【毕业学位论文】（Word原稿）KCTD1抑制经典Wnt信号通路的机制研究-生物化学与分子生物学

硕士 学位论文 制经典 号通路的机制研究 学 科 专 业 生物化学与分子生物学 学 位 类 型 科学学位 专业学位 研 究 生 姓 名 导师姓名、职称 副教授 论 文 编 号 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二 零一 四 年 五 月 分 类 号 密级 学校代码 10542 学 号 201102141305 制经典 号通路 的 机制研究 究 生 姓 名 指导教师姓名、职称 副教授 学 科 专 业 生 物化学与分子生物学 研 究 方 向 基 因 功能 与调控 湖南师范大学学 位评定委员会办公室 二零一 四 年 五 月 I 摘 要 经典 控 正常 胚胎发育、细胞增殖和生长，它的异常 激活 会 导致 人类 肿瘤的 发生 。 连环蛋白（ 是 键调控因子 ， 然而调控 白稳定性 的分子机制 尚 不完全 清楚 。我们 近期 的研究表 明 钾离子通道蛋白四聚体 1（ 强烈抑制 通过 ST 验 证 实 白和 白在体内 、 体外存在相互作用 ， 并且我们 确定 了两蛋白 相互作用 的 区域 ，即 -9 特别是 免疫荧光分析表 明 进 白在细胞质内的积累。蛋白稳定 性 分析 证实 胞 内 促进 素化降解 ，而 蛋白酶体抑制剂 白降解 。 进一步的研究发现 导的 酪蛋白激酶 1（ 糖原合酶激酶 3（ 的磷酸化作用，并且 降解作用能被 素化连接酶 增强。 此外， 制 最后，我们发现 调 些结果充分 表 明 典 子 。 关键词 ： 经典 he nt in in of EF in by as as in ST We to -9 TB in a by In on 1 (by 3 of nt we nt PC as a nt nt I 目 录 摘 要 . I . 言 . 1 . 1 . 1 . 4 . 5 2 . 5 . 7 第一部分 材料与方法 . 8 . 8 . 8 . 8 体与试剂 . 8 需溶液 . 9 . 11 . 11 . 12 . 14 . 15 . 16 ST . 17 is . 20 . 20 . 21 第二部分 结果与分析 .录活性 . 22 外相互作用 . 23 表达促进 白降解，并且该降解过程由蛋白酶体介导和依赖于 . 28 4. 且 . 31 53调控 . 33 第三部分 讨论 .考文献 . 谢 . 录 .南师范大学学位论文原创性声明 .1 前 言 号通路简介 号通路 是一条真核生物 中 广泛存在 且 进化中高度保守的信号通路 ， 它 在 多种生物学 过程中 如 细胞 生长、发育、代谢和干细胞维持发挥着 至关重要的作用； 许多癌症的 发生发展 以及 肥胖、糖尿病等疾病的发生 也都 与 号通路 的异常表达 密切相 关 1,2 。 条 : 由 与的经典途径； 通过 导的 胞极性途径 ，主要作用是对胚胎发育进行阶段性调控 3； 通过 介导的 途径 ， 即通过钙依赖 性激酶、钙调蛋白和转录因子 作用 ，该通路能拮抗经典的 号通路 4。 其中 经典 号通路即路 ，是所有 号中研究最为清楚、进化过程中最为保守的一条通路。 典 号通路中的关键蛋白 白 白是一类 广泛存在 于 细胞中的 分泌型糖蛋白，它 通过自分泌或者旁分泌发挥作用，具有分泌型生长因子的特点， 即被分泌后，既可以与自身细胞的膜受体相结合，发挥自分泌的调节作用 ； 又可以与邻近细胞的膜受体相结合，发挥旁分泌作用。 3个半光氨酸所构成的信号区，它们常与细胞外基质的相关成分相结合 5。目前已知 的 19种 活经硕士 学位论文 2 典 6。 由于 号 途径的 的最起始信号，因此它的表达量以及结构的异常将会影响到 发现在宫颈癌细胞株 3细胞中 表达 , 提示 从而改变 及其 分布而导致癌症的发生 7。但是 白家族中还存在有负性调节的蛋白 ， 最近研究发现 但可以调节它的亚细胞定位 , 使之向膜方向移动 , 从而抑制下游基因 8。 白 白是经典 号通路的核心 成员 9， 它 的表达量以及在核内的分布 异常往往会引起 号通路异常 ，从而导致癌症的发生 。 白可以促进许多原癌基因的表达，同时物。 位于染色体的 长 为 16个外显子， 362 781个氨基酸，分子量大约为 925其 一级结构由含 有 大约 130个氨基酸的 N 端 、 含 有 550个氨基酸的中间区域和含有 150个氨基酸的 间区域又称为 12个 12） 构成， 其中 12基序 介导了 录因子 合 ， 若突变此3 区段， 将 会 使 10,11。 白 糖原合成酶激酶 3（ 是一种 在进化上非常保守的 丝氨酸/苏氨酸激酶，有 种形式 。 它 能激活 肝糖代谢中的 葡萄糖合酶 ， 是 此 代谢 中的 关键酶 ； 同时 多种生命活动 过程， 如 细胞增殖 、 神经元的功能发挥 、 肿瘤 形成 以及胚胎发育 。 导致 机体内环境紊乱，进而引发糖 尿病 、 癌症 、帕金森病以及亨廷顿综合征等 疾病 12。 号通路的上游成员 ， 与 解复合物。 磷酸根 基团 依次加到 个 磷酸化的 6 13， 以此将 细胞质内的 较低 浓度。但 活会过度抑制 并导致 人类疾病的发生 ，如 制胰岛 细胞 的 分裂和增殖，使得胰岛 细胞数量大大减少，从而引起胰岛素的 分泌不足，严重影响糖类的代谢 14。 白 多功能蛋白家族，它是经典 时还在细胞迁移、染色体分裂和神经元分化等生命活动过程中发挥重要作用。 因定位于染色体 5长含有一个 8538 共 15 个外显子 的开放阅读框架， 编码 含 2843个氨基酸 的蛋白 。 因编码的蛋白复合物可分为羧基端区和氨硕士 学位论文 4 基端区，其中 羧基端区占 75%，氨基端区占 25%。 靠近羧基端 的 区域含有 多个疏水重复区 ， 这些 疏水重复区由亮氨酸残基组成的 ， 介导 着 的形成 ； 此外 453767氨基酸 残基 区域 含有 7个 它 调节着细胞 粘着 和 蛋白之间的相互作用 15，目前发现 相互作用 的蛋白有 16,17。 靠近氨基端区域含有较多的丝氨酸、酸性氨基酸和脯氨酸残基。 典 号通路调控机理 在正常功能状态下， 组成的 降解复合物 影响着 白稳定性，使得 细胞质内 的 持 在相对较低 的浓度。这一复合物以 及 别结合在 白的不同区域 。 在无 5位点 首先被 接着 41、 37、33位点 依次被 磷酸化的 别， 并 与之 形成多泛素化复合物， 最终 被 26 s 蛋白酶体降解 18,19。 此外， 可以磷酸化 进复合物的形成；而 蛋白磷酸酶 从而抑制复合物的形成和 20。 当有 号存在时， 白与细胞膜上的 卷曲 蛋白（ 结合，并在 低密度脂蛋白受体相关蛋白 ） 的辅助下，将信号传至细胞浆内的 蓬乱蛋白（ ，进而解聚 组成的降解复合5 物，使得 能被磷酸化， 故而不能被 降 解 ， 最终 使得并 部分进入细胞核内，与 （ 结合，促进下游靶基因 ，如 21,22。 负调控因子的调控 。 如 在细胞膜上，分泌因子 与 接结合，从而阻断 断 已被证明 可通过降解 制 23,24,25,26。 号通路与人类疾病的关系 号通路在进化过程中高度保守，通路中任何成分的变化都有可能 引起信号转导的异常，进而引起细胞恶变， 并 最终导致 疾病 的发生 ， 如 类的代谢 14； 27； 致细胞不断增殖，而随着 会诱导细胞内其它致癌基因或是抑癌基因发生突变，最终引起 发生 28； 90以上人类结直肠癌存在 号通路的激活以及细胞内 29。 2 因简介 ）是属于钾离子通道蛋白四聚体基因家族 中 的一员，这类家族目前共有 21 个成员，共同点是在 N 端都有一个 士 学位论文 6 构域和一个钾离子四聚体通道结构域（ 。 构域 存在于 转录因子、离子通道蛋白、原癌基因以及细胞骨架蛋白 30,31,32,33，主要作用 是 介导蛋白之间相互作用、 抑制转录活性 和 介导蛋白泛素 34,35,36。 一类 包含 端的离子通道结构域在进化过程中相当保守，而端的结构域则呈多样化 37。最近的研究 结果表明 族在生命 活动 过程中也起着非常重要的作用， 如： 能与 白 折叠 结合， 并充当 泛素化连接 酶 底物 之间的接头蛋白 38,39； 过影响 抑制胃肠道间质瘤的增殖 40,41； 族分支中的三个类似 互作用， 在 制过程中 激活聚合酶 的活性 42,43； 节 经典 制斑马鱼胚胎发育中神经嵴的形成 44,45。 细胞核内， 是一个转录抑制因子，通过 46。目前 已 发现两种与 朊蛋白 ()和转录因子 7,48。 进一步研究 表明 ， 结合，并且抑制 员 特别是 48。变会 诱发 鳃裂 面综合征（ ，致使患者 皮肤 受损伤 49，而 7 发 头皮 乳头综合症（ 这 些研究 结果提示 ： 似性 50。 进化 中 高度保守，但与其它 家族 蛋白相比同源性较低 。 源性最接近的一个蛋白，在斑马鱼中为同源物 37。 与 合， 并抑制 导 斑马鱼 的神经嵴形成 44； 且抑制 此外， 合 制结肠癌中 转录活性 51。 因此，我们猜想 能与 可以 影响 我们的研究发现， 体内、体外 存在 相互作用 ；同时 够下调 蛋白 表达 量 ， 并且 此下调作用 依赖 于 导的磷酸化 ；更深入 的研究 表明 ： 解被遏，但 被 强。 这些结果揭示 过 进 解 。 硕士 学位论文 8 第一部分 材料与方法 胞株和菌种 细胞 株 ：人正常胚肾细胞 宫颈癌细胞 菌种：大肠杆菌 体 和 工具酶 载体： 自 司； 工具酶： 限制性内切酶 购自 体 与试剂 抗体： 鼠抗 克隆抗体 (兔抗 克隆抗体（ 购自 兔 抗 购自司 ；鼠抗 克隆抗体（ 兔抗 自 兔抗的 自 鼠抗 631212）购自 鼠抗 自 司 ； 免疫荧光二抗 光标记的羊抗鼠 和 购 自 33258 购自 司； 鼠抗 鼠抗单克隆抗体、鼠抗 单克隆抗体 、鼠抗 鼠抗 单9 克隆抗体 和鼠抗 克隆抗体均购自 试剂： 荧光分析试剂盒购自 于牛血清购于 000转染试剂购自 胱甘肽 胶珠购自 司； 购自 司 ； 白质 其它常规试剂均购于上海生工公司。 需溶液 (1) 大肠杆菌培养基 养 基 （ 1 L）：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g， g，琼脂糖 16 g， 加 双蒸 水定容至 1 L，高压灭菌 。 21 L）：蛋白胨 16 g，酵母提取物 10 g， g；加 双蒸水 定容至 1 L，高压灭菌 。 (2) 1.5 取 g 水定容至 1L，过滤灭菌，于 4 保存。 1.0 取 g 水定容至 1 L，过滤灭菌，于 4 保存。 5 15.1 g； 甘氨酸 72 g； g；加水定容至 1 L。 硕士 学位论文 10 细胞裂解液 400 ml 1.0 0 4 M 5 1%） ，脱氧胆酸钠 4 g（ 1%） ， .4 g（ ， 加去离子水溶解，调 容。 620 1.0 4 油 6 g， g，溴酚蓝 2.4 水定容至 20 装保存至 。 考马斯亮蓝染色液 (400 考马斯亮兰 250 1 g，50%甲醇 364 醋酸 36 (3) 液 转膜缓冲液（ 1 L）： g，甘氨酸 14.4 g， 加水溶解后再加入 150 水定容至至 1 L。 1 L） ： 2.1 g，氯化钠 9 g，再加入 6.0 水定容至 1 L。 封闭 液（ 50 ： 称取 2.5 溶解于 并定容至 50 （ 1 L）： 2.1 g， g， 溶于水后加入 .5 水定容至 1 L。 (4) 取及 纯化所需 溶液 裂解缓冲液： 110 10 250 g/菌酶。 清洗缓冲液 ： 11 洗脱缓冲液： 100 L 10 ， 100 L 1 ， 300 L 5 M ） ， 50 L ， g（ 15 ， 1 M 100 ， （ 5） 裂解缓 冲液 ： 80 120 5% 甘油 ， 10 唑 ， 10 清洗缓冲液 ： 80 120 5%甘油， 100 唑， 10 洗脱缓冲液 ： 80 120 5%甘油， 500 唑， 10 （ 6）融合蛋白透析所需溶液 透析液： 10 ， 150 5 粒构建 表达质粒 本实验室保存 46；以 模板，经 增得到 端 (1与 端 (125，将片段分别克隆至 用定点诱变技术，以 突变点 片段，将 变片段克隆至 体上；包含 5 个沉默突变点的 位论文 12 段经扩增后连至 体中； 全长，以及截短体 增后，分别连接到载体 体中； 变片段 37F/45F (增后，插入至 人 蛋白编码区域片段，再克隆至载体 段 1和 454经 隆至载体 粒为本实验室保存；构建的报告质粒 将7个重复的 ；而对照报告质粒 段上含有 6 个突变的 合位点，克隆至载体 46上海生工合成。 胞培养 胞解冻 首先将含血清和抗生素的完全培养 液 预热好， 置入安全柜中，然后 准备好 一个 15 一个 6 并往培养皿中小心加入 4 。 将所需细胞 从液氮罐中取出，迅速 置 入 37 恒温 水浴锅中，待 其即将完全 融化 时 取出，用 75%的酒精 小心擦拭 细胞 冻存管外壁 和管口 ， 然后转 入生物安全柜 中 。 用移液枪 将 细胞 冻存管中的细胞 小心 转移到 15 往离心管中补充 2 后 将离心管放入离心机中，配13 平 后， 600 吸 弃上清，加入 1 并 轻轻吸打 ，以使 细胞重悬。将细胞悬液移入已加完全培养 液 的 6 轻摇匀，做好标记，放入细胞培养箱中 培养。 胞培养 本实验所需的细胞均来自美国组织细胞收藏中心（ 有细胞在培养时均添加有 10%的胎牛血清 、 4 100 U/00 g/ 培养箱的 温度 为 37 ， %。 胞的传代培养 待 细胞长 至 80%90%时 ， 应及时传代 。 首先将培养皿中的培养液 吸 弃 ，加 1 吸弃 着 加入 l 酶，于 37 培养箱中消化 3 置于显微镜下观察， 确定 细胞已 收缩变圆并有少许脱壁，加入 2 终止胰酶 的 消化反应。 接着 用移液枪 轻轻吸打 细胞 ， 待所有细胞完全脱壁，吸打混匀后 按 一 定比例 分 到 10 往各皿中加入 完全培养液， 轻轻摇匀后常规培养。 胞转染 待细胞长至 70%80%时，换成不含血清和抗生素的培养液继续培养。用 000和轻混匀，室温静置 5 含 时将含 000的稀释液逐滴加入到 位论文 14 稀释液中，室温静置 15后将混合物加到细胞培养液中，轻轻摇匀培养液，置于培养箱中培养， 4-6 胞冻存 首先配制好冻存液，冻存液配方为 70% 20%血清和 10% 将 冻存液放入 4 冰箱预冷。将所需冻存的细胞消化好后，转移至 15 600 g，离心 3 上清，加入 1 明细胞名称、冻存时间以及冻存者姓名。将冻存管置于 冰箱中存放 1-2 h，然后放入 冰箱过夜，最后移入液氮罐以长久保存。 光素酶分析实验 1. 转染前一天，将 2孔板中； 2. 待细胞长至 70%80%时，将质粒用脂质体转染法转 入细胞内； 3. 转染 24 尽培养液，用 入 于 冰箱中 1530 放入 37 溶解，重复两次； 4. 用移液枪吹打细胞，以使细胞全部脱壁，再将细胞转移至 1.5 4 ， 12000 0 5. 取出 20 加入 180 L 置于 37 恒温培养箱中，待其颜色变黄后，加入 100 L 1 M 紫外分光光度计，在 420 6. 另取 20 入 20 素酶底物，于火焰萤光光度计15 上测取萤光值； 7. 通过相应公式算出最终萤光相对值。 白质免疫印迹 1 细胞收集：将细胞培养皿中的培养液吸弃，加入 1 加入 1 细胞刮将细胞从培养皿中刮下，转入干净的 1.5 500 700 g， 4 ，离心 3 去上清（尽量将上清去除完全），每管加入 150 加有蛋白酶抑制剂 ，将细胞沉淀充分打撒 。 2 样品蛋白处理：将所收集的细胞置入 ，放置 15 30 接着 放入 37 至完全融解， 再反复 冻融一次。用超声波细胞粉碎机 对细胞进行超声破碎，条件为超声 时间 5 间隔时间 5 功 率200 W、 工作 10 次。 4 ， 12000 心 8 上清液 并 转移至新的 3 蛋白浓度测定： 取 3 零，加入 6 打混匀后，于 595 测取吸光值，所测得吸光值乘以10即为蛋白样品的浓度，单位为 g/L。取 100 加入6105 变性 8 用。 4 配制 ： 依照配方将 分离胶 所需的试剂加入到一干净的 50 下颠倒 使之充分混匀 ，用移液枪加 入凝胶板中 ， 室温下聚合 40 使 之 充分凝固。以同样方法 配制 好 浓缩 胶 ， 插上 点样孔梳子并在室温下聚合左右，充分凝固后取出梳子。 于电泳仪上 ， 8 电泳 30 硕士 学位论文 16 5. 电泳：将已变 性的蛋白样品加入 稳流 10 品跑至下层胶 时 可适当 将 电流 加大 至1214 待指示剂溴酚蓝跑至凝胶底部时，即可 结束 电泳。 6. 转膜