【毕业学位论文】（Word原稿）新城疫病毒样颗粒的研究禽病分子生物学硕士论文

中国农业科学院 学位论文 新城疫病毒样颗粒的研究 T h e R e s e a r c h o n N e w c a s t l e D i s e a s e V i r u s - L i k e P a r t i c l e s 密级： 论文编号： A M. S. 要 本论文针对新城疫病毒（ 芽机制不清楚和亚单位疫苗免疫效果不理想这一重要理论和实践问题，拟以病毒样颗粒 (术为突破口，建立阐明 芽的主要机制、全面评估新城疫病毒样颗粒（ 免疫原性和免疫效力的技术平台，为开发新型、高效和安全的苗和阐明新城疫病毒致病机 理奠定基础。 本研究首先构建了可能与 成有关的 内标准强毒 的结构基因 M、F 和 哺乳动物细胞重组表达载体 过限制性内切酶分析、质粒 定和序列分析，证明我们获得了相应基因的 哺乳动物细胞重组表达载体阳性质粒。然后将 转染 仓鼠肾细胞（ 72 小时后收集共转染的细胞和上清应用电镜检测到了与 似的颗粒，数量很少，结构也不典型，可能是共转染和表达效率 较低的原因。为了解决这一问题，我们又将这些质粒分别转染 过选择性培养基筛选后，获得了分别含有 组表达质粒的细胞系，克隆筛选工作尚在进行中。 对第一代转染的细胞培养上清和细胞应用间接免疫荧光检测，均未获得阳性结果。 同时，为了研究 昆虫细胞中以及细胞外形成的可能性，我们将 M、 F 和 因亚克隆到 体上，从而成功地构建了重组杆状病毒转座载体 分别转化到 受态细胞中，通过筛选获得了重组的杆状病毒穿梭载体 重组杆状病毒穿梭载体分别转染胞，经 测获得了重组的杆状病毒。重组的杆状病毒分别感染 胞， 和 F 蛋白的表达，但没有检测到 白的表达。 本试验中我们构建了两种表达系统 来研究 形成和组装， 不仅为揭示 出芽机制、各基因及基因内不同功能区在病毒出芽、复制与组装过程中的作用， 而且为 进一步研究分子生物学特性， 研制高效力的多价亚单位疫苗奠定了基础。 关键词 : 新城疫病毒，病毒样颗粒，基因克隆，真核表达 s a an in of of So to We -F on 48E9 DV,is -F DV be by in 2we t a its To of we ot -F NP in To of in or of we , F N DV by of f9 f9 of to in is , F N in be to DV in is of in so we in 录 绪 论 1 1 研究目的和意义 1 2 国内外研究现状 2 基础研究中的应用 2 疫苗研究中的应用 4 为基因治疗转移载体的研究 6 3 研究内容和方法 7 乳动物细胞重组表达载体的构建及共转染 7 状病毒重组表达载体的构建和表达 7 、 F 和 因重组表达载体的构建及 构建 8 1 材料和方法 8 料 8 验方法 9 2 结果 15 基因哺乳动物细胞重组真核表达载体的构建 15 N 基因哺乳动物细胞重组真核表达载体的构建 15 基因哺乳动物细胞重组真核表达载体的构建 16 转染上清的电镜检测 16 转染细胞的电镜检测 17 染细胞的筛选 18 基因转染细胞的检测结果 18 3 讨论 18 、 F 和 因哺乳动物细胞表达载体的构建 18 胞的转染及筛选 19 镜检测共转染的细胞上清和细胞 19 、 F 和 因细胞系的建立及表达 20 、 F 和 因杆状病毒重组表达载体的构建及表达 21 1 材料和方法 21 料 21 验方法 22 2 结果 26 基因重组杆状病毒转座载体的构建 26 N 基因重组杆状病毒转座载体的构建 26 基因重组杆状病毒转座载体的构建 26 、 F 和 因重组穿梭载体的筛选 28 、 F 和 因重组杆状病毒的 定 28 基因表达产物的 泳分析 28 3 讨论 29 、 F 和 因杆状病毒表达载体的构建 29 、 F 和 因杆状病毒的构建 30 、 F 和 因重组杆状病毒在细胞中 的表达 30 结 论 32 参考文献 33 附 录 38 致 谢 49 个人简介 50 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 1 绪 论 新城疫（ 严重危害禽类健康的传染病，其病原 新城疫病毒（ 副粘病毒科 (副粘病 毒 亚科、腮腺炎病毒属的成员。 该病对 养禽业的发展构成严重威胁，因此被国际兽疫局定为 I 类烈性传染病。 早发生于印度尼西亚的爪哇和英国的新城， 1927 年 次分离到病原，并将该病命名为新城疫（ et 974; 996;殷震等 ,1997）。最初报道的 以 型为主的典型病例，以后又陆续发现了致病力较低的毒株，目前该病已广泛流行于世界许多国家。我国于 1948 年分离到 据载 1935 年曾有过“鸡瘟”的流行，可能是由 起的。 宿主范围广泛（ 997），可 以自然或实验性感染禽类 50 个目中的 27 个至少236 种鸟（ et 1998； et 1998； 2000）。同其它副粘病毒一样，有单股负链基因组 度为 15186 个碱基，编码 6 种结构蛋白：核衣壳蛋白（ 磷蛋白 ( P)、基质蛋白 ( M)、融合蛋白 (F)、血凝素 神经氨酸酶 ( 赖的合酶 (L)。此外，在 P 基因转录过程中还可通过 辑作用生产 V 和 et 1993)。目前新城疫经历了三次大流行：第一次在 1926 年起源于东南亚，经亚洲向欧洲缓慢运动，经 30 年传播到世界各地；第二次在 60 年代早期起始于远东，并迅速从中东传到欧洲，至 1973 年就已波及大多数国家 (et 1984)；第三次在 70 年代末起始于中东，导致此次流行的是鸽源 1981 年到达欧洲后迅速蔓延到世界各地，同时引起部分国家鸡新城疫的暴发。 (et 1995) 1 研究目的和意义 由于 严重危害，人们对其致病机理和免疫机理十分关注，近年来也取得了很多进展。但是由于方法和技术的局限，以往的研究都是从一个基因或基因的某个片段入手来进行的，虽然阐明了一些分子机制，但对于病毒的功能，特别是作为一个整体与宿主之间的相互作用机理方面尚不是十分清楚。在疫苗研究方面， 常规疫苗（弱毒疫苗和灭活苗）的免疫效果虽然不错，但弱毒疫苗存在着返强的危险，灭活苗也存在着免疫不确实的 缺点，基因工程疫苗虽然具有很多优点，但免疫效果不甚理想，如非感染性的病原亚单位（蛋白、肽或糖等）只有很低的免疫原性，而且需要佐剂的配合，并且许多有效的佐剂能引起相当严重的副反应。 目前对 研究只是针对单个基因的分子生物学，对各基因的功能及其编码蛋白之间的相互作用还不是很清楚。 象其他副粘病毒一样，新城疫病毒是通过出芽的方式在宿主细胞膜表面形成病毒颗粒的 ,病毒的内部结构蛋白、囊膜蛋白以核衣壳的形式在出芽位点装配后 ,通过细胞膜的分裂而产生子代病毒，这是新城疫病毒繁殖和致病过程中的重要环节。这一过程需要病毒和 细胞双方组分的参与才能完成。 因此 本研究首次以 新城疫病毒样颗粒（ 研究对象，来研究 毒粒子的出芽机制，从而在整体上阐明 蛋白的功能 ；研究每种蛋白在病毒的多形性方面的作用；病毒的组装是否需要核糖核蛋白（ 其他蛋白成分的中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 2 相互作用；形成 需蛋白最小量是多少等等。 另外，针对 弱毒 疫苗的返强的危险和基因工程疫苗免疫原性较差的现状，对 为多价亚单位疫苗的免疫效力进行研究。由于含有病毒的基因组，因此 为疫苗避免了弱毒疫苗返强的危险。 有诱导中和抗体的构像表位，有很强的免疫原性，能象真正病毒一样进入细胞，因此对 研究能够开发出高效力的疫苗。 同时 ，在不影响 构的基础上插入外源蛋白还可开发出治疗疾病的优良载体。 2 国内外研究现状 病毒样颗粒 (核心样颗粒（ 含有某种病毒的 一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似。目前多数病毒的 真核表达系统以及少数病毒的 原核表达系统中都能够有效地实现自我组装（ et 2000； et 1999； et 1999；et 2001； et 2001； et 2002） ，这为病毒的基础研究及疫苗的开发提供了便利条件。该技术自 20 世纪 80 年代一出现就受到了人 们的普遍重视。目前 应用于多种病毒的基础研究、形态发生学、疫苗制备和免疫特性的研究。 基础研究中的应用 目前，对多种病毒的研究只停留在单个基因或基因片段的分子生物学水平上，对单个蛋白的精细功能及各蛋白之间的相互作用还不是很清楚，阻碍了我们对病毒作为整体进入和感染宿主细胞机制的研究，尤其是对那些缺乏小动物模型，且在细胞中不能有效增殖的病毒，如丙型肝炎病毒（ 乳头瘤病毒（ 。 术的建立及成熟将使诸如此类的问题迎刃而解。 病毒形态发生学方面的研 究 通过对 研究，我们已经初步了解了多种病毒的主要结构蛋白在病毒多形性方面的作用。以呼肠孤病毒科病毒为例，该科的蓝舌病病毒（ 及人和多种动物的轮状病毒（ 不同蛋白存在的条件下可形成单、双和三层的 et 1991； et 1994； et 1996)。单独表达 白形成管形的 表达 成单层的 、 、 和 表达 成双层的圆形的 、 、 （单壳）；而共表达 成三层圆形的 （双壳） (王建伟等， 2000)，该研究为绘制病毒多形性的图表提供了依据。因此 病毒的形态发生学的研究上具有重要的意义。 病毒组装和复制过程中的研究 逆转录病毒（如 、 ） 在 白存在的条件下即可形成 需要删除 白的 结构域才能形成 芽释放出来。人乳头瘤病毒（ 棉尾兔乳头瘤病毒（ 牛乳头瘤病毒（ 主要衣壳蛋白 哺中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 3 乳动物细胞、昆虫细胞、酵母及细菌细胞中都能够自组装成 et 1999； et 1999）， 白对 成是非必需的，但它可以提高 白的装配效率（魏兰兰等 ,2001；李秀荣等， 2002； et 2001）。 模拟病毒感染的早期阶段，与细胞膜上 的受体结合从而粘附到细胞表面，还可与鼠红细胞膜受体结合导致红细胞凝集，也可与病毒颗粒竞争结合细胞膜受体（于修平等， 1996； et 2001）。另外 构蛋白还能够与其它蛋白组装成嵌合型 表达形成具有免疫原性和凝血活性的 ； 或 具有免疫原性和凝血活性。以 白为内壳，以与预期基 因相比变异较大的 外壳，成功地实现了 装配，提示引发 粒的内壳与外壳蛋白之间的相互作用从而进行装配的区域可能是保守的， 白的高变性对其与内壳之间的相互作用并无影响。这一结果也提示研制多价混合 苗，从而实现对不同型 染的交叉免疫保护是可行的 (王建伟等， 2000)。 研究表明： 构蛋白 装成的 蛋白出芽的前体形式，其在多形性、生物物理抗原特性上与 似，它与细胞的相互作用是由囊膜糖蛋白 导的，热变性 显降低了其与细胞的结合，表明 细胞的结合需要正确的构象，而不需要 参与，且与低密度脂蛋白（ 体的表达不相关。因此该系统为研究病毒与宿主细胞相互作用过程中所需的受体和病毒囊膜上的决定簇提供了有利工具，而且还可用来研究抗病毒中和抗体的特性（ et 2002； et 2001）。 囊膜病毒出芽过程中的研究 子代囊膜病毒组装完成后需要从细胞中释放出来，那么通过什么方法来研究这种驱动力呢？实验证明 研究囊膜病毒出芽 的有用工具。许多囊膜病毒出芽所必须的蛋白都是通过 没有其它蛋白的参与下， 白在多种表达系统中能够自组装成出芽的形式释放出来。逆转录病毒 芽实验在确定出芽结构域方面发挥了重要作用。已经确定逆转录病毒 白内部有许多与病毒出芽有关的组分，包括膜定位的 M 域， 域，以及恢复膜分裂和病毒粒子释放必须的细胞结构域 L 域等（ et 2001； et 2002； et 2000）。 研究 表明副粘病毒，如人副流感病毒（ 麻疹病毒（ 要有 M 蛋白表达即可形成 出芽形式释放出来，而 需要在 M、 F 和（或） 白共表达的情况下才能形成 芽；并且通过对 研究确证了 F 蛋白的胞质尾干部在病毒出芽中的作用（ et 2002）； 林病毒（ 的 芽需要 2 的参与。研究还发现正粘病毒如流感病毒 M 蛋白是 芽的主要驱动力（ et 000）；弹状病毒，如狂犬病 毒 (水泡性口炎病毒（ ， 芽只需 M 蛋白的表达；丝状病毒，如埃博拉病毒（ 芽只需 质蛋白的表达。 蛋白单独表达时能够形成 芽，表明了可溶性 M 蛋白包含有病毒出芽的全部信息，其中的关键在于它能够结合在细胞膜的内表面，形成位于病毒粒子囊膜下的电子致密层，随后介导子代病毒粒子的释放。 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 4 疫苗研究中的应用 在与疾病斗争的发展史中，传统疫苗发挥着巨大作用，但也存在着不可避免的缺陷，如弱毒苗存在着毒 力返强的危险；灭活苗存在着免疫不确实的缺点，有的还能够引起超敏反应。多种基因工程疫苗的出现很大程度上克服了传统疫苗的缺陷，在疫苗的发展中具有重要作用，但其免疫原性较低（非感染性的病原亚单位如蛋白、肽或糖等），且需要佐剂的配合，而许多佐剂能够引起相当严重的副反应，不适合人类的应用。因此，开发出能够诱导保护性免疫应答的安全高效的基因工程疫苗对疫苗生产工业来讲是一个巨大的挑战。而 出现为新型安全高效的疫苗以及新型佐剂的开发提供了一个新的契机。 苗的制备原理是在体外同时高效表达含有保护性抗原表位的 某种病毒的若干结构蛋白，这些蛋白能自动装配成在形态上类似于真正病毒的空心颗粒。 部没有核酸，故其本身不能复制，但 立体结构上却与天然病毒相同或类似（尤其是构象依赖性抗原表位）。还可以将不同种（型）的病毒蛋白组合到一起或在一种 插入一些抗原表位，形成嵌合型病毒样颗粒（ 如 丙型肝炎病毒 (等，可同时诱导产生对抗数种（型）病毒感染的免疫力。另外还可以将一种抗原通过耦联剂与 接形成联疫苗 。 留了天然病毒粒子的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫性强，不但能激发体液免疫，而且可以激发细胞和粘膜免疫，具有安全、高效的特点，是很有发展前景的候选疫苗。自 20 世纪 80 年代末一出现就受到人们的重视。现已应用于免疫缺陷综合征病毒（人和动物）、坦病毒、 小病毒和 多种病毒疫苗的制备和免疫特性研究 (et 1999;)。目前 苗在预防与治疗病毒性疾病、肿瘤以及过敏性疾病中都发挥着重要的作用。 苗从结构上可以分为三类： 苗、嵌合 苗和 联疫苗。 苗 肖瑶等构建的 够刺激机体产生抗病毒的中和抗体而且能够引起 细胞的应答，即 疫应答，前者强于后者，此结果为 苗进行灵长类实验打下基础（肖瑶等， 2000）。 C 等在昆虫细胞中表达了 N 端缺少 111 个氨基酸的戊型肝炎病毒（ 壳蛋白，能自行装配成 服后能够诱导全身及肠道粘膜免疫，可以作为预防 染的候选疫苗（朱诗应译， 2002）。在动物模型实验中，粘膜或全 身免疫 细胞免疫反应和粘膜表面产生中和抗体，均能有效地抵抗相应 攻击（韩剑秋 译， 1997；张丽芳等， 2001）。这种保护作用基于其构象型表位，而且很可能是通过中和抗体介导的。人体实验证明无论佐剂存在与否 具有相似的免疫原性，表明佐剂不是 服疫苗能够诱导型特异的 应。这不仅使该疫苗更易于使用，而且还可以减少该病通过注射器的重复使用而造成的疾病传播，从而减少生殖 病的发生率 (彭振辉， 2001； et 2001； et 2001； et 2001； et 999； et 2001； et 1998； et 1999； et 2001)。 研究发现将 ， 诱导产生针对 中和抗体， 能诱导中和抗体。 疫绵羊后，也产生了不同程中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 5 度的中和抗体，抗体水平取决 于 免疫量，所产生的抗体能够中和血清型相近的 外诺沃克病毒（ 实验动物上能诱导高水平中和抗体 (Xi et 1992)，人多瘤病毒 毒（ 天然的病毒一样展示出了中和表位和细胞结合表位，可高度有效地被内化并被运至细胞核内，当 完全弗氏佐剂（ 伍时，是一种高度有效的免疫原，这为制备抗 防性和治疗性疫苗打下了基础 (et 1992)。 苗的免疫机理可能是 过与细胞 表面受体结合后，使 入感染细胞中，通过 途径进行递呈，从而实现 胞介导的保护性免疫反应。 合 苗 嵌合 苗是通过基因工程手段将不同种（型）的病毒蛋白组合到一起或在一种 如 )，可以实现多价和 /或多种病毒抗原的同时免疫，由于这种疫苗具有安全、高效的特点，也受到广泛关注。 乳头瘤病毒 白 C 末端可携带 50氨基酸残基（ 而不改变其形成 能力，因此可以在此部位融合不同的限制性 位或其他的免疫原性肽形成 浩等制备的1/7 作为抗原引发特异性的 应，表明 被 径呈递 (程浩等， 2000)。 1 位融合到 1 ，免疫动物可以诱发粘膜性的免疫反应，而且早期蛋白可被提呈到细胞表面，激发 应； 7 蛋白是一种重要的肿瘤排斥抗原，可刺激机体产生 应，杀伤 关的肿瘤细胞，具有治疗宫颈癌的作用，因此制备的 1具有预防和治疗 的双重功效，从而扩展了预防性 苗的治疗潜能，对发展人类生殖道疫苗的研究具有重要意义 (卞继峰等， 2000)。 将鼠 瘤相关抗原连于 1 C 端形成 1疫小鼠后可保护小鼠免受肿瘤细胞 攻击，并可抑制 瘤的生长。表明 以作为一种有效的载体呈递肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，以诱发肿瘤患者产生抗肿瘤免疫，为治疗肿瘤性疾病提供了依据（魏兰兰等， 2001）。 于 面暴露的环状区，是 一个较好的外源蛋白插入位点。 表位插入到该位点后形成的 合体用于家兔试验，结果表明这些表位能有效递呈并诱导体液免疫反应。整合了流感病毒基质蛋白 细胞表位（ 13的 以刺激 T 细胞克隆的增殖（唐彩华译， 1997）。 在临床前研究中，也证明嵌合 以刺激诱导中和抗体的产生，并能刺激 应。 建了一个内部含有酵母双链 面暴露有 位 定簇包含有 5个 B 细胞表位和 4 个 T 细胞表位，分别来自于 白 )的 链 杂交蛋白通过亚精胺 谷胱苷肽连接。研究表明组装的重组 有效地诱导体液与细胞免疫，更重要的是 论是与 联还是作为 一部分（嵌合），都能刺激机体产生中和抗体（ et 2003）。 这种 苗可以避免作为免疫原的低分子量可溶性抗原造成的特异性免疫耐受以及机体内蛋白酶的降解。其免疫应答的机理可能是，重组 过其插入 的表位直接与 子结合，随后由受体介导对这种颗粒的内吞作用， 为抗原输送系统（在某种意义上来讲具中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 6 有佐剂的性质）诱导宿主产生体液和细胞免疫。 联 苗 （ et 2002;et 1999） 露的重复结构域能够诱导强烈的抗体应答，这使得这些结构域非常适合引入外源抗原形成 而插入到衣壳蛋白免疫结构域的外源序列，特别是长度较大的肽，经常会干扰正确的 形成。而将外源免疫原耦联到 就可以保证外源抗原以重复的 方式最佳地展示在载体表面，避免了这个缺憾。 联疫苗制备的方法是在 疫反应区中添加一个或多个赖氨酸（ L），而在外源抗原上引入一个半胱氨酸（ C）连接物，这样可以通过一个双功能的交联剂将外源抗原共价地连接到 体上。特异性吸附位点（载体上的赖氨酸和抗原上单个游离的半胱氨酸）和双功能交联剂的应用保证了所连接的抗原能够以正确的构象与 联。在没有佐剂存在的条件下，该耦联疫苗能够诱导强烈持久的 B 细胞和 T 细胞反应。将流感病毒 白的一段肽耦联到 疫结构域顶部或通过基 因融合到 末端，在无佐剂的情况下，两种 2 特异性抗体的产生，但是前者引发的免疫反应更强烈。很可能是融合肽部分包含在 ,抗原不容易进入到 B 细胞表面的膜结合球蛋白，而耦联的 则最大限度地暴露在 面，可被 B 细胞表面的受体识别。 将蜜蜂毒液中的过敏原磷脂酶 免疫结构域耦联到 体上，治疗被敏小鼠的试验表明小鼠产生了高水平针对 抗体，产生了抗敏作用。接种与联的含有免疫结构域的过敏原将会加速脱敏过程 ，减轻了有过敏史的病人的痛苦。 联疫苗制备的另一种方法是用生物素 生物素连接的 以和融合表达链菌素的外源抗原组装。这种疫苗被证明是有效的，但这种疫苗有时是难以制备的，因为融合的链菌素干扰抗原的正确折叠，因此该系统提呈全长抗原是比较困难的。 与 联的抗原能够诱导强烈的 B 细胞和 T 细胞反应，这些疫苗由于其不具有感染性，而且在无刺激性佐剂存在的条件下即具有免疫原性，因此是安全有效的。 此外 联疫苗可诱导粘膜免疫，这对于某种病原的粘膜保护是重要的，这类疫苗不需要佐剂，因此减 少了粘膜刺激的风险以及其它意想不到的副作用。 为基因治疗转移载体的研究 基因治疗对遗传性疾病和肿瘤性疾病的治疗具有重要意义。目前，临床基因治疗需要一定的基因转移系统来介导基因的转移。反转录病毒是基因治疗最常用的转移载体，但它需要有包装细胞系的参与，并且还有可能产生有感染性的病毒粒子；腺病毒载体因其含有较多的腺病毒序列，可能刺激产生针对腺病毒的免疫反应；由受体介导的转移基因在非分裂细胞中不稳定（卢圣栋主编， 1993； 1994）；脂质体介导的基因转移效率低。鉴于以上的不足，为我们 致力于新型基因转移系统的开