞分裂素氧化酶基因（ 他们编码合成细胞分裂素氧化酶（ 并且使得细胞分裂素分子上的 饱和键断裂，最终导致细胞分裂素降解（ et , et 2008）（ et 胞分裂素在植物体内的运输 虽然细胞分裂素几乎分布在植物体的各个部位，但它只在特定的组织或细胞中进行合成。而合成的细胞分裂素必须通过主动运输才能把它运输到其他的组织细胞中。核苷转运蛋白和嘌呤透过性酶在植物体内具有主动运输细胞分裂素的功能，模式生物拟南芥的两种 呤透过性酶可以通过主动运输将细胞外部的细胞分裂素运往胞内（ B. et 胞分裂素在植物体内的信号传导 起初对于细胞分裂素的研究不像其他的激素那样可通过植物生长的表型来研究，因其没有那么多的细胞分 裂素信号的突变体。所以最初研究细胞分裂素在细菌中较为广泛。现在对细胞分裂素的信号通路有了较全面的了解，把它的信号通路称为双元组分信号通路又名磷酸化系统。如果用最易理解的词语来解释双元信号的话，那么可以解释为在细胞分裂的信号通路中主要存在两个保守的蛋白（图 9）。它们分别是：组氨酸激酶感受和响应调节蛋白。它们分别在组氨酸和天冬氨酸残基上的存在磷酸化作用。不同的信号触发组氨酸的自身磷酸化并且使得磷酸基团从组氨酸激酶转移到响应感受器上并触发外界对于信号的响应。在植物中利用组氨酸 的信号转导始于对拟南芥中编码组氨酸激酶的的基因的研究。这些拟南芥中的基因有包含组氨酸的磷酸激酶以及调节天冬氨酸的区域，例如拟南芥组氨酸激酶（ 拟南芥磷酸化组氨酸蛋白（ 拟南芥调节响应子（ et （ W et （ , et 值得一提的是， A 型 是在拟南芥和玉米基因中主要的细胞分裂素信号转导基因 ( et )（ , et et 。此外， 可影响细胞分裂素受体的基因，它在异源系统中仍然可以响应细胞分裂。 (, et , et 2001)。在这双元信号途径中，包含将信号从质膜转移到12 细胞核内的 (E et 2006.)（ et B 型 ,1014,1821)作为 合的转录因子直接促进 A 型,1517)的表达， B 型 是在整个信号反馈环中起负调作用的一类调节器 (T et E,et 2006）（ M , et , et 2001)。 图 9 细胞分裂素合成及信号转导系统（ in 2008） 胞分裂素与根生长方向的关系 对细胞分裂素信号途径和在根、茎中细胞分裂素与生长素之间相互作用的研究发现，这两个激素同时 参与并影响根的生长方向（ et 细胞分裂素对根生长方向的影响主要是通过向重力性的调节。植物根感受重力弯曲的起始部位在根伸长区的边缘 (这一部位的细胞对生长素响应不敏感而对细胞分裂素的有响应。植物根系的向地性生长是由于生长素和其他激素的共同作用而产生的，细胞分裂素由于重力的原因在植物体内分布不均。因其分布不均而导致浓度过高进而对根冠组织细胞生长产生抑制，这就导致了这种向地性生长（ et 。 胞分裂素和生长素之间的相互作用对主根根尖分生组织影响 外源施加细胞分裂素可使分生组织大小缩小和抑制初生根的生长，通过细胞13 分裂素的生物合成基因 信号 影响。 变体和位表达可以增强细胞分裂素的代谢，促进根过渡区的根伸长。与此相反，生长素可以在非常低的浓度对促进初生根的生长（ et 2007）（ et 2009）（ et 2003）。细胞分裂素和生长素的分子之 间的联系是通过识别 个基因。它是生长素信号的负调因子，也是细胞分裂素 录子（ et 2008）（ et 2007）。因此，通过上调 胞分裂素信号使得生长素信号减弱，从而增强细胞增殖。但是在根的分生组织的生长阶段，赤霉素通过压制F 阻遏 表达，这反过来又限制了 达并且增加生长素信号水平（ et 2010）。因此，细胞分裂素信号抑制生长素信号，这也使得生长素输出载体 白（ 表达产生变化，这些基因控制细胞间生长素的极性运输，生长素在植物体内的分配和下游信号基因的表达（ et 2008）（ et 2009）（ K et 2009）（图 10）。 体外受生长素诱导的器官发生也需要细胞分裂素的调节，通过调节不同的因和蛋白来完成。最新的研究报告指出，筛到一个拟南芥的八倍突变体,5,6,7,8,9,15， 它缺失了 A 型 的百分之八十的编码核抑制子的基因所以引起细胞分裂素信号水平增加，并且使 合蛋白的蛋白表达水平在根尖处降低（ et 2011）。作者在野生型中用同样的方法处理也得到了相似的结果，然而 录水平并没有发生很大的影响。通过以上研究结果作者得出细胞分裂素在转录后水平可以影响 白的富集和影响生长素信号（ , P et 2011）。这也就很好的阐明了细胞分裂 素与生长素在根中相互作用共同调节根的生长。 14 图 10 细胞分裂素和生长素相互作用对根尖分生组织的影响 （ 63:35380） 化钠对植物根生长方向的影响 植物在其生长的过程中会充分利用周围的环境信号来引导自己的生长模式和响应一系列向性刺激。在根中会产生复杂的生长信号，从而使得根会以卷曲的形式生长。造成这一现象有许多环境因素例如重力性，趋光性，向温性等都可以与决定根不同的生长方向（图 11），从而优化各种胁迫条件下植 物的最优生存状态（ . S et 2008）。 在世界范围内，由于自然和农业上的原因譬如灌溉等做法使得高盐地在农业15 用地的比例不断增加。植物的根也因高盐而导致渗透压力变化从而威胁植物的生存（ et 2008）。植物对高盐的响应包括拟南芥，豌豆，黄瓜，玉米和小麦等物种（ et 对于植物在抗盐过程中所发生的形态学和发育过程的变化研究甚少。主根的生长通常遵循向重力性，垂直的程度不仅由不同的基因决定（ et 且也受环境刺激的影响而发生改变（ B et 植物根的向地性由根冠小柱细胞中的淀粉粒最先感知，之后生长素运输载体如 ， 蛋白调节根中生长素的分布（图 11）。高浓度氯化钠使根小柱细胞中的淀粉粒快速降解，同时 因的表达也会受到一定程度的抑制，这就导致了根组织中的分布情况发生变化从而使其向重力性也发生改变。而植物的应途径与这两种方式密切相关（ un et 图 11 白受与氯化钠的关系 （ 011,14:296302） 16 论文 的研究目的及意义 在全球气候变暖的背景下，温度变化对传统作物育种产生不利影响 。因此开展植物对温度信号响应机制的研究显得越发重要。之前对于温度的研究较多的关注在胁迫环境下的反应。而表型观察也较多的停留在对地上形态变化部分的观察例如叶偏上性和早花等。对于地下部分根产生的变化知之甚少。本文旨在通过对温度敏感突变体主 根偏转方向的研究来初步探究温度（ 17）对于拟南芥主根生长方向的影响。 并 通过主根偏转方向的变化和激素及盐之间的关系，揭示了在 影响主根生长方向变化中温度，激素，盐之间的相互关系 。本论文的意义是为植物主根感受 温度信号 与 激素信号的 研究 提供了重要依据 。 17 第二章 材料和方法 物材料 拟南芥 (的生态型均为 。 入突变体由郭光沁老师所赠的 突变体库筛得 。 实验器材 仪 器 型 号 480493 417R 普通 超净工作台 上海正新无线电专用设备厂 高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂 离心机 417R 37 恒温培养箱 上海一恒科技有限公司 水浴锅 上海一恒科技有限公司 双光子荧光显微镜 验药品 1、 剂盒、 S 种内切酶和 x 司提供 2、激素 66 （ 3、 洋纺生物科技有限公司）； 4、 、 接酶 、 盛公司）、 京鼎国 )； 胶回收试剂盒由 供，限制性内切酶类（ 司）； 5、 琼脂糖 （ 进口分装 ）， 无机盐类等为国产分析纯 。 18 粒和菌株 大肠杆菌菌株的类型 （ ： 土壤农杆菌的类型 （ 以上菌株均由兰州大学生命科学院细胞所郑国錩实验室保存。 本实验的 物由上海生工生物技术有限公司合成。 引物名称 序列 4) 77 培养基及溶液的配制 （ 1） 1/2体培养基： 19 成分 分子量(g/贮存液浓度() 使用量（ ） 大量（ 10） 9000 100 6500 700 700 400 微量（ 100） 3 10 320 2O 230 2O 60 5 2O 2O 盐（ 100） 730 10 780 有机（ 100） 肌醇 10000 10 氨酸 200 盐酸硫胺素 10 盐酸吡哆醇 50 烟酸 50 a. 用量筒量取大量元素母液 50量元素母液，铁盐和有机成分各 5别加入适量蒸馏水 ,混匀后再加入蔗糖 10g 溶解。 000 节剂将调节 至 c. 加入适量琼脂（ ，灭菌后使用。 (2)植物激素配制 植物激素一般配制成浓度为 溶液，贮存在 2 4 下备用。由于多数激素难溶于水，一般按以下方法配制。 先用少量蒸馏水使之充分溶解再加蒸馏水定容至需要浓度的体积 6在精确天平上称取 6末 ，用蒸馏水将粉末溶解。 将溶解 6滴入蒸馏水中配制成 1度的母液 ,放于 4 冰箱中保存。 20 （ 3） 冲液母液的配制： a. 在天平上称取 54g 的 ， 硼酸。 b. 量取 20 的 混匀定容至 1000 c工作液需要将储存液稀释 10 倍。 验方法 南芥种植 培养基 1、本实验中培养基均为 1/2养基， 1%蔗糖，调节 压高温灭菌 20 分钟， 2、用 汞（ 消毒拟南芥种子 10 分钟左右，之后用灭菌水冲洗至少 5 次其目的是清洗残留在拟南芥种子的升汞（ 3、用枪点种到 1/2养基上，将点种完的培养皿用封口膜封口后， 4、将封好的培养皿放置到黑暗条件下 4 冷藏冰箱中春化两至三天， 5、放入 17 、 22 、 27 培养箱中竖直培养，光照为长日照（ 16 小时光照、8 小时黑暗），湿度为 75%左右，光强度为 4000. 土壤种植 1、将黑炭土与蛭石按照体积 l:1 的比例混合均匀后装入小花盆中，然后 1/4 整个花盆内的土壤完全浸透，移入幼苗。 2、将培养皿中幼苗用镊子轻轻转移到小花盆中继续生长，在特定的小花盆可移 1 到 3 株苗。之后盖上侵湿的保鲜膜。在植物生长过程中根据生长状况浇水松土，注意病虫害。 3、大约一周后去掉花盆上的保鲜膜。另外，拟南芥植株生长过程中要多观察照顾，依据情况不定时浇水、施肥。 4、当拟南芥植株果荚变黄开裂后便可收取种子，将收到的种子保存于干燥器中。 取缓冲液： 100 l (20 21 % (W/V) % 40,000 1、取所提植物材料 洗干净 ， 并放入 心管中 ， 再用液氮中研磨 ， 研成粉末状。 2、加入 500l 65 预热的 取液 （ 100202%(W/V)1%,65 保温 30 分钟 以上。 3、加入等体积的酚 :氯仿 :异戊醇 （ 200: 198:2）， 12000心 3 分钟 。取上清 ， 加入等体积的氯仿 :异戊醇 （ 498:2）， 12000心 3 分钟 。 4、取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置 10 分钟 。 12000心 15 分钟 ，缓慢倒去上清。 5、加入 70%的乙醇洗涤沉淀， 12000心 3 分钟 ，缓慢倒去上清。 6、沉淀干燥后溶于适量 37 消化 30 分钟 ， 保存。 101l l 1l 度 时间 循环数 22 93 1 5 1 4 1 62 1 5 72 4 1 5 3 24 308 1 2 2.5 4 308 1 15 2 2.5 4 304 1 2 2.5 2 2.5 度 时间 循环数 94 30 4 1 2 94 30 4 1 2 12 4 30 4 1 2 2 度 时间 循环数 23 94 1 4 1 20 2 2.5 72 2.5 隆、测序 产物 ,在 l%琼脂糖胶上电泳 ,看 产物片段的大小。确定 异扩增产物判断标准是 ,同一模板 应片段大小的差异 ,与相应特