【毕业学位论文】（Word原稿）紫花苜蓿种质生物质能源性状评价及其茎细胞壁木质素沉积特性研究

兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 1 第一章 文献综述 随着能源需求 的 急剧增加， 加之 传统 的 不可再生化石燃料面临开采枯竭等问题，迫切需要 寻求和发展新 能源 ，而 生物能源 （ 作为可再生替代能源之一， 因其 具有减少温室气体排放 、 利用非粮农作物废料 和 洁净安全等特点 已成为当前 最有前景的替代能源 之一 （ 2007； et 2011）。 为此 ，美国农业部计划 2022 年利用能源植物生产酒精产量达到 134 亿加仑 /年（ ） ， 用以替代传统燃料。我国 也 明确提出 2015 年国内生物质发电装机不低于 1300 万千瓦，2020 年将达到 3000 万千瓦，在 2010 年 550 万千瓦的基础上分别增长 （可再生能源发展十二五规划） 。 鉴于此， 能源 植物生物能源性状评价、细胞壁成分生物合成途径、相关基因遗传改良及其转化利用效率的影响因素等均已经成为目前该领域的热点问题 （ et 2011）。 能源植物的开发和应用是生物燃料大规模生产的基础（ et 2007），根据产生能源的成分不同，可 将能源植物分为三类： 1）油脂类，富含油脂或石油类似物，可用于生产生物柴油； 2）糖类和淀粉类，富含糖或淀粉，可用于生产生物酒精； 3）木质纤维素类，富含纤维素和半纤维素，可用于生产生物酒精（ et 2011）。其中，木质纤维素类因材料丰富，价格低廉，且不涉及粮食安全问题成为当前能源植物的首选（ Pu et 2008； et 2011）。在众多的木质纤维素类植物中，多年生草本植物被认为最符合生物能源生产的要求（ et 2003）。 图 1紫花苜蓿综合开发利用流程（改编自 2006） of in 2006) 多年生豆科 牧草紫花苜蓿（ .）作为优良的能源植物，不仅具有 适应范围广、 抗逆性强 、 种植成本低 和 生态效益好等特点 ，同时 还具有其它能源作物所不具备的特性， 即通过茎叶分离后茎秆用以生产生物燃料的 同时， 叶兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 2 片 可以 生产优质 饲料、蛋白质添加剂等副产品 ，具有很高的综合利用价值（ 2006； et 2010； et 2011）（图 1近年来，国内外科研工作者对紫花苜蓿生物能源的开发利用开展了大量的研究工作（ et 2007； et 2008； et 2011；张树振等， 2012），本文从 紫花苜蓿的生物 能源 利用 角度出发，系统 回顾了近年来 紫花苜蓿 生物能源性状评价 ， 细胞壁发育合成途径及其遗传调控 、栽培管理措施对紫花苜蓿生物质酒精转化效率的影响 等方面的研究进展 ，以期为能源植物紫花苜蓿的 进一步 研发利用提供参考。 蓿种质资源能源性状评价 紫花苜蓿在全球分布广泛，生存环境高度异质化，这种广泛的地理适应性促进了基因的变异，进而形成了丰富多样的种质资源 （ et 2004） 。国内外育种工作者收集和保存了大量苜蓿种质材料，如美国农业部种质资源信息网络（ s 布收集有 4000多份紫花苜蓿及其近亲种质，可为生物质型苜蓿（ 种的选育或改良提供了丰富的种质材料（ et 2011a）。 获得高产、高纤维素和低木质素的新型种质是紫花苜蓿能源利用研究的重要目标，生物质型苜蓿的育种目标明确： 直立生长，适宜低频次刈割，茎、叶产量均最大化，生产成本低，纤维素含量高而木质素含量低（程序， 2008）。近年来，紫花苜蓿种质能源性状评价逐渐开展， （ 2007）对 4 份紫花苜蓿种质研究发现，不同种质茎细胞壁含量及细胞壁中葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖和糖醛酸含量存在显著差异（ m2s，相对湿度 50白天温度 24，夜间温度 18。苜蓿生长至现蕾中期（ 65%植株现蕾）进行刈割，共进行 2 次刈割，刈割 时间分别为 2011年 1 月 20 日与 2011 年 3 月 6 日。 态学指标和产草量测定 分别测定 2 次刈割处理不同 苜蓿 品种的 株高 、分枝数和 主茎 直径，茎叶分离后置于烘箱中 105 杀青 然后 80 烘干至恒重，分别称其重量计算产草量（茎干重 +叶干重 ）和叶茎比（叶干重 /茎干重）。 根据 1981） 的苜蓿分级标准对 参试品种 进行分级。 胞壁成分含量测定 参考 1991）的 苜蓿品质预测方程（ 算苜蓿中性洗涤纤维（ 酸性洗涤纤维（ 酸性洗涤木质素（ 量，根据以下公式计算纤维素和半纤维素含量（ et 2010）： )=成熟级别 ） +株高 ) )=成熟级别 ） +株高） )=成熟级别 ） +株高 ) 纤维素 (%)=性洗涤纤维 )性洗涤木质素 ) 半纤维素 (%) = 性洗涤纤维 )性洗涤纤维 ) 两茬纤维素含量（ %）、半纤维素含量（ %）、木质素（ 量（ %）为：（第 1 茬干重 第 1 茬 含量 +第 2 茬干重 第 2 茬含量） /（第 1 茬干重 +第 2 茬干重 ) 100。 据 分析 文中所有数据均以平均值 标准误表示。采用 件进行不同苜蓿品种各项指标差异显著性分析，当 。 同苜蓿品种产草量比较及其变异分析 高生物量产出是苜蓿作为能源植物生产酒精燃料的重要基础，供试的 54 个苜蓿品种两 次刈割不同品种总产草量变化范围较大（ g/株 g/株 ），其中，两次刈割总产草量最高的苜蓿品种 为甘农 3 号（ g/株）， 其次为 苏联 福、苏联 意大利等 苜蓿品种，两次刈割总 产 草 量 最低的苜蓿 品种为 株） ，较低的品种为 准格尔 和 苜蓿王。 单因素方差分析表明参试品种两次刈割产草量均存在极显著差异（ 。同时，由表 2以看出产草量两次刈割变异系数均较大，分别 为 具有较大的选择潜力。两次刈割处理产草量的种内变异均高于种间变异，其种内变异占总变异的比率分别为 53%和 61%，而种间变异仅为 47%和 39%，并且刈割后总变异系数和种内变异对总变异的贡献呈增大趋势。 同苜蓿品种细胞壁成分比较及其变异分析 纤维素是生产乙醇等液体燃料的主要大分子物质，两次刈割供试苜蓿品种纤维素含量变化范围为 ，其中三得利的纤维素含量最高（ ，其次为和阗以及牧歌，其纤维素含量均高于 23%，另外，大郁山、 第安和甘农 3 号等苜蓿品种纤维素含量也较高，含量均大于22%；先行者的纤维素含量最低 (，纤维素含量较低的品种还有准格尔、甘农 1 号、西部巨人、美国杂花、苜蓿王、匈牙利和苏联兰花等，其两茬纤维素含量均低于 19%。由表 2出同茬苜蓿品种间纤维素含量差异极显著兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 18 （ 。两次刈割处理苜蓿品种的纤维素含量变异系数分别为 种内变异对总变异的贡献率分别为 高于种间变异（表 2且刈割处理后种内变异呈增加趋势，表明刈割处理增加了苜蓿纤维素含量的种内变异程度。 表 2不同苜蓿品种 刈割处理 产草量及细胞壁成分差异显著性和变异分析 of 4 状 刈割 变异来源 变异系数 自由度 离差平方和 P 值 产草量 第 1 茬 种间 53 种内 61 。两茬苜蓿木质素（ 量的变异系数分别为 均高于以上纤维素和半纤维素的变异范围，在细胞壁成分中变异系数最高，表明其选择潜力最大。与纤维素和半纤维素相似，两茬 内变异均高于种间变异，且刈割可增加其种内变异占总变异的比率（表 2 同苜蓿品种聚 类分析 对 54 个苜蓿品种两次刈割的干草产量、细胞壁成分（纤维素、半纤维素和木质素含量）和株高、分枝数、主茎直径、叶茎比等生长指标进行了聚类分析，可将供试苜蓿品种分为 5 个类群（图 2五个类群的产草量、纤维素含量、半纤维素含量、木质素含量均值比较分析见表 2 第 I 类群包括 12 个国外引进品种、 3 个育成品种和 6 个地方品种。该类群的特点是两茬产草量及细胞壁各成分中等，刈割后分枝数和叶茎比较高。第 群包括 4 个国外引进品种和 4 个地方品种，该 类群的特点是两茬草产量均较高。第 1茬产草量显著高于其它类群（ 纤维素含量 半纤维素含量，表明产草 量和木质素含量具有较大的选择潜力。杨晓莉等（ 2008）进行析发现苜蓿种群内遗传多样性（ 大于种群间遗传多样性（ ，表明苜蓿种群内的遗传变异占优势。本研究对苜蓿产草量和细胞壁各成分含量的遗传变异分析发现其种内变异高于种间变异，这与李拥军（ 1998）和孙建华等（ 2004）的研究结果一致，进一步表明我国苜蓿杂合度高，品种内变异幅度大，品种内变异为种质资源的选择利用提供了广泛的基础。 苜蓿由于其自身遗传特性，品种之间存在较大的遗传变异，那些已经具有可观遗传分化的品种是苜蓿种质资源 利用和优良品种培育的基础（杨晓莉等，2008）。聚类分析把 54 份供试苜蓿品种分为 5 个大类，以第 群和第 V 类群生产性能最高，但该类群木质素含量高，叶茎比较低，这与苜蓿产量提高和品质降低相关的报道一致（曹致中， 2002）。已有研究表明，生物质生产乙醇的效率和纤维素呈正相关而和木质素呈负相关（ et 2007； 程序， 2009），因此，在实际育种过程中保证生物量及纤维素含量的基础上选育低木质素含量的品种，是今后该类群苜蓿品种 生物质能源性状改良的方向。另一方面，研究发现不同收获管理方式对苜蓿酒精产量也具有显著影响（ et 2007）。本文第 胞壁各成分含量高，系统深入开展该类群高产低木质素苜蓿品种的刈割时间及收获次数对生物质能源性状的影响，可以为今后苜蓿生物质能源开发利用提供依据。基于苜蓿生物质能源性状的聚类分析发现，兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 23 国内引进品种、育成品种和地方品种聚类相对分散，说明国内苜蓿种质资源生物质能源性状遗传背景较为复杂，这与其尚未系统开展相应的遗传改良研究 利用有关。但是，通过国内不同苜蓿品种生物质能源初评，发现我国一些地方品种如和阗、大郁山、甘农 3 号等品种生产性能较好，细胞壁含量高，是今后苜蓿生物质能源开发和利用的优良种质材料。 兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 24 第 三 章 不同收获时期对紫花苜蓿茎 细胞壁 多糖 含量 及酒精产量的影响 言 紫花苜蓿作为优良的生物能源植物，其多糖含量及酒精产量除 了 受紫花苜蓿种质 基因型 影响外，种植密度、灌溉和施肥 和 收获时期等栽培管理措施对其也具有显著影响（ et 2003）。其中 ， 收获时期 通过 影响紫花苜蓿生物质 产量和细胞壁成分，进而影响紫花苜蓿 转化为 酒精 的 产量。研究发现 ， 晚刈割条件下可以提高紫花苜蓿生物质产量及纤维素含量， 而 盛花期收获与孕蕾期 收获 相比纤维素含量增加 6%（ et 2008）， 盛花期收获与初花期收获相比生物质产量增加 12%，纤维素含量由 加至 et 2011） 。 苜蓿品质预测方程（ 利用株高等生长指标可以快速、经济的预测出紫花苜蓿 量，进而对苜蓿的品质作出初评 （ 2003；et 2010） 。通过生长指标预测紫花苜蓿多糖含量，对紫花苜蓿的生物能源性状作出判断，对大通量生物能源材料生产具有重要意义。 要对饲草品质相关的纤维素指标进行测定，没有对半纤维素进行直接预测， 无法对其酒精产量进行估计，鉴于此，本试验测定了大量苜蓿形态学指标，以探讨生长指标和紫花苜蓿茎细胞壁多糖含量及酒精产量之间的关系。 通过转基因等手段降低 木质素 含量 ， 往往 伴随着生物质产量的下降 ， 而木质素含量的降低也会降低植株的抗逆性，茎秆强度下降，直立生长习性丧失（ et 2009） 。紫花苜蓿种质众多， 生长习性差异较大，在直立生长习性方面存在直立生长型和匍匐生长型两种，这两种生长习性的苜蓿种质间细胞壁多糖含量及酒精产量是否存在差异？ 鉴于此，本试验在 第二章紫花苜蓿种质生物质性状评价 的基础上，从 54 个苜蓿 品种中选择 7 个生物能源性状优良 和具有匍匐生长 习性 的 金达莱 苜蓿 品种，探讨大田栽培条件下不同收获时期对紫花苜蓿 生物质 产量、 茎细胞壁 多糖含量及酒精产量的影响， 以期 为紫花苜蓿生物能源应用适宜收获时期 的选择 提供科学依据。并 通过 株高 、茎粗、分枝数 等生长指标 的 相关性分析，确定与 生物质产量、纤维素 含量 、半纤维素 含量和酒精产 量显著 相关的 生长 指标，以期确定能够预测紫花苜蓿 茎细胞壁纤维素含量、半纤维素含量 和酒精产量的 形态学 指标 ，为快速经济预测紫花苜蓿生物能源性状提供科学依据 。 兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 25 料与方法 验地 概况 试验地点为甘肃省张掖实验站（ 9720 E， 3957 N）进行，该地区海拔 1405m，年日照总时数 2869h，无霜期 112d，降水量 1220 年积温 3470 ，年均气温 7 。 每年 4 月中旬灌溉施肥，并在每次刈割后灌溉 。 验 材料 选择 7 种生物能源性状较为优 良的紫花苜蓿品种 和具有 匍匐生长 习性的 的金达莱苜蓿 为试验材料 （ 表 3。 表 3苜蓿品种编号、名称及其来源 of 号 称 源 拉达克 5 意大利 1 牧歌 2 金达莱 5 黄羊镇 1 熊岳 5 大郁山 0 甘农 1 号 : 中国农业科学院草原研究所 ; 甘肃农业大学 ; 兰州西部草业工程技术研究有限公司 验设计 试验于 2011 年 4 月在温室育苗， 5 月上旬移栽至试验地，试验地设置 5 个小区，每个小区每个品种 5 个重复，行距 距 别于盛花期 、 绿荚期 和 褐荚期 3 个生长期进行刈割收获 ，分析 不同收获时期对紫花苜蓿茎细胞壁纤维素、半纤维素 及酒精产量的影响，并 探究生长指标和细胞 壁多糖含量和理论酒精产量之间的关系 。 长指标测定 每次收获测定 苜蓿品种的 株高 、 分枝数 、 侧枝数 、 茎粗 、 节间数 、 第 5 节间、第 6 节间和第 7 节间 的 长 度 和 直径 ，最长节间 长度 及所在节间位置 （由底部 节间开始算起） ，茎 、 叶分离后分别测定 茎鲜重和叶鲜重，之后至于 80 烘箱中烘干至恒重，测定茎干重和叶干重（ 花和种荚归入叶 ） 。 维素和半纤维素测定 紫花苜蓿茎干样粉碎 后 过 40 目筛，参照波钦诺克（ 1981）的方法对纤维素兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 26 含量 和半纤维素含量进行测定。 纤维素 含量 测定方法：称取 g 生物质干样， 装入离心管加入硝酸和醋酸混合液 5 住离心管沸水中煮沸 25 心弃上清液，并用蒸馏水洗涤沉淀 3 次，加入重铬酸钾 和 浓硫酸 的 混合液 10 入沸水浴中煮沸 10 定期搅拌，冷却后倒入锥形瓶中加入 20%碘化钾 5 入淀粉 溶液 2 ，用0.2 硫代硫酸钠反滴定，并作不加干样的空白试验。并用下式计算纤维素含量： X%=（ ， X%：留待硫酸钠含量 ， K：硫代硫酸钠浓度 （ ） ， a：空白消耗留待硫酸钠体积 （ ， b： 试样消耗的留待硫酸钠体积 （ 。 半纤维素 含量 测定方法：称取 烘干 的生物质粉末 小烧杯中加入 15 0%的硝酸钙溶液，在慢慢沸腾下加热 5 步离心，用 10 水洗涤沉淀三次，加入 2 的盐酸 10 水浴下煮沸 45 心，取上清液，残渣用 10 馏水冲洗 3 次，归入上清液中，加入 1 滴酚酞，用 2 的氢氧化钠中和至显橙红色，转入 100 容量瓶，稀释至刻度，过滤，取 10 液，加入 10 性铜，盖好后于沸水中煮沸 15 却，加入 5 酸和硫酸混合液，加入 0.5 粉，用 硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失，并作空白作为对照。并用下式计算半纤维素含量： X%=00 248-（ （ 10n 其中， X%：半纤维素含量 ， a：空白消耗的留待硫酸钠体积 （ ， b：待测液消耗的留待硫酸钠体积 （ 。 论酒精产量 利用生物质产量、纤维素含量和半纤维素含量结合其转化效率，可以计算其理论酒精产量（谢光辉， 2011），公式如下： 1000 其 中， 理论酒精产量（ L/ 纤维素和半纤维素含量（ %）， t/ 糖转化为酒精的转化系数 转化效率 3 为糖化系数 为酒精密度。 据 分析 所有 试验数据用均值标准误表示，采用 件进行 生物质产量、纤维素含量、半纤维素含量和酒精产量等 指标 的 差异显著性分析 和 并对生长指标和生物能源性状的 相关性 进行 分析 ， 表 3 表 3不同 处理 苜蓿 生物量、纤维素 产量、半纤维素产量和 酒精产量 的多 因素方差 分析 of of of 状 变异来源 自由度 均方 P 值 茎产量 品种（ A） 7 38933 在形态学指标中，酒精产量与节间数呈现极显著负相关性，与最长节间位置呈现显著相关，与其它指标呈现极显著正相关关系，其中和株高、第 1分枝数、第 5节间粗和第 6节间粗的皮尔逊相关系数均高于 见这几个指标对于预测酒精产量具有重要的价值。 论 栽培管理措施对紫花苜蓿的生物质产量、 细胞壁 多糖含量及酒精产量均具有显著影响（ et 2007）。 2008）等研究发现盛花期与孕蕾期相比，细胞壁含量、纤维素含量和木质素含量分别 增加 6%、 8%和 20%，而半纤维素、果胶、可溶性糖含量差异不显著， 从高温热解角度考虑， 随着成熟紫花苜蓿兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 33 生物燃料产量增加， 且 更成熟的苜蓿有利于能量的回收。本试验在前人研究的基础上 （ et 2007） ，增加收获处理，由前人 2个收获时期处理增加为 3个，并且使紫花苜蓿收获更加延迟，即褐荚期收获。从紫花苜蓿生物能源利用出发，探究不同收获时期对紫花苜蓿生物质产量、纤维素 产量 、 半纤维素 产量 和 酒精产量的影响。 延迟收获可获得较高的生物质产量，盛花期与初花期收获相比生物质产量增加 12%（ et 2011）， 2003）等研究发现紫花苜蓿 绿荚期 收获可获得最高的生物质材料，本试验研究发现 绿荚期 收获可获得最高的叶产量和较高的茎产量， 褐荚期可获得最高的茎生物质产量，其中仅有大郁山苜蓿在褐荚期收获茎、叶产量均最大化，不仅有利于生物质生产，并且还可以获得最高的叶产量，为符合生物质型苜蓿选育标准之一。 紫花苜蓿生物质能源生产不仅需要高生物质产量，还需要 生产材料含有 高 的细胞壁 多糖含量。 2007）等研究发现延迟收获使得生物质的细胞壁含量增加 6%（现蕾初期：绿荚期），葡聚糖和木聚糖含量显著增加， 其中木聚糖增加 4%。 2011）等研究发现 盛花期收获与初花期收获相比纤维素含量均增加 12%。本研究发现半纤维素 产量 随收获时期的延迟呈现增加趋势， 这与以上研究结果一致， 且各个收获之间存在显著差异 （ ， 最长节间长在先前试验中很少涉及 ， 而 有可能为半纤维素含量作出预测 。 运用形态学指标对紫花苜蓿酒精产量进行预测， 使得 优良生物质型紫花苜蓿能够快速、大通量筛选。本试验研究的所有形态学指标均与酒精产量呈现显著或极显著相关，但与半纤维素含量相关性不显著，酒精产量与株高、第 1分枝数、第 5节间粗、第 6节间粗等形态学 指标的皮尔逊相关系数均高于 更好的解释酒精产量，应是生物质型苜蓿选育的指标，节间数和酒精产量呈现极显著负相关，在紫花苜蓿选育的过程中应选择植株高大、分枝数多、第 5、 6节间粗、节间数少的植株。 兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 35 第四章 苜蓿 茎细胞壁 木质素和果胶质 沉积特性 言 生物能源作为重要的可再生能源之一，具有可再生，原材料丰富，降低温室气体排放，减少污染等优点（ et 2011）。其中 木质纤维素 类 是一种低成本的生物燃料生产原料，近年来科研工作者对木质纤维素转化为液体燃料和其它化学产品的研究和 探索做了大量工作 （ et 2006； Pu et 2008） 。木质纤维素类生产酒精等液体燃料的难点在于木质素的存在对纤维素和半纤维素多糖的糖化酵解具有拮抗作用，使得木质纤维素转化为液体燃料的成本显著高于淀粉生产酒精（ et 2004； 2005）。因此，克服木质纤维素转化为液体燃料的障碍，降低转化成本是木质纤维素生产液体燃料的主要探究方向之一。 通过降低木质素含量或改变木质素的结构可以降低预处理的成本，并能增加酶解效率，从而促 进生物燃料生产（ Pu et 2009）。木质素主要由紫丁香基木质素（ S），愈创木基木质素（ G），对 H）组成，其中前 S 木质素和 G 木质素是草类植物的主要组成成分。由于 S 木质素 5 号碳位置为甲氧基不一形成碳链，而， G 木质素 5 号 碳位置没有连接的碳使得其更容易形成碳链，因此改变 S/G 比值可以减少木质素碳链长度，从而增加其可分解性 （ 李贞等，2009） 。 紫花苜蓿木质素沉积和发育时期，植株部位密切相关，并且果胶质的沉积随紫花苜蓿的成熟逐渐降低（ et 2002），同一部位不同组织的 木质化程度也存在差异（ et 1998）。 由于不同组织木质化程度不同，使得组织间降解性存在差异，而品种间不同组织分配比例或木质化程度差异可能是引起降解性不同的原因之一。研究发现，降解性不同的柳枝稷（ .）品种，木质化组织分配比例存在显著不同（ et 2005）。 木质素生物合成是其相关基因时空特异表达的结果，有研究表明通过转基因等技术可以调控其时空表达结果，进而获得所需的转基因植株（ et 2011； et 2011）。有研究表明利用转基因手段 强烈抑制木质素合成基因表达后 ， 有些植株会出现直立生长习性丧失 （ et 2009）。紫花苜蓿品种众多，种质资源复杂。在现有紫花苜蓿种质中直立生长 习性 也存在差异，如直立生长和匍匐生长习性的苜蓿品种，此外苜蓿品种还存在多年生和一年生种质，其中一年生的蒺藜苜蓿常作为豆科植物的模式植物来研究。不同习性的苜蓿种质的木质素单体沉积 特性 是否存在差异，沉积部位 是否不同 ，两种木质素单体沉积部位及 特性 是否存在差异？ 兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 36 本文对牧歌（多年生直立生长）、金达莱（多年生匍匐生 长）、蒺藜苜蓿（一年生匍匐生长，模式植物） 3 种苜蓿材料 的 S 木质素、 G 木质素和果胶质在不同发育 时期、不同生长部位及不同组织的沉积 特性 进行 观察 研究 ， 以期 从细胞学角度出发 通过生物化学染色方法，对 不同 苜蓿的木质素和果胶质沉积 特性 进行研究， 发现木质素单体 和果胶质 合成在不同种质和发育时期的特异合成，探讨其沉积的共性及不同，为苜蓿木质素沉积模式的建立提供参考，为进一步木质素 单体和果胶质的 合成调控研究提供依据。 料与方法 验材料 试验材料为牧歌、金达莱和蒺藜苜蓿 3 个苜蓿品种，牧歌为多年生直立生长紫花 苜蓿商业 品种 ，金达莱为多年生匍匐生长 品种 ，蒺藜苜蓿为一年生匍匐生长品种 ，且 蒺藜苜蓿 为豆科植物 的 模式植物。 验设计 2012 年 5 月 10 日在育苗盘种育苗，两周后移栽至 15 15 盆中，试验用土壤为营养土 :大田土 :细沙 =2:1:1（体积比） ， 机质含量 全氮含量 全磷含量 碱解氮 mg/效磷 mg/能温室 光照时间 16h/d，光照强度 600 m2s，相对湿度 50白天温度24，夜间温度 18。 图 4紫花苜蓿上部（ T） 、 中部（ M） 和 底部（ B）节间 示意图 of T), M) B) of 照 1981） 的苜蓿分级标准 ，分 7 个时期对参试材料进行染色观察： 1）株高为 15右，不现蕾， 2）株高为 30右，不现蕾， 3）现兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 37 蕾期，小花未开放 ， 4）初花期，茎上有 1花絮开花， 5）盛花期，茎上有 36）绿荚期， 1 到 3 个花柄结荚（或花柄上小花风干或脱落）， 7）褐荚期，出现褐色种荚（或 3 个以上花柄小花风干或脱落）。对苜蓿上部（ 中部（ 底部（ 间（图 4样徒手切片，挑选厚度一致的切片进行组织化学染色，然后在光学和荧光显微镜下观察，拍照。 织化学染色方法 木质化加厚 的 细胞壁在紫外光照射下 发生 自体荧光 现象 ，利用细胞壁的该性质对紫花苜蓿茎切片在荧光显微镜下观察，可确定苜蓿茎细胞壁加厚 的组织（ et 2009） ；愈创木基木质素（ G 木质素）观察，用 间苯三酚 混合液染色 12 去多余染液，固定在 50%甘油（ v/v）中观察， G 木质素存在的部位被染成红色 （ 1962； et 1998） ；紫丁香基木质素（ S 木质素）观察，首先 将切片放置在 4%的戊二醛中 60 水冲洗， 理 10 水冲洗，再用 10%的盐酸处理 5 水冲洗，固定在氨水中进行紫丁香基木质素（ S 木质素）观 察 ， S 木质素被染成红色（ 1901； et 2005） ； 果胶质沉积观察， 切片 用 红染色 10 流动自来水上冲洗 10 定在 50%甘油，用于 果胶质沉积 部位 的观察 （ 1962； et 1998） 。 果 苜蓿木质素单体及果胶质沉积 在不同 发育时期 、不同 节间位置 、不同 品种间存在差异 ， 品种间 共同之处 本文以紫花苜蓿牧歌进行介绍，存在差异之处单独列出，用于比较分析。 同发育时期木质素及果胶质沉积 特性 随 苜蓿 发育 木 质化程度 呈 加重 趋势 ，在 15 初生木质部和初生韧皮部被木质化 。 从 15 30 质部 快速 加厚，并且加厚的木质部全部 被 木质化，此时靠近木质部的髓 薄壁 细胞开始木质化 。 从营养生长 后期（ 30 至现蕾期木质部也有加厚，加 厚的木质部也 全部被木质化，靠近木质部的髓 薄壁细胞木质化趋势向髓中心部位拓展 ， S 木质素和 G 木质素沉积部位相同，变化趋势一致 ，可见在苜蓿中两种木质素单体共同参与木质化进程 。现蕾期 后 茎的木质部基本不再加粗， 此时木质化组织明确， 主要存在于初生韧皮部、初生木质部和次生木质部，髓细胞仅靠近木质部 的部位有木质素沉积，内部髓细胞均没有木质素沉积。从现蕾期开始，初花期、盛花期、 青 荚期 的木质化程度及趋势基本没有变化，均 兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 38 图 4牧歌苜蓿不同发育时期茎底部节间横切图 A、 D、 为 15B、 E、 为盛花期， C、 F、 为褐荚期。 A、 ，紫外光激发木质素自体荧光，蓝色荧光指示木质化且次生壁加厚部分； D、 ，间苯三酚 色指示 G、 ，莫氏染色，红色指示 J、 ，钌红染色，红色指示果 胶质沉积部位。 c：形成层； 色组织； 角组织； 生韧皮部； 生韧皮部； 生木质部； 生木质部。图中标尺为 200 m。 at , D, G 5B, E, H at C, F, I at A, B : of V D, E : G, H : G, K : of c, 00 m 与现蕾期相似。生长至褐荚期后， S 木质素和 G 木质素均在髓的中心 细胞沉积，此时髓细胞木质化已扩展至中心，但表皮、厚角组织、绿色组织、分生组织、次生韧皮部和髓分生组织均没有木质素沉积，这些组织生长至褐荚期仍没有被木质化，这些组织的比例将直接影响苜蓿茎木质化细胞壁比例，进而影响生物质能源生产的效率。此外探究褐荚期髓中心细胞壁的迅速木质化，对于探究木质化机兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 39 理，及木质化的调控方式具有重要意义。 从 15 始至褐荚期，紫花苜蓿果胶质沉积部位主要集中在表皮、厚角组织、形成层、次生韧皮部和髓分生组织等这些未被木质化的组织。生长至盛花期果胶质沉积减少，但绿荚期和褐荚期的果胶质沉积有 增多趋势，其中盛花期髓细胞壁已无果胶质沉积，绿荚期和褐荚期的髓细胞壁有较多果胶质的沉积，其变化趋势为从营养生长至盛花期果胶质沉积逐渐减少，而生长至荚期后果胶质沉积又呈现增加趋势。木质素沉积的部位为初生木质部、次生木质部和初生韧皮部，随发育进行髓薄壁细胞木质化面积逐渐增加，果胶质沉积部位与木质化部位不同，主要集中在表皮、厚角组织、形成层、髓分生组织和部分髓薄壁组织。这些组织仅有木质素或果胶质一种物质沉积，可见木质素和果胶质的沉积在组织间具有选择性。绿色组织是唯一未被木质化，且没有果胶质沉积的组织。 同节间位置木质素及果胶质沉积观察 紫花苜蓿不同节间位置木质素沉积存在显著不同（ et 2002），与发育时期相对应，苜蓿茎不同生长部位组织果胶质和木质素沉积及次生壁加厚显著 不同。不同节间位置以下部节间最为成熟，木质素沉积多，果胶质沉积少，上部节间果胶质沉积多，木质素沉积少。 S 木质素和 G 木质素沉积状况基本一致，在上部节间 S 木质素沉积较少，仅在初生木质部的少数细胞有沉积， G 木质素在木质部的沉积面积高于 S 木质素，并且在初生韧皮部没有观察到 S 木质素的沉积， 下部 节间两种木质素单体沉积无差异。以牧歌初花期为例，笔者对初花期苜蓿茎不同位置节间进行显微观察发现，上部节间仅初生木质部和初生韧皮部的少数细胞出现木质化，其它各部位均未出现木质素沉积，上部节间含有较高的果胶质，各组织均有果胶质沉积，可见上部节间新陈代谢较为活跃，与中下部节间相比，上部节间髓细胞所占的比例较大；中部节间髓薄壁组织靠中心部分、形成层、厚角组织和绿色组织均未出现木质素沉积和次生壁加厚，且含有较高的果胶质成分，初生木质部、次生木质部、初生韧皮部和靠近木质部髓薄壁组织出现木质化，这些组织果胶质含量较低，木 质部和绿色组织没有果胶质的沉积，但在初生木质部间隙的髓射线细胞仍含有较多的果胶质，木质部所占比例增加，髓所占比例减少，并且木质化趋势由木质部向髓扩展；底部节间大部分组织都被木质化，木质部所占比例进一步扩大，并全部被木质化，髓组织所占比例缩小也被木质化，初生韧皮部仍被木质化，这些木质化的区域基本没有果胶质的沉积，形成层、厚角组织、次生韧皮部和绿色组织未被木质化，并且形成层、厚角组织和髓分生组织富含果胶质，一般被木质化的组织没有果胶质的沉积，但绿色组织除外，绿色组织不仅没有木质素沉积，并且在中下部节间兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 40 没有观察到 果胶质的沉积（图 4 图 4蓿初花期不同节间位置茎横切示顶部（ T）、中部（ M）和底部（ B）节间细胞壁成分 A、 ，紫外光激发木质素自体荧光，蓝色荧光指示木质化且次生壁加厚部分； B、 ，间苯三酚 色指示 C、 ，莫氏染色，红色指示 D、 ，钌红染色，红色指示果胶质沉积部位。 c：形成层； 色组织； 角组织； 生韧皮部； 生韧皮部； 生木质部； 生木 质部。图中标尺为 200 m。 of at T), M) B) A, E : of V B, F : G, G : D, H : of c, 00 m. 同苜蓿 品种间 木质素及果胶 质 沉积 特性 差异 研究 不同苜蓿种质木质素和果胶质沉积 特性 基本相同，但也存在不同之处。三种紫花苜蓿的木质素沉积差异主要体现在髓的沉积时期及沉积范围不同，牧歌直至生长至褐荚期其髓全部木质化，并且从 30始与木质部 靠近的髓细胞已经 开始 木质化；蒺藜苜蓿的生长趋势与牧歌相似，其不同主要体现在髓的木质化范围，蒺藜苜蓿髓细胞壁仅有少数和髓分生组织临近的细胞被木质化，并且这一现象一直到褐荚期，即蒺藜苜蓿从营养生长至褐荚期大部分髓细胞没有木质素沉积，仅有少数的靠近髓分生组织的少数细胞壁有木质素沉积。金达莱苜蓿 与苜蓿木质化趋势相似 ， 而其髓较早 被木质化， 15近木质部的细胞就出现木质化现象，而牧歌苜蓿发育至 30 才有木质素在髓细胞沉积，金达莱苜蓿生长至初花期兰州大学硕士学位论文 紫花苜蓿种质生物 质 能源性状评价及其茎 细 胞 壁木质素沉积特性研究 41 其髓中心薄壁细胞已被木质化，一直延续至褐荚期。其它组织的木质化趋势在 三种苜蓿间没有显著的不同。果胶质的沉积在三种苜蓿间没有明显的不同，果胶质沉积部位在三种苜蓿的各个时期都沉积在新陈代谢活跃的分生组织 和 厚角组织