【毕业学位论文】（Word原稿）农杆菌介导的MsNHX1基因转化中苜1号的初步研究草业科学硕士学位论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 农杆菌介导的 因转化 中苜 1 号的初步研究 I 摘 要 本研究以 本 实验 室通过常规育种技术育成的紫花苜蓿品种“中苜 1 号”作为基因转化受体 ， 在叶盘法转化苜蓿的过程中， 建立了紫花苜蓿高频再生组织培养体系 ， 为苜蓿转基因工作打下了坚实的基础。在此基础上，将本实验室从盐胁迫的紫花苜蓿中克隆出的 因 通过农杆菌的介导，转化 到 “中苜 1 号” 中 ，以期获得耐盐性更好的苜蓿 材料 。初步鉴定表明表达元件已经整合到苜蓿基因组中。主要结果如下： 子叶为外植体，进行组织培养系统学研究，寻找具有相对较高分化率的外植体和适用于该品种的 基本 培养基等条件 。通过不同处理结果的比较表明，下胚轴较子叶更 易于再生 ； 养基 是 愈伤组织诱导和胚状体分化诱导 效果较好 的培养基 ； 1/2养基对再生植株的生根最为有效。 因转化 “中苜 1 号” 遗传转化体系的建立与优化。通过对试验现象的观察和数据的统 计分析表明，将培养 7d 的 苜蓿 无菌苗 的子叶经右的 农杆菌 菌液浸染 8培养 7d， 再生苗叶片经 右的菌液 浸染 6共培养 4d， 然后转接到含 500 的头孢霉素和 75 的 卡那霉素的 养基上进行筛选培养的转化体系效果最佳。 转化及对转基因植株的初步鉴定 。 以上述转化体系为依据转化“中苜 1 号”， 将 +5+00培养基所诱导出的 抗性愈伤组织转接到 + +5+00 培养基上进行胚状体的诱导， 然后在 1/2 培养基上使其再生成苗。最后，对转基因植株进行了针对报告基因 35S 启动子和 间片段及 全长 的 测，结果部分 植株 呈阳性。 测 、测 结果表明 目的基因 经 整合 到苜蓿基因组中，且 在 转录 水平上得到表达 。 关键词： 紫花苜蓿，遗传转化， 因 he in is . “by of by we of by . “O.1”as a on . “O.1”to be of by as 1. as a as M a on , to a an in EB in M to .6 6 0 of to .6 6 0 M 00 5 m- 3. of . “O.1” M 00 5 ,of CR of 5is in 录 第一章 文献综述 . 1 蓿基因工程研究现状 . 1 物抗盐基因工程研究概况 . 5 耐盐基因的 分类 . 6 通过基因工程改造植物抗盐的方法 . 6 应用前景与展望 . 8 物 H+逆向转运蛋白研究进展 . 10 研究的目的和意义 . 11 第二章 “ 中苜 1 号 ” 高频再生 体系 的建立 . 12 料与方法 . 12 物材料 . 12 验方法 . 12 果与分析 . 14 菌苗的产生 . 14 佳诱导愈伤培养基的确定 . 14 佳诱导体胚分化培养基的确定 . 15 适生根培养基的确定 . 16 性炭对壮根的影响 . 16 论 . 17 第三章 根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系 的建立与优化 . 21 料与方法 . 21 验材料 . 20 养基的配置 . 21 验方法 . 22 果与分析 . 23 佳分化培养基 . 23 择培养基中 浓度对愈伤组织诱导率的影响 . 23 培养时间对转化的影响 . 24 择培养基中抑菌抗生素浓度的选择 . 24 杆菌菌液浓度、侵染时间对转化的影响 . 24 培养时 间对转化的影响 . 25 V 酰丁香酮 (度对转化的影响 . 25 那霉素 (植株生根的影响 . 26 论 . 29 第四章 因 转化紫花苜 蓿及转基因 植株 的 鉴定 . 29 料与方法 . 29 验材料 . 29 养基的配置 . 29 验方法 . 30 果与分析 . 36 表达载体的鉴定 . 36 目的基因 苜蓿的转化 . 36 再生植株的 测 . 37 再生植株总 提取和 测 . 38 未转化植株的 测 . 39 测 . 39 论 . 40 第 五 章 结论与展望 . 42 参考文献 . 44 致谢 . 51 附录 . 51 作者简历 . 53 文缩略表 英文缩写 英文 全称 中文名称 2， 4 D 2,42,4KT 动素 乙酸 那霉素 霉素 福平 孢霉素 OD 密度 分钟 转速 合酶链式反应 蒸水 S 培养基 . . 养基 养基 乙二胺四乙酸 光强 EB 化乙锭 冲液 a of 脱氧腺苷三磷酸（ 混合物 ） bp 基对 Kb 碱基对 二烷基磺酸钠 补 移 碳酸二乙脂 核糖核酸酶 A 三羟甲基氨基甲烷 d cm 米 h 时 钟 s 瘤质粒 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献 综述 蓿基因工程研究现状 紫花 苜蓿 (.)是世界上分布最广的优良牧草 ,也是我国种植面积最大的人工牧草 ,它 不仅是一种重要的饲料作物 ,而且在土壤改良、水土保持及生态环境保护方面发挥着重要而积极的作用 。 长期以来 ， 人们围绕经济有效地提高苜蓿产量和质量两大目标进行了不懈的努力 。 传统的育种方法时间长 ， 成本高 ， 且可利用的种质资源也有一定局限性 ， 已不能满足育种目标的多样化 。 与传统育种方法相比 ， 植物基因工程更具有科学性和准确性 ， 可大大加速育种进程 。 饲草中 ， 苜蓿转基因研究进展最快 ， 报道也最多 。 目前 ， 已报道的转基因苜蓿涉及的目的基因包括抗病、抗虫、抗除草剂、品质改良、固氮、抗逆、优质等 。引入目的基因主要通过遗传转化进行 ， 外源基因可以通过农杆菌介导转化 、 基因枪法 和 目前对于苜蓿的转基因研究主要集中于以下几个方面 。 蓿转基因研究现状 病转基因苜蓿 1991 年 报道了利用几丁质酶基因转化烟草使其表现对菌核病的抗性 ， 2000 年 道转几丁质酶基因的苜蓿能抵抗紫色丝核菌和齐整小核菌等真菌病害 1 。 1991 年 苜蓿花叶病毒 (壳蛋白基因转入苜蓿 ,试验结果表明转基因植物中粗蛋白积累一般占叶片总蛋白的 且粗蛋白积累一般与转基因植株抗病程度成正比 2 。转 蛋白基因的苜蓿对 病毒也表现出一定的抗性 。 2000 年 花生的植保素白藜芦醇酶基因导入苜蓿 ， 转基因苜蓿中发现一种新的化合物 对苜蓿轮纹病发生有较好的抗性 ， 并对苜蓿坏斑病、失绿现象及病原孢子的繁殖也有一定的抑制作用 3 。 虫转基因苜蓿 1996 年 将 因转入苜蓿 ， 转基因苜蓿对海灰翅夜蛾和甜菜夜蛾均有较高的抗性 4 ； 人将番茄 因转入苜蓿，转基因苜蓿对鳞翅目昆虫有较好的抗性 5 ；马铃薯 因导入苜蓿，转基因苜蓿对咀嚼式口器昆虫具有明显的杀毒作用 6 。 2004 年卢广等 ， 也做了转抗蚜 因苜蓿的初步研究。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 杂草剂转基因苜蓿 1984年 7 ； 1990年 D苜蓿 ,田间试验证实转基因植株对除草剂 8 ， 美国用基因工程方法培育的抗 逆性 寒抗旱转基因苜蓿 低温是限制植物地理分布及生物产量的重要因素，也是危害农业生产的主要自然灾害之一；干旱则是限制牧草生长的重要因素。近年来，随着植物生理、细胞和分子生物学理论和方法的日益完善，植物冷驯化和抗寒、抗旱分子机理的研究取得了显著进展 9 。一类叫超氧化物歧化酶 (金属蛋白有清除氧自由基 ，并使其 转变为过 氧化氢和氧分子的功能。充分表达 10，可减轻二次冻害 11。 1993年 田间试验证明转基因植株的抗寒 、 抗旱性都明显增强 12； 2000年 经田间两轮鉴定筛选 转 基因植物越冬率比对照平均提高25%， 抗寒性明显提高 13； 2003年 根 和茎中 为从遗传 上改良苜蓿品种的耐寒性提供了依据； 2004年韩利芳等通过根癌农杆菌介导法将烟草功地诱导了转基因植株再生，后经分转基因植株的 盐碱转基因苜蓿 将 因导入苜蓿 ， 拟改进苜蓿抗重金属性能 , 以金粉与带有 得到了抗重金属的转基因苜蓿 ； 1997年 耐盐细胞中分离出一个异常基因 ， 它主要在根中 表达 ,编码一种假定 的 种蛋白以特定顺序排列方式控制 而且在根对盐胁迫反应中基因的调节上起着重要作用，同时也可作为一个作物抗盐的重要标记 14 。 公认的转录因子 (苜蓿根部可增加耐盐 1 5 ，充分表达 16。 2003年苏金等报道转录因子 17； 2004年李小红等首次报道了基因 与苜蓿中华根瘤菌的耐盐性是相关的 18。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 铝 苜蓿对铝 (毒性敏感 ， 铝 可导致根部发育受阻和 产量降低。 在苜蓿染色体上有 4 个数量性状位点 (耐铝性能有关 ， 其中一个位点起主效作用。大多数植物的耐铝性与有机酸含量有关。带柠檬酸合成酶基因的转基因苜蓿 ， 因为柠檬酸含量高 ， 故比未转基因的苜蓿表现出更长、生长更佳的根部特性。带苹果酸脱氢酶基因的转基因苜蓿 ， 因为柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和醋酸含量的增加 ，耐铝性也有相应增加 19。 质改良 外源抗性目的 基因转入苜蓿的研究已有成功的报道 12, 20， 但外源品质改良基因转化苜蓿的报道很少 12, 2 1 ,22 。 硫氨基酸 含硫氨基酸是反刍动物 的 必需氨基酸 ， 对动物的生长发育 ， 尤其对羊毛产量和质量有重要的影响。低含量的含硫氨基酸是羊毛生长的主要限制因素。向日葵种子白蛋白基因可增加苜蓿中含硫氨基酸含量 ， 而且把一个内质网状组织保持信号加入转化基因可使向日葵种子白蛋白在苜蓿叶中大量积聚 2 3 。玉米醇溶蛋白 (可编码富含含硫氨基酸的种子贮藏蛋白 )也被转 入苜蓿 ， 绵羊喂以该种苜蓿 ， 即可改善绵羊的羊毛 品质。 2000 年，吕德扬等人通过农杆菌介导法将高含硫氨基酸蛋白(因转入苜蓿，发现转基因植株中含硫氨基酸的含量明显提高 2 4 。澳大利亚学者将豌豆籽粒中含硫丰富的氨基酸 基因 转入苜蓿叶片中，用该转基因苜蓿喂羊可使羊毛产量增加 5以上。 高消化率 木质素消化性的增加可以改善草料的营养品质 。 999年用反义 酸 )脱氢酶 (活性，转基因苜蓿中木质素的含量虽没改变，但木质素的溶解性和消化率大大提高了。 研究表明 ,限 制咖啡酸 咖啡酰辅酶 功能都可能引起木质素含量降低和木质素成分的改变 ， 其中 增加果聚糖含量也可以提高 反刍动物 瘤胃对饲料和蛋白质的吸收，同时还有助于提高 苜蓿 抗旱耐寒能力。 使转基因苜蓿中水溶性碳水化合物含量增加。 合单宁 缩合单宁可减少瘤胃中草料蛋白质迅速消化产生的泡沫 ， 从而减少反刍动物中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 的臌胀病。 试验表明，苜蓿中缩合单宁含量增加可明显减少蛋白的溶 解性 , 苜蓿中调控单宁合成的基因只在种皮上表达 ， 而不在茎叶中表达 。 ， 将参与缩合单宁生物合成的关键酶基因转入苜蓿，改变其单宁结构和组织分布，增加了转基 因植株的单宁含量 。 目前从一年生蒺藜状苜蓿和拟南芥 (阿拉伯芥 )中已分离出缩合单宁基因，这标志着利用基因工程技术预防反刍动物臌胀病的研究已 经 起 步。 物固氮 人类一直期盼利用生物固氮的特性开辟新的氮肥资源 ,逐渐摆脱农业生产对耗能大 、 成本高 、 污染重的工业生产氮肥的依赖。由于苜蓿是种植面积最大的豆科植物，因此苜蓿的生物固氮基因 工程研究已引起科学家的兴趣。调控类黄酮生物合成的基因是目前公认的根瘤菌与豆科植物固氮作用中的重要基因，诱发类黄酮使结瘤基因过量表达而增加根结瘤率。 物反应器 牧草具有生物量大 、 多年生 、 再生快 、 栽培管理成本低等一系列优点， 所以科学家利用转基因技术，将转基因牧草尤其是苜蓿作为生物反应发生器，用来生产特殊的工业酶制剂，开辟苜蓿开发利用的新领域。 苗的开发 目前利用转基因技术生产经济有效的可食用疫苗已成为可能。如猪传染性胃肠炎 (苗已进行试生产 2 5 。肝片吸 虫抗原基因也已成功导入苜蓿基因组中 2 6 。 的开发 利用苜蓿生产工业酶的好处在于可以用相对较少的花费得到大量的产品。 如在工业上用于生物制浆和生物漂白； 广泛用于淀粉加工工业。这两种酶在转基因苜蓿中被成功地提取，大幅度提高了苜蓿的产值。 目前美国农业部和威斯康星大学研究人员已从转基因苜蓿中提取肌醇六磷酸酶 (植酸酶 )， 用作非反刍动物如鸡、猪的饲料添加剂 ， 使其对磷的吸收率提高到 42%左右。 体 的开发 苜蓿也可 用来生产诊断用单克隆抗体 ， 如抗人 血液中心常用试剂 )已通过苜蓿生产 ， 并被证明在功能上与通过杂交瘤生产效果相同 ， 而且抗体含量在多次收割后和烘干干草中均可保持稳定 2 7 。 1999年， 士学位论文 第一章 文献综述 5 (结构蛋白基因 获得的转基因苜蓿饲喂小鼠，发现小鼠对口蹄疫病产生抗性反应。 2002年 ， 畜采食了苜蓿植株后，体内产生抗体，从而得 到 对口蹄疫的免疫能力 。 此外，防治霍乱和腹泻的疫苗抗体也已在转基因苜蓿研究中取得进展 2 8 。 展 转基因苜蓿育种中的 限制因素 转基因苜蓿的应用前景广阔，但其发展过程中也存在一些限制因素 。 虽然 植物 但 是 转基因作物的种植和转基因食品的使用则受到法律的约束。相关的法律法规各国有所不同 ， 以欧盟最为严格而美国最为宽松 29。 此外 转基因苜蓿具有潜在风险 3 0 ， 对生态环境 有 威胁。 转基因植物是我国生物安全管理的重点之一，转基因产品的安全性正引起世界范围的关注。转基因生物对生态环境的 威胁主要表现在可能使生物多样性降低 ,破坏生态平衡， 如转化基因漂移进入边缘杂草就会改变物种间的竞争关系，破坏原有生态平衡；抗病虫害等基因不仅对害虫，对其他有益生物也可能致死；转基因苜蓿进入牲畜体内可能会引起某些过敏反应等。 蓿转基因的应用前景 在转基因进程中，不可避免 地 存在基因沉默现象，基因沉默 现象 严重影响了苜蓿基因工程的应用效果。随着深入系统地研究基因沉默的机制，寻找克服基因沉默的手段，有希望进一步通过转基因技术获得综合性状优良的新一代苜蓿 品种 ，促进苜蓿遗传育种的发展，对促进苜蓿基因工程的 产业化具有重要意义。 饲草中，苜蓿转基因研究进展最快，报道也最多。利用转基因技术培养紫花苜蓿抗逆性新品种是目前牧草育种中最有效的手段 ， 它克服了传统育种周期长、见效慢等缺点。但是苜蓿转单基因的成功例子较多，如抗病虫抗除草剂性状都由单个或少数基因控制，而抗逆性多由多个基因控制，研究成功的很少，应加强转多基因工程技术的研究。同时， 利用苜蓿作为转基因受体来研究植物食用疫苗也是一项非常有意义的工作。因此，转基因技术在苜蓿育种工作中具有广阔的应用前景。 物抗盐基因工程研究概况 土壤盐渍化是影响农业生产和生 态环境的严重问题， 随着 耕地的减少和淡水资源的不足将迫使人类开发和利用大面积的盐碱地、海岸带和滩涂地带 ， 植物耐盐的机理和耐盐植物的培育研究将成为研究的热点。 人们曾试图通过合理灌溉、淡水洗涤和施用化学改良剂等方法来改造盐碱地 ， 但因耗资大、见效慢而难以推广，而且传统育种方法又有很多限制。因此，随着生物技术的发展 ， 人们寄希望中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 6 于基因工程育种 ， 即通过直接导入耐盐基因 ， 使转基因作物获得耐盐性 31实现在盐碱地或海滩上用海水浇灌种植农作物的愿望。 盐基因的分类 盐胁迫可以诱导 植物表达 许多基因 31， 根据这些基因产物的作用 ,可以分为两大类 3 2 , 3 3 。 一类基因的产物为效应分子 ， 包括 :渗透保护剂 (如甜菜碱、甘露醇、海藻糖及脯氨酸等 )的合成酶 ； 维持离子平衡的蛋白质 (如 H+反向转运蛋白等 )； 参与氧化胁迫保护、清除活性氧的酶 (如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和促分裂原活化蛋白激酶等 )； 直接保护细胞免受盐胁迫伤害的功能蛋白(如胚胎发生晚期丰富蛋白、伴侣蛋白和水通道蛋白等 )。 另一类基因的产物为调控分子 , 包括调控基因表达的转录因子 , 如录因子、 录因子等 ， 以及感受和传导胁迫信号的 神经元 (径、蛋白激酶等 。 过基因工程改造植物抗盐的方法 由于以上提及的植物耐盐基因可以分为效应分子和调控分子， 因此通过基因工程增强植物的抗盐性可以从两个方面入手：导入 (或改良 )效应分子基因和改良 (或增强 )调控分子基因。 入或改良效应分子基因 高植物体内渗透保护剂的含量 有些植物 (山菠菜 菜 在受到盐胁迫时 ， 会在体内合成和积累一定浓度的小分子量、无毒性的渗透保护剂 (如甜菜碱、脯氨酸、海藻糖及甘露醇等 )， 来提高细胞内渗透压 ， 降低 酶活性的抑制 34,增加酶的热稳定性 35， 阻止酶复合物的解离 36。这些渗透保护剂还可以清除活性氧 37， 从而有助于植物耐冷害、冻害、高温及干旱等胁迫 38。 在植物应对渗透胁迫而累积 的 可溶性渗透物质中 ， 脯氨酸是分布最广的渗 透剂。 39使用 ， 发现转基因烟草中的脯氨酸含量比对照高10干旱胁迫下 ， 对照烟草中脯氨酸含量由 mg/g， 而转基因烟草脯氨酸含量由 1 mg/.5 mg/g。在干旱胁迫下 ， 转基因烟草落叶少且迟 ， 根长比对照长 40%， 生物量比对照增加 2倍。 40利用 在干旱和盐胁迫下生物量都有增加 ， 外源基因的表达可以减缓氧化胁迫。 41运用定点突变技术将 29位的苯丙氨酸中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 7 换成丙氨酸残基 ， 突变之后的酶 (129A)不再受到脯氨酸的反馈抑制 ， 这样表达 129倍 ， 并降低了游离自由基的水平。脯氨酸脱氢酶 (化的反应是 42运用反义 相应提高了拟南芥(内的脯氨酸含 量 ， 使得转基因拟南芥能耐受冻害 ()和盐害 (600 吴亮其等 43采用基因枪法将拟南芥 21,该基因插入到水稻染色体中并得到超量表达。抗盐抗旱检测的结果表明 ， 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸 ， 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的 5 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快 , 苗