【毕业学位论文】（Word原稿）太谷核不育基因ms2区域BAC跨叠群的构建及不育相关基因的研究生化与分子生物学博士论文

密级：内部 5 年 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 太谷核不育基因 域 叠群的构建及不育相关基因的研究 A on I on 录 摘 要 . 一章 文献综述 . 1 物雄性不育的细胞生物学研究 . 1 药的结构和发育 . 1 粉发育与雄性不育 . 3 药发育中的细胞程序性死亡 . 5 小麦细胞核雄性不育 . 6 麦细胞核雄性不育材料的发掘 . 6 麦细胞核雄性不育基因的定位 . 7 谷核不育小麦的研究进展 . 8 谷核不育小麦的发现及其遗传特点 . 8 谷核不育小麦的生理生化特性 . 8 谷核不育小麦雄性败育过程的细胞学特征 . 8 谷核不育基因研究的意义 . 9 记性状的引入 . 9 太谷核不育基因的分子水平研究 . 11 物基因克隆及表达分析 . 12 位克隆技术与分子标记 . 13 于同源序列的基因克隆 . 19 位杂交技术 . 21 题意义及技术路线 . 23 题意义 . 23 术路线 . 23 第二章 间 叠群构建、序列测定和分子标记的开发. 25 料与方法 . 25 料 . 25 法 . 25 果与分析 . 35 间 叠群的搭建 . 35 隆测序 . 36 列中寻找分子标记 . 43 论 . 49 倍体基因组文库为小麦基因的图位克隆开辟新途径 . 49 分同源群在开发分子标记中的干扰 . 50 分布和特点 . 50 第三章 矮败 /中国春小麦近等基因系的形态学观察及不育过程中的程序性死亡研究 . 52 料和方法 . 52 物材料 . 52 料处理 . 52 导的 端标记（ . 52 离与电泳 . 54 果与分析 . 54 败 /中国春小麦近等基因系孕穗期小穗与小花的形态学观察 . 54 败 /中国春小麦孕穗期花药的细胞学观察 . 54 败 /中国春小麦孕穗期花药的细胞程序性死亡的检测 . 58 论 . 61 第四章 小麦雄性不育相关基因的分离及表达分析 . 62 料和方法 . 62 料 . 62 法 . 62 果与分析 . 72 小麦雄 性不育相关基因的定位分析 . 72 败 /中国春小麦近等基因系可育和不育植株总 测结果 . 74 谷核不育小麦雄性不育相关基因的表达分析 . 74 谷核不育相关基因全长序列的获得 . 76 位杂交结果分析 . 78 论 . 79 麦基因组中存在拟南芥 同源基因 . 79 谷核不育相关基因的表达模式 . 81 第五章 全文结论 . 82 参考文献 . 83 致 谢 . 96 附 录 . 97 作者简历 . 105 i 摘 要 太谷核不育小麦是我国 1972 年发现的一份珍贵小麦材料 ， 雄性不育稳定、彻底，不受外界环境条件的干扰和影响，其不育性受显性单基因控制，国际上基因注册符号为 败小麦是具有矮秆基因标记的显性核不育材料，其显性不育基因 位于 小麦 4D 染色体短臂上与显性矮秆基因 密连锁。太谷核不育基因 世界上发现的第一个小麦的显性核不育基因，该基因的克隆对于保护我国自主的知识产权以 及理解小麦育性的机制都有重大的意义。本研究的主要目的就是搭建 叠群，为图位克隆 因奠定基础，并对不育过程及相关基因进行研究。 叠群的构建是图位克隆基因的基础。本研究 利用与 因紧密连锁的分子标记筛选六倍体矮败 /中国春小麦 库和 D 基因组粗山羊草 库， 经过 析和 端测序搭建起 396 叠群。 对该跨叠群中的 200行测序， 共获得 3,072条 高质量的序列，拼接后长约 198 有 3 个基因， 18 种类型简单重复序列，基因区仅占 整个 列的 6%。 对小麦的 的基因与 水稻的 基因 位点进行比较分析，发现包括选基因在内共有 3 个同源基因保持了很好的微共线性，但 仍有1 个基因在水稻 没发现同源基因，水稻中也有 7 个假定基因在 1没有同源基因。 通过 列和 列，设计引物在矮败 /中国春小麦近等基因系矮秆不育和高秆可育材料中进行扩增，寻找基因区和低拷贝区的等位特异性分子标记和 记，尽管该区域序列存在有很多差异，但是由于 部分同源群的干扰，没有开发出分子标记；根据的 列设计了 18 对引物，结合 7 对 4D 染色体上的 物对矮秆不育株、高秆可育株和高秆不育株进行检测，结果发现 16 对引物没有多态， 8 对引物只在 有扩增，一对引物没有扩增。说明这一段非常保守，不易检测出多态。 为了更好地理解败育过程，本研究对矮败 /中国春小麦高秆可育株和矮秆不育株孕穗期不同穗长的幼穗取其中部小穗的第 1 小花的形态进行形态学和细胞学的观察，发现在幼穗长到 6育花药外观与可育花药差异非常明显，此后，不育花药不再继续生长 。可育和不育的花药经过镜检确定，当花药长度为 ，不育花药形成花粉母细胞； 进入减数分裂；并且能够完成减数分裂进入四分体阶段，在形成幼嫩小孢子后，细胞质收缩而降解。利用 段化检测发现，在花粉母细胞进行减数分裂前期 矮败 /中国春小麦不育花药的花粉母细胞开始出现程序化死亡。 察发现，太谷核不育小麦的败育时期与拟南芥不育基因 败育时期一致，所以对小麦中拟南芥不育基因 同源基因，进行定位与表达分析发现，该基因位于小麦 4，只在可育花药减数分裂时 期进行表达，在成熟的花药和成熟植株的其他部位及幼嫩植株各部位都没有表达。利用该基因序列从矮败 /中国春小麦花药文库中筛选得到该片段的全长基因。在核苷酸和氨基酸水平上同 的序列进行比对，发现 该基因具有不育结构域，进而确定该基因为太谷核不育相关基因。 位杂交结果表明，该基因在减数分裂前期、中期、二分体时期、四分体时期和花粉粒时期在花药药室壁中均有较强的表达信号，说明该基因主要参与了花药发育过程中，营养物质的运输。而不育花药中，可能由于运输物质的中断而最终影响花药的不育。 关键词 太谷核不育 基因 叠群，细胞程序性死亡，同源基因克隆， 位杂交 972, is of in of is a a on of D, a as in by to 3 AC is in In by S AC 96kb of a of 00kb AC to a ,072 bp 1.5 x 8 0kb % is at 9% in in to to No S SR no of in be of to It of of cm at of it it in NA in CD it at of of s2 iv s2 on of It on D in in at t in of or in it in of a in be in in 国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文 献综述 雄性不育的研究对于杂种优势的利用具有重要意义。细胞核雄性不育性是由细胞核不育基因控制的，其作用不受细胞质类型影响，没有正反交的遗传效应，其雄性不育的遗传和表达完全符合孟德尔遗传定律，一般由控制花粉正常育性的核基因发生突变造成。在核不育材料中，多数由隐性不育基因控制，只有少数受控于显性基因。隐性核不育与任何育性正常材料的 均是正常可育的，即任何育性正常材料均为它的恢复系，但找不到典型的保持系，故不能生产大量不育系种子供制种之用，而只能从 杂合可育株的自交后代中分离得到不育株，因此，隐性核不育系兼具不育系、保持系的功用（两用系）。单基因控制的显性核不育通常由基因突变引起，这种核不育材料既找不到完全的恢复系，也找不到完全的保持系，后代总是分离出一半不育株和一半可育株。显性核不育的遗传行为在许多方面与隐性核不育相似，但二者具有两个明显区别：显性核不育测交 出现育性分离，而隐性核不育测交 全部可育， 出现育性分离；显性核不育群体中的可育株的自交后代全部正常可育，而隐性核不育则出现育性分离。 物雄性不育的细胞生物学研究 植物雄性不育是指植物在有性繁殖过程中雄性生殖器官发育异常，不 能产生有正常功能的雄配子 花粉，而其雌性器官生长发育是完全正常的一种现象。雄性不育在植物界中是一种常见现象，据统计已经在 43 科， 162 属， 320 个种和 297 个种间杂种中发现了雄性不育现象 (988)，并且这个数目还在不断增加。雄性不育对植株本身来说是一种不利性状，但它是自然界中植物进化的一种方式，植株因自身雄性不育，只有接受外来花粉，才能受精结实，产生杂种，杂种在生长势和适应性方面具有强大优势。对雄性不育进行研究，在理论上可以丰富花粉发育、细胞质遗传和核质互作等方面的知识，在实践上可以作为一种遗 传工具，减少人工去雄的麻烦，在作物杂种优势利用、群体改良中有重要的应用价值。 被子植物可育花粉的产生，涉及到大量遗传控制的生理、生化和形态学过程。任何干扰雄蕊发育、孢原细胞分化、小孢子的发育、花粉的发育等和植物花粉发育过程的突变，都有可能导致植物的雄性不育。现就植物的花粉发育及其过程中的程序性死亡与雄性不育关系的研究进展情况进行简要综述。 药的结构和发育 花药的发育分为两个阶段，第一阶段细胞分裂分化形成花药组织。花药有四个药室，每个药室由孢子体物质包围着花粉母细胞，它们之间的信息和物质交流通过 中间的维管束进行，花粉母细胞发育成小孢子。第二阶段花药膨大，小孢子进一步发育成花粉，随之，花药组织解体，花药开裂，花粉释放。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 图 药的分化（ Ma et 2005） 10,12: 表示花药的发育时期 ; 在 16， 7， 8， 10， 12 中代表 25m; 孢子细胞； E: 表皮层 ; 药室内壁 ; 2,1,2,3 层 ; 中层 ; 小孢子母细胞 ; 孢子 ; 花粉粒 ; 初生周缘细胞 ; 造孢细胞 ; 隔 ; 次生周缘细胞 裂口 ; T: 绒毡层 ; 四分体 . 10,12 25m; E: 2,2,3; T: 依据形态学、细胞学观察，花药的发育被划分为 14 个时期，如图 示 12 个时期。时期1上述的第一阶段，而时期 9于第二阶段。在时期 1 雄蕊原基分化为三个“胚”层，即。时期 2细胞发育成花药的表皮层（ E）， 成管状的连接四个药室的药隔、维管束物质；在时期 2， 细胞分化成孢原细胞，孢原细胞在时期 3 分化成初生周缘细胞（ 造孢细胞（ 初生周缘细胞位于表皮层下，包围造孢细胞；初生周缘细胞在时期 4 时发育成两层次生周缘细胞（ 外层的次生周缘发育成花粉囊壁的药室内壁和中层，内层 的次生周缘细胞发育成绒毡层的外层， 胞层提供了绒毡层内层细胞；时期 5 时，花药形态建成，有四个药室，每个药室有四层细胞，从外到内是表皮层（ E），药室内壁（ n），中层（ 绒毡层（ T）。这四层细胞包围的就是花粉母细胞。从时期 6 开始，花粉母细胞开始进行减数分裂，并游离于绒毡层形成子囊腔，同时胼胝体开始沉积在减数分裂的细胞上；时期 7 完成了减数分裂形成四个单倍体小孢子的四分体；时期 8 时，胼国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 胝体壁降解，小孢子释放。小孢子在 9期发育成花粉。时期 10 和 11，绒毡层降解；时期 12，花粉开始有丝分裂形成功能花粉粒；时期 13 时花药开裂，释放功能花粉；时期 14 时花药委缩。 粉发育与雄性不育 花粉的发育过程是非常复杂的，所以任何影响花药和花粉发育必需基因的突变，都有可能导致雄性不育。根据败育发生的时期，雄性不育分为下列几种表现型： （ 1） 雄蕊退化或变形 如果败育发生在雄性器官分化的早期，可能使整个雄蕊的发育失败，例如雄蕊退化只剩痕迹，或雄蕊变成花瓣（雄蕊心皮化）等。 （ 2） 花药异常 除花药外，雄蕊的形状正常或基 本正常，但花药较瘦小干缩，或有非正常色泽而变白或变褐，或花药不正常开裂或不开裂，花药内一般无花粉，少数有败育花粉或少数正常花粉。 （ 3） 孢子囊退化 花药外形接近正常，但由于花药没有造孢细胞，或孢母细胞减数分裂不正常，或在四分体时期败育，从而使花药内没有花粉或只有少量花粉。 （ 4） 小孢子退化 一般花药近于正常，花药内有败育花粉。根据花粉败育程度不同，常常又分为典败、圆败和染败。典败为单核期小孢子败育；圆败为单核中后期至双核早期发生败育，花粉圆形，无淀粉积累；染败是在双核后期异能染色时停止发育。 （ 5） 花粉功能缺陷 花粉形态正常，也能染色，但在正常条件下不能萌发，只在某些特定条件下才能萌发，形成花粉管。 药败育与花丝、花药维管束的发育 花药败育与花丝、花药维管束的发育异常有关（廖兰杰和徐乃瑜， 1998）。关于花药维管束变化的研究，在番茄、小麦、高梁、玉米、水稻等作物上均有报道（胡适宜等， 1977； 1982；王台等， 1982；徐树华， 1984；夏涛等， 1989；孟金陵， 1995；）。 （ 1966）曾观察到雄性不育小麦花药药隔维管束发育不良。刁现民（ 1980）在研究谷子 显性雄性核不育花药发育时，发现不育株表现败育的花药药隔维管束分化不良，特别是维管束鞘细胞不能形成。众所周知，维管束是植物的输导组织，运输有机物、水分、矿物质及无机离子。此外，有些植物激素如细胞分裂素和赤霉素也可通过维管束运输（ et 1972）。因此输导组织在植物生长和发育过程中的重要地位不言而喻。维管束鞘细胞代谢活性也直接影响物质的交换和运转。在本实验中观察到可育株维管组织发达，导管数量多，薄壁细胞内容物丰富，排列有规则，并有淀粉的积累，而不育系的维管组织分化不良，导管少，口径小。在 纯合不育株的花丝维管束的导管还可看到有其它物质存在，类似于侵填体。同时薄壁细胞畸形，液泡化非常严重，排列非常紊乱，薄壁细胞之间互相融合成一大片状，并有核迁移现象。不育株导管少，筛管分子比可育株少 2 3 个；维管束薄壁细胞排列紊乱，细胞质解体严重，细胞器少。尤其在纯合不育株中还发现薄壁细胞互相融合，核迁移的现象，它不同于以前所观察到的细胞之间的核转移（郑国 錩 ， 1956；娄成后， 1956），它们是细胞之间通过胞间连丝而发生的，是细胞的一种正常生理现象。而我们所看到的则是由于液泡化严重，液泡膜破裂使水解酶得不到控制 和有效的保护，在胞质内任行其事，使细胞内含物解体。这些降解物可能通过导管纹孔被运转到导管腔内，阻塞导管，使物质得不到有效的运输，中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 具体物质是什么，要通过细胞化学进一步确定。由于液泡化所产生的膨压又可推动核的迁移，导致细胞的结构和功能受到破坏，薄壁细胞内不能贮存有机物供小孢子发育所需。雄性不育基因不仅在性细胞中有所表达 , 而且在体细胞中也有特异表达。 粉败育与绒毡层发育 绒毡层是花药壁的最内层体细胞，一般认为，它是由初生壁层衍生而来的。在发育早期，绒毡层包围着花粉囊，绒毡层细胞之间彼此通过细胞 之桥连接起来。在花粉发育晚期，绒毡层开始降解。发育后期的绒毡层可能仍然与花粉壁保持联系。绒毡层在减数分裂过程中进行特殊的分裂，形成两个或更多核 ,并具有极性分泌特征的细胞。从绒毡层细胞的超微结构可以看出 ,细胞内含有大量核糖体、线粒体、内质网和高尔基体等细胞器。根据绒毡层发育后期的形态上的差别，可以分为腺质（分泌）绒毡层和变形（周原质团）绒毡层两种类型。在小孢子形成过程中，绒毡层分化形成双核的、具极性的分泌细胞层。细胞学分析表明，绒毡层细胞质膜的内表面含有许多的囊泡，通过向花药室中分泌大量的碳水化合物、蛋白质、 脂类等物质，促进花粉的发育或变成花粉外壁的重要成分 (et 1985; 1987; 1992)。正因为绒毡层细胞与发育的小孢子或花粉之间存在着一种直接接触的“生化对话”关系，当这种正常的交流出现紊乱时，就会导致雄性不育。许多作者都认为雄性不育的发生是与绒毡层正常的发育途径受干扰有关(et 1997; et 1997; et 2001)。 近年来，采用遗传学方法鉴定了一些导致雄性不育的突 变体 (1988)。大部分细胞生物学证据表明这与绒毡层细胞的功能失常有一定的关系，如玉米的 变体。 （ 2000）对玉米的两个隐性雄性不育突变体 小孢子发育进行了研究 ,发现形成绒毡层的细胞分化形成两层细胞 使花粉壁含有 5 层细胞，发育不正常。而 不能正常分化形成绒毡层，导致花粉母细胞在减数分裂前期 始时败育。因此可以推测绒毡层细胞并不是独立对小孢子起作用。换句话说，在花粉发育过程中绒毡层细胞和小孢子是互相依赖的。（ 1998）在拟南芥的 性不育突变体中发现绒毡层提早降解对花粉发育的影响，是导致花粉在单核靠边期败育的直接原因。 （ 1999）在对拟南芥雄性不育突变体微结构的观察中发现绒毡层细胞在减数分裂前期就形成了合成和分泌胼胝酶的粗糙内质网，成垛叠状（而相应野生型的内质网则到了四分体时期才开始形成），这样就导致了包裹花粉母细胞和四分体的胼胝壁过早降解，致使花粉败育。 （ 2001）在对高温胁迫下绒毡层细胞的超微结构观察中看到高温影响了绒毡层细胞的内质网膜结构，从而导致了绒毡 层的提前降解并使花粉败育。 （ 2002）在对大豆细胞质雄性不育花药的电镜观察中发现绒毡层细胞中线粒体内膜首先发生了降解，内腔异常扩大；接着内质网呈现出了不规则的同心环结构，这些异常变化使绒毡层细胞降解，最终影响了小孢子的发育，使花粉败育。 （ 2002）在拟南芥雄性不育 花药中观察到起源于绒毡层的营养物质减少，推测绒毡层细胞生物合成活性的下降影响了小孢子发育，导致花粉败育。谢潮添等（ 2004）在白菜细胞核雄性不育系中发现：白菜花粉粒中的储存物