【毕业学位论文】（Word原稿）口蹄疫病毒基因重组腺病毒活载体疫苗研究预防兽医学博士论文

I 密级 : 机密 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 口蹄疫 病毒 基因重组腺病毒活载体疫苗研究 文缩略词表 缩写词 英文 中文 联病毒 Ad 病毒 苄青霉素 原递呈细胞 洲猪瘟病毒 牛腺病毒 3 型 乙烯亚胺 生长激素 仓鼠肾细胞 牛疱疹病毒 1 型 牛血清白蛋白 病毒性腹泻 犬腺病毒 2 型 of 化群 补 胞毒性 T 细胞 ,3苯二胺 突状细胞 肥大型肌营养不良 s 限必需培养基 氧核糖核酸 二胺四乙酸 联免疫吸附测定 0 禽腺病毒 10 型 牛血清 . 蹄疫 蹄疫病毒 色荧光蛋白 0% 鼠半数感染剂量 粒白细胞 型肝炎病毒 巨细胞瘤病毒 根过氧化物酶 纯疱疹病毒 鸡疱疹病毒 染性法氏囊病毒 传染性鼻气管炎病毒 扰素 免疫球蛋白 G 部核糖体进入位点 B 培养基 多糖 克隆位点 s 立克病毒 要组织相容性复合体 of 染 复 数 使 -4,52,5甲基偶氮唑盐 ew 城疫病毒 羊腺病毒 密度 酸盐缓冲液 合酶链式反应 物血凝素 狂犬病病毒 髓灰质炎病毒 氨酸甘氨酸天门冬氨酸 糖核酸 组猪腺病毒 瘤病毒 转录 二烷基磺酸钠 猴空泡病毒 0% 织培养半数感染量 染性胃肠炎病毒 助性 T 细胞 瘤坏死因子 内瑞拉马脑炎病毒 泡性口膜炎病毒 V 口蹄疫 病毒 基因重组腺病毒活载体疫苗的研究 摘 要 本研究利用缺失 基因的人 5 型复制缺陷型腺病毒载体，构建成功了表达 型 口蹄疫病毒（ 结构蛋白和非结构蛋白基因的重组腺病毒，并进行了体外和体内免疫学研究 。 （ 1）采用基因操作方法， 连接 O 型 构蛋白与非结构蛋白编码区基因，将其置于 腺病毒穿梭载体的 巨细胞瘤病毒（ 动子和 )尾巴之间，构建成目的基因表达盒。通过细菌内同源重组的方法，分别构建了含不同长度 构蛋白、 2A 和3C 蛋白酶的两株重组腺病毒；同时构建了含有全长结构蛋白、 2A、 3C 和 3D 蛋白酶编码区的重组腺病毒，分别命名为 中 1列，而 目的基因的 55 个氨基酸残基。细胞内表达产物检测显示， 转染 胞的 以有效的表达目的基因，最后用于动物免疫试验。序列测定表明， 组腺病毒所带目的基因氨基酸序列完全正确，而 组腺病毒 中的 目的基因存在 5 处氨基酸的替换。两种重组病毒均可稳定的携带目的基因传代。 （ 2） O 型 基因重组腺病毒豚鼠免疫试验结果表明，用 110821080000毒攻击，保护率分别达 5/6 和 6/6， 应用间接 法可以检测到有免疫豚鼠产生了特异性的抗体应答 。而相同免疫剂量的 组腺病毒免疫组仅产生了部分的免疫保护，保护率 仅 为 1/6。 生型腺病毒和 射对照组均未产生任何的免疫保护效果。组腺病毒在豚鼠体内取得较好的免疫效果，说明该株重组腺病毒可以 在 豚鼠 体内表达目的基因， 表达产物 作为一种内源性 的抗原来刺激机体产生保护性的免疫反应。组腺病毒未取得较好的免疫效果，插入片段过大（约为 造成目的基因表达量下降可能是免疫效果差的主要原因。 此外， 目的基因 中 存在氨基酸 变化，其中 24 位的 变为 能会影响目的蛋白的抗原结构， 但可能不是主要原因 。 （ 3）根据豚鼠免疫攻毒试验结果，选择 组腺病毒进行猪体免疫试验。用1109重组病毒一次 肌肉注射 免疫猪， 28 天后用同型 体适应毒进行攻击，免疫猪可以抵抗 20 个猪最小发病量 （ 的 毒攻击，保护率达 3/4，另外 1 头猪至攻毒后第 8 天时， 才表现 出临床症状。对照的 3 头猪在攻毒后 3 天均表现出典型的 应用液相阻断 检测 免疫猪的体液和细胞免疫应答 ，证明重组腺病毒介导的免疫保护与特异性的抗体和细胞免疫应答有关 。 （ 4）采用类似的方法，构建了两株 A 型 基因表达盒，分别含有 3因编码区，同样置于 E 启动子和 )之间。将目的基因表达盒通过 和 有酶切位点 直 接连接插入 病毒骨架载体中，构建 了 分别表达 1 因的重组腺病毒，分别命名为 同时构建了带 因的真核表达质粒（命名 用两 重组腺病毒免疫豚鼠，免疫后 4 天，对 组病毒免疫组 再 用 粒 疫 1 次 。免疫后 40 天，用 10000同型 鼠适应毒进行攻击。结果：独免疫或用质粒 强免疫组均产生了较好的免疫保护 ，保护率分别达到 6/6和 5/6；而 疫组尽管发病时间推迟，但最终出现继发性水泡，未能 完全保护，测序证明，在 3C 编码区存在 3 个氨基酸的改变，提示免疫失败可能与结构蛋白前体未能被有效的加工为 4 种成熟的结构蛋白有关 。 采用微量细胞中和试验测定攻毒前和攻毒后血清中和抗体的变化，结果 疫组产生了中和抗体，但存在个体差异。初免后 4d 用 加强免疫组豚鼠 原攻毒部位病损 较 腺病毒 单独免疫组轻 , 说明 免对免疫效果有增强作用， 但中和抗体水平 并 没有 明显的 升高， 这可能与加强免疫的时间不适当 有关。 以上试验 证明，腺病毒活载体疫苗是一种有效的载体疫苗类型，有望开发出可以应用 性的口蹄疫载体疫苗。 关键词：口蹄疫病毒，腺病毒，活载体疫苗， 苗 1 3 (of of to of in in (1) By (A) in a By in 1C 9 1CD a 15 at of in by is D in （ 2） 21080000 5 , a in is a of a as a of of is is rg 24 of (3) 1098 of 0 s of of th MD in is in be a MD (4) 13C by by A 1a to be by or NA 0000(100%) (, NA a at to an be to a C of is a (5) to we is a on X 目 录 第一章 序 言 . 1 1 口蹄疫研究概述 . 1 口蹄疫（ 口蹄疫病毒（ . 1 因组结构与功能 . 2 防治 . 3 2 腺病毒载体在基因治疗和疫苗研究中的应用 . 4 腺病毒的分子生物学研究概况 . 4 重组腺病毒载体的类型及构建策略 . 6 腺病毒载体在基因治疗中的应用 . 7 腺病毒载体在人载体疫苗研究中的应用 . 8 腺病毒载体在动物载体疫苗研究中的应用 . 9 小结 . 9 3 口蹄疫病毒分子疫苗研究进展 . 10 基因缺失标记疫苗 . 10 基因工程活载体疫苗的研究 . 12 蛋白亚单位疫苗 . 16 合成肽疫苗 . 17 苗 . 18 小结 . 18 第二章 O 型口蹄疫病毒多基因腺 病毒穿梭质粒的构建 . 19 1 材料与方法 . 19 质粒载体与宿主菌 . 19 引物 . 19 3C 基因的连接 . 21 T 载体的连接 . 23 接片段插入穿梭载 体 . 23 2 结果 . 24 两种 组质粒的 酶切鉴定 . 24 鉴定 . 25 3 讨论 . 27 第三章 O 型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建 . 29 1 材料与方法 . 29 细胞、菌株和质粒 . 29 X 受态菌的制备 . 30 细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒 . 30 重组腺病毒质粒转染 胞制备初代重组腺病毒 . 31 病毒的传代培养 . 31 测目的基因的表达 . 31 荧光抗体检测目的基因的表达 . 32 双抗体夹心检测目的基因的表达 . 32 测目的基因的表达 . 33 组病毒的稳定性 . 33 组病毒的毒价测定 . 33 组腺病毒的电镜观察 . 34 2 结果 . 34 性重组菌的制备 . 34 重组腺病毒质粒的鉴定 . 34 重组腺病毒转染 293 细胞 . 34 测重组病毒的产生 . 36 重组病毒的稳定性 . 36 间接荧光抗体法检测目的基因的表达 . 36 双抗体夹心 测目的基因的表达 . 36 测目的基因的表达 . 37 组病毒的效价滴定 . 38 镜观察结果 . 38 3 分析与讨论 . 39 第四章 O 型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒的豚鼠免疫试验 . 40 1 材料与方法 . 40 基因重组腺病毒的制备 . 40 鼠适应毒 . 40 试验动物及分组 . 40 血清抗体效价测定 . 40 攻毒保护力试验 . 41 2 结果与分析 . 41 血清间接 体测定 结果 . 41 攻毒保护试验结果 . 42 3 讨论 . 42 第五章 O 型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒猪体免疫试验 . 44 材料与方法 . 44 细胞和培养基 . 44 重组腺病毒 . 44 O 型 毒株 . 44 试验动物及分组免疫 . 44 液相阻断 测口蹄疫病毒抗体 . 44 测淋巴细胞转化率 . 44 攻毒前和攻毒后非结构蛋白抗体的变化检测 . 45 攻毒试验 . 45 2 结果 . 45 淋巴细胞转化率测定结果 . 45 用液相阻断 测血清抗 体 . 46 非结