【毕业学位论文】（Word原稿）土壤消毒及土传病原真菌的分子生物学鉴定农药生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 土壤消毒及土传病原真菌的分子生物学鉴定 of on of I 摘 要 本 研究 旨 在筛选 溴甲烷 土壤消毒的 有效替代品， 并 探讨 快速有效的分子生物学方法 定性定量研究 土传病原 真 菌 ， 综合评价土壤消毒的药效， 为土壤消毒防治土传病害 提供更为科学的依据。 通过常规的病原菌分离培养方法 分离 重要的土传病原真菌 ，采用 改进的冷冻研磨 提取 基因组 对真 菌 核糖体基因的内转录间隔区 (行 克隆测序 ， 设计特异性引物，并进行引物特异性及灵敏性检验。 根据所设计的 特异性引物 ， 采 用实时 荧 光定量 法对硫酰氟处理 后 土样中病原 真 菌进行定性定量研究， 并结合病原菌传统培养计数的 方法 ，综合评价硫酰氟土壤 消毒 对土传病原 真 菌的控制效果。 通过本研究 ， 得到如下结果： （ 1） 采用不同剂量的硫酰氟室内土壤熏蒸，结果表明硫酰氟用量在 1010 对土壤中尖镰刀菌有很好的防效， 与本室 所做 的 硫 酰氟 田间药效试验 结果相一致，说明硫酰氟是很有潜力的土壤熏蒸剂。 （ 2） 从采集的保护地病土与典型病组织中成功 分离 到 辣椒疫霉，番茄晚疫病菌，尖镰 刀菌 ，瓜果腐霉，链格孢 。 并 收集培养了寄生疫霉，苎麻疫霉，棉尖镰孢，燕麦镰 孢 ，串珠镰孢 ，禾谷镰 孢 ，腐皮镰 孢 ，大丽轮枝菌，番茄灰霉等菌株。 （ 3） 对 冷冻研磨 进行 改进 后 ，成功提取多种 真菌 的 基因组 对 腐皮镰孢 ， 分离的 镰刀菌 ， 辣椒疫霉，番茄晚疫病菌， 大丽轮枝菌 ， 瓜果腐霉 的 进行克隆测序， 结果显示其长度分别为 544544793884541866序列比对，结果显示 腐皮镰刀菌 和分离的镰刀菌均与尖镰刀菌的一个专化型 f. 源性高达 99%以上 ，推测它们的分类地位可能都应归属于 f. 其余 菌株序列比对， 结果显示其种属名均与 报道的一致。 （ 4）对分离的 镰刀菌 ， 辣椒疫霉， 大丽轮枝菌 三种 重要土传病原 真 菌 设计了特异性引物，进行引物的特异性及灵 敏性检验 ，结果表明退火温度均 为 65 时，三对引物均具有良好的特异性 和灵敏性。 （ 5） 以 不同剂量 硫酰氟 处理 后的 土样为样本， 根据所设计的特异性引物 ， 采 用 荧光定量法 对土样中 病原真菌 进行定性定量研究。结果 表明 ， 可准确定量 不同处理 土样中尖 镰刀菌 的 贝 数 ， 显示 硫酰氟 对该菌 有很好的 控制效果 ， 并明确了 尖镰刀 菌是满城草莓病害一个重要致病菌 ， 初步形成了 土传病原 真 菌 快速有效的分子检测技术 。 实时荧光定量 术可以对 板准确定量，灵敏度高、特异性和 可靠性 强 ， 将其应用到农药药效研究领域，通过对 土传病原 真 菌 进行定性定量研究 ，从 新的角度来评价土壤消毒的药效，为农药药效研究提供了新的研究途径。 关键词 土壤消毒 ； 土传病原 真 菌； 克隆测序 ； 特异性引物 ；荧光定量 he of is to a to by TS of TS we CR to in of (1) of of at 1010,f. in by is a (2) (3) s by TS of 44544793884541866bp of to f. s (4) TS 5 . (5) CR to in of an on a to of CR NA CR to of a of 目 录 第一章 绪论 . 1 甲烷土壤消毒防治土传病害 . 1 传病害的危害 . 1 甲烷的应用 . 1 甲烷土壤消毒替代技术研究 . 3 代原因 . 3 代技术情况 . 3 酰氟作为溴甲烷潜在替代品的研究 . 5 传病原菌的鉴定方法 . 6 统鉴定方法 . 6 子生物学鉴定方法及其应用 . 7 传病原菌的定量方法 . 12 统选择性培养基培养计数 . 12 时荧光定量 术 . 12 研究的目的和意义 . 17 的 . 17 义 . 17 第二章 几种病原真菌的分离及致病性鉴定 . 18 种病原真菌的分离培养 . 18 料与方法 . 18 果与分析 . 19 论 . 21 赫氏法则致病性鉴定 . 22 料与方法 . 22 果与分析 . 22 论 . 23 第三章 病原真菌基因组 提取 . 24 料与方法 . 24 验材料 . 24 验方法 . 25 果与分析 . 26 论 . 27 第四章 病原真菌 克隆测序 . 28 料与方法 . 28 验材料 . 28 验方法 . 29 果与分析 . 32 原真菌 增 . 32 标菌 重组质粒的酶切鉴定结果 . 32 标菌 测序结果 . 33 标菌 序列比对结果 . 36 论 . 38 第五章 病原真菌特异性引物的设计 . 40 料与方法 . 40 验材料 . 40 验方法 . 40 果与分析 . 42 离的镰刀菌特异性引物 . 42 椒疫霉特异性引物 . 42 丽轮枝菌特异性引物 . 42 论 . 43 第六章 引物的特异性及灵敏性检 验 . 44 料和方法 . 44 验材料 . 44 验方法 . 44 果与分析 . 45 物特异性检验结果 . 45 物灵敏性检验结果 . 48 论 . 49 第七章 荧光定量 测土传病原菌 . 51 料与方法 . 51 验材料 . 51 验方法 . 52 果与分析 . 54 验结果 . 54 果分析 . 57 论 . 58 第八章 全文结论 . 60 参考文献 . 61 附录 . 69 致 谢 . 71 作 者 简 历 . 72 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 MB 甲烷 酰氟 甲烷 技术选择委员会 氧消耗物质 重蒸馏水 肠埃希氏菌 丙基 碱基 养基 密度 合酶链反应 种高效克隆 用载体 六烷基三甲基溴化铵 E 缓冲液 43中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 甲烷 土壤消毒防治土传病害 传病害 的危害 传病害的特点 及主要 致病 菌 土传病害其病原物主要 在土壤里越冬 (夏 )，且在土壤里存活时间较长，如瓜类枯萎病菌可在土壤里存活 5年之久，故称之土壤习居菌 。土传病害的病原菌，一般是通过土壤、肥料、灌溉水等 进行传播，以侵染危害植株地下部位的根茎为主，且能侵染 植物的维管束，病原物在维管束里繁殖，阻塞其输送营养物质，在短期内致使整株植物枯萎而死亡 （ 陆家云 ， 1997） 。 引致重要土传病害的主要病原菌，其分类地位分别是属于鞭毛菌亚门卵菌纲的疫霉属、腐霉属，半知菌亚门丝孢纲的丝核菌属、镰孢霉属、轮枝孢属 等（ 曹坳程， 2000） 。 （ 1）镰孢霉属（ 病原菌：为害瓜类、茄科类（番茄、辣椒）及豆科蔬菜。 主要引起根腐、茎腐、果腐 等 ，有的侵染植物维管束组织引起萎蔫症。病原菌以菌丝体、厚垣孢子在土壤中越冬，且在土壤 中可以腐生。厚垣孢子在土壤中能生存 5 10年。 （ 2）疫霉属（ 病原菌：寄主范围很广 ，可以侵染植物地上和地下部分。引起茄科、瓜类疫病 。疫霉菌以厚垣孢子或卵孢子在土壤中存活 。 （ 3）腐霉属（ 病原菌：引起茄子、番茄、辣椒和黄瓜等作物的猝倒病。病菌以腐生的方式在土壤中长期存活。其菌丝体和卵孢子可在病组织和土壤中越冬。 （ 4）丝核菌属（ 病原菌：侵染 作物 引起幼苗猝倒或立枯，也引起禾谷类作物的纹枯病。病菌以菌丝体或菌核在土壤中越冬，腐生性强 。 （ 5）轮枝孢 霉属（ 病原菌：主要引起作物黄萎病 。病原菌的菌丝体、厚垣孢子和微菌核，随病残体在土中越冬。该菌适生性强，寄主广，防治难度大。 保护地 的危害 随着保护地农作物种植栽培面积的迅速扩大，保护地在为农作物提供适宜的环境和更长的生长季节的同时，也为土传病原菌提供了适宜的生长环境，土传病害在保护地中的发生越来越严重。因其发生具有隐蔽性，大多在结果期才达到发病的高峰期，因此损失巨大 。 由于土传病虫害的危害而造成的农作物产量损失通常会达到 20% 40%，严重地块可能高达 60%，或者甚至绝收。所以， 土传病害已严重制约了保护地的发展 （ 曹坳程， 2000） 。 甲烷 的应用 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 目前使用最广泛、控制土传病虫害最有效的土壤熏蒸剂是 溴甲烷 。可用于土壤消毒、检疫熏蒸、耐腐和易腐材料的处理。用作土壤消毒可以防治真菌、细菌、土传病毒、昆虫、螨类、土壤线虫、啮齿动物、寄生性种子植物及杂草。 但 据联合国环境规划署的报告 ， 用于土壤消毒的 溴甲烷 30% 85%的总量到达大气 ，是一种显著的臭氧层消耗物质 ( 在 1992年哥本哈根第四次会议上 ， 溴甲烷 被列为受控制物质 （ 1998） 。 根 据蒙特利尔议定书哥本哈根修正案， 溴甲烷 将于 2015年在全球 淘汰 （ 2002） 。 甲烷 的理化特性 溴甲烷 ，化学结构式 品在常温下为无色气体。工业品 (含量 99%)经液化装入钢瓶中，为无色或带有淡黄色的液体，沸点 ，熔点 （ 1998） 。按我国农药毒性分级标准， 溴甲烷 属高毒杀虫剂，大鼠急性经口 00mg/性吸 入 120 mg/试验条件下，未见致癌作用。由于 溴甲烷 属高毒农药，且本身无味，为安全起见，溴甲烷 中均加入 2%氯化苦作为警戒剂，商品名为溴灭泰 （ 曹坳程， 2000） 。 甲烷 的作用特点 溴甲烷 是一种卤代物类熏蒸剂，在常温下蒸发成比空气密度大的气体，同时具有强大的扩散性和渗透性，可以在薄膜覆盖下的空间和土壤中向各个方向无孔不入的扩散和渗透，从而达到灭虫、杀菌和除草的目的。 溴甲烷 作为熏蒸剂具有显著优点 (曹坳程 ， 2003)： （ 1）生物活性高，对害虫、有害真菌和杂草种子等都具有高的生物活性； （ 2）沸点低，低温下即可气化，使用不受环境温度限制； （ 3）化学性质稳定及水溶性小，应用范围广，可熏蒸含水量较 高的物品； （ 4）穿透能力强，能穿透土壤，杀灭土壤深处的有害生物； （ 5）使用多年，有害生物的抗性上升很慢； （ 6）用于土壤消毒，可减少地上部病虫害的发生，并可减少氮肥的用量，能显著提高农产品的产量及品质。 甲烷 使用情况 溴甲烷 是 一种高效、广谱熏蒸剂，用于土壤 消毒 可有效防治真菌、细菌、病毒、昆虫、螨类、线虫、啮齿动物和杂草。从而使作物保持高产稳产，以及良好的品质，并能减少氮肥用量。另外也广泛用于耐久储存品、易腐烂商品及建筑物的熏蒸，在装运前的熏蒸也发挥重要的作用。全球每年消耗 溴甲烷 约 用途来看，其中 85%用于农业生产中的土壤熏蒸消毒， 10%用于植物检疫货物熏蒸， 5%用于仓储熏蒸消毒。我国自 20世纪 80年代以来，随着经济改革的进行，经济植物种植，保护地迅速发展，土传病害发生越来越严重， 溴甲烷 土壤消毒技术在我国得到迅速推广 （ 曹坳程， 2000） 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 甲烷 土壤消毒替代技术研究 代原因 溴甲烷 虽然是一种优良的多用途的熏蒸剂，但 同时也是一种显著的消耗臭氧层物质。 众所周知，臭氧层对地球上的生命有非常重要的意义。 溴甲烷 散逸到大气中，能在强烈的太阳紫外线作用下，释放出溴原子，溴原子可从臭氧分子中夺取 1 个氧原子，使其变成普通的氧分子，而生成很不稳定的一氧化溴，它又与另一个氧原子结合，使溴原子再次游离出来，又重复上述反应活动，这个过程可重复上千次，从而， 1 个溴原子可使许多臭氧分子遭到破坏（ 1998） 。大气中 溴甲烷 的来源，一是自然界中海洋生物海藻所散发的 溴甲烷 ，二是人工熏蒸消毒使用过程中散发到大气中的 溴甲烷 。熏蒸消毒过程中散发 溴甲烷 为排放至大气总量中的 15% 35%，因此， 溴甲烷 作为一种 质已经受到人们的重视 （ 1998） 。 代技术情况 由于 溴甲烷 对臭氧层的巨大破坏作用， 1992 年 11 月在哥本哈根召开的蒙特利尔条约第 4次缔约国大会上，溴甲烷被正式列为蒙特利尔议定书中又一受控物质。在 1997 年 9 月蒙特利尔召开的议定书第 9 次大会上决定：发达国家 于 2005 年全面淘汰 溴甲烷 ， 发展中国家 淘汰日期为 2015 年。 我国政府已在 1991 年 6 月成为按议定书第 5 条第 1 款行事的缔约国。 由于淘汰溴甲烷的艰巨性，国际社 会成立了溴甲烷技术选择委员会（ （ 998）。 联合国环境规划署（ 辖的由蒙特利尔多边基金资助设立的一个技术咨询组织。每年 化学和非化学的替代技术 /替代品进行科学、技术及经济评估，并发布评估报告。 溴甲烷 的替代技术定义为 ： 非化学或化学的处理程序在防治病虫害的技术上可行，因而可避免或者代替 溴甲烷 的使用 （ 1998） 。以下将国内外关于 溴甲烷 替代的有关技术方法作一简单概述。 学替代品 /替代技术 主要有棉隆，威百亩，异硫氰酸甲酯，氯化苦， 1,3硫酰氟， 甲基碘， 炔丙基溴 ， 甲醛，农药混用 等。 目前 国内有待进一步 研究的化学替代品 主要有： 氯化苦：据报道，氯化苦能有效控制导致草莓根病或枯萎的喙担子菌属、刺盘孢属、柱果霉属、镰刀菌属、疫霉属、须壳孢属、腐霉属、丝核菌属、轮枝菌属真菌，对土壤杆菌属细菌也有效，对地下害虫和土壤线虫也有很好的效果。据 998 年报道，在防治土壤真菌上，氯化苦的效果要高于 溴甲烷 近 20 倍。因为氯化苦防治根结线虫和杂草的效果较差，通常将氯化苦与 1,3与 除草剂混用提高除草效果 （ 1998） 。 1,3土壤熏蒸杀线虫剂，用于柑橘、草莓、葡萄、甘薯、瓜类、烟草、胡萝卜、番茄、花椰菜、甜菜、花生、花卉等多种作物种植前土壤处理，对真菌和地下害虫也中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 有一定的效果。由于防治土壤线虫主要是靠 1,3其注入土壤中后，很快蒸发为气体， 并 通过土壤空隙扩散。 1,3甲烷 的主要替代物逐渐被接受。尤其是将其应用在一定作物上，如草莓。在澳大利亚、西班牙， 1,35%氯化苦混合注射到苗床， 被作为有效的替代物应用在草莓种植上 （ 2003； 2003） 。 甲基碘：甲基碘作为土壤熏蒸剂，国内研究的很少。但作为 溴甲烷 的潜在替代品在国外有研究和报道。在加利福尼亚进行的草莓上的甲基碘和氯化苦的处理显著提高了产量，并且甲基碘和 溴甲烷 相比差异不显著 （ 2000） 。 了实验室生测及田间试验来鉴定杂草对 溴甲烷 和甲基碘土壤熏蒸的剂量反应。实验结果表明甲基碘可能是 溴甲烷 的合适的替代物，因为它的使用条件与 溴甲烷 相似，在广泛的杀草谱内具有比 溴甲烷 更好的效 果，并且对地球臭氧层的破坏很小（ 1997）。在检疫方面的实验也证明甲基碘在防治害虫上效果相当于或高于 溴甲烷 ，但甲基碘的价格昂贵、毒性很高，原料来源也受到限制 （ 000） 。 氰氨化钙：氰氨化钙又叫石灰氮，过去曾作为氮肥施用。它在土壤中与水分反应，先生成氢氧化钙和氰氨，氰氨水解形成尿素，最后分解成氨，供植物吸收。在碱性土壤中，形成的氰氨可进一步聚合而形成双氰氨。氰氨和双氰氨都具有消毒、灭虫、防病的作用 （ 李林，2004） 。 究发现，氰氨化钙用量为 100g/结合施用 切碎的干燥的作物秸秆， 覆盖聚乙烯膜，再结合 太阳能消毒 36 周，对 土壤中的镰刀 菌有很好的控制效果 （ 997） 。 试验表明，种 植前施用氰氨化钙能成功地减少花椰菜上根瘤病害的发生，并提高产量 （ 2005） 。 化学替代品 /替代技术 主要有人工基质，轮作，漫灌，深耕，改变种植时间，种植抗病品 种，嫁接，蒸汽消毒法，生物防治技术，太阳能消毒，生物熏蒸等方法，大多取得了良好的防治效果。 生物防治技术：是用非致病的细菌、真菌和其他有机体，以与有害生物竞 争空间和营养或拮抗等方式而控制土壤中病虫害的方法。因其环境友好的特点，近年来研究较多，主要是利用一些拮抗菌如木霉等来控制病原菌的危害。这种方法也常常和太阳能消毒结合使用，如应用荧光假单孢杆菌防治番茄病害，发现与太阳能结合时比单独生防显著增进产量 (993)。在加利福尼亚，生防菌绿粘帚霉与太阳能消毒结合防治番茄枯萎病也收到很好的效果(1991)。 太阳能消毒：是用塑料薄膜覆盖在潮湿的土壤上 4 周以上，利用太阳辐射对土壤的增温作用，使土壤长期保持一定温度，利用热能杀死土壤中的有害生 物，包括细菌、真菌、线虫和杂草 (1991)。太阳能消毒的效果取决于热量的多少、温度的高低、曝晒时间的长短、生物的热敏感性以及土壤的理化性质和生物特性（ 1986） 。高温土壤太阳能消毒已作为一种控制地下害虫、病原菌、杂草的有效方法被广泛应用。在加利福尼亚的试验表明，土壤温度达到最低 70 ，持续至少 30 分钟，或土壤温度达到最低 60 ，持续至少 60 分钟均可达到很好的效果（ 1999）。 国内曹坳程等在河北满城草莓温室的试验表明，采中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 用太阳能消毒结合生物熏蒸的方法，能使 草莓产量明显提高 （ 曹坳程， 2000） 。 生物熏蒸：是利用植物残渣、家畜粪便等一些有机物质覆盖土壤，利用这些有机物释放出的有毒气体如异硫氰酸甲酯等杀死土壤中的有害生物的一种方法（ 1996）。如施用新鲜鸡粪可有效防除马铃薯黄萎病和寄生线虫（ 1999） 。生物熏蒸法常与太阳能消毒法结合使用，效果更好，可有效防治一些病原菌和杂草（ 1993； 2005） 。 学与非化学替代品 /替代技术相结合 如威百亩、棉隆、氯化苦等化学替代品结合太阳能消毒技 术得到了迅速地发展，显著降低了化学替代品的用药量和使用成本，提高了防效，表现出良好的发展前景。据报道，利用氰氨化钙产生的有毒物质，结合太阳能高温消毒，可有效防治土壤根结线虫病（ 李林， 2004）。 酰氟作为 溴甲烷 潜在替代品的研究 硫酰氟（ 名熏灭净，是一种广谱性熏蒸剂。美国商品名叫 肯 )，由道化学公司在 上世纪 五十年代后期开发作为建筑熏蒸剂。具有消除在建筑物里蔓延的害虫的特性，它不燃，无腐蚀，不会产生异味。自 1961 年在美国上市以来， 广泛应用于 仓库、货船、集装箱等的消毒治虫、建筑物、水库堤坝白蚁的防治以及园林越冬害虫、活树蛀干性害虫的防治。对木材、棉花、烟草、中药材、竹木器、工艺品、各种衣料、图 画 书资料、文物档案等害虫均有良好的防治效果。 硫酰氟作为一种优质的广谱熏蒸剂，不破坏臭氧层，不仅具有良好的扩散力 和穿透力，而且不与室内的绝大多数物质起反应，表现出相当的稳定性（ 2000； 1990） 。 硫酰氟作为一种杀虫剂已在世界范围内逐渐被推广应用，目前至少已有美国、中国、日本、德国、瑞典、澳大利亚、英国和加勒比海诸国正在使用硫酰 氟 （ 1998）。 硫酰氟熏蒸大多是针对木材内易传播的危险性昆虫或线虫，而不是病原菌（ 郑文华， 1994；卢家川， 1991；胡善敏， 1993；乐海洋等， 1997） 。近年来，人们才注意到硫酰氟对病原真菌有控制作用，硫酰氟对橡树木料熏蒸，能够铲除萎蔫病原及其他几种真菌 (995)。 但硫酰氟用于土壤消毒防治土传病虫害目前国内外研究甚少。 酰氟理化性质 硫酰氟是一种非可燃性、无色、无臭的气体，相对分子量为 点很低，为 ，熔点为 。其液态的商品熏灭净的自然蒸汽压很大， 时其蒸汽压约为 400 时溴甲烷蒸汽压的 3 倍，因此易于扩散和渗透，其渗透扩散能力比溴甲烷高 5。硫酰氟易于解吸，无腐蚀，不燃不爆，毒性中等，其毒性约为溴甲烷的 1/3，属神经毒剂 。对高等动物的毒性比其他熏蒸剂低 （何鸽萍， 1999； 曹坳程， 2002） 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章