【毕业学位论文】（Word原稿）玉米种质更新过程中遗传完整性变化的影响因素研究作物遗传育种硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 玉米种质更新过程中遗传完整性变化的影响因素研究 .) .) 摘要 保证基因库中种质资源的安全保存和科学更新，确保种质在贮藏及更新过程中维持其遗传完整性是种质安全保存研究的最核心课题。因此开展基因库 异质种质 材料遗传完整性变化影响因素的研究具有非常重要的现实意义。本研究以本地白玉米、黄小玉米、小白酥、安东黄、条花糯和加红早 6个玉米农家种作为研究对象，利用形态标记和 探讨种子老化、繁殖群体量和取样方式等因素对种质遗 传完整性变化的影响，为异质种质繁殖更新标准的制定提供科学的理论和实践依据。主要结论如下： 1、 通过对 本地白玉米、黄小玉米、小白酥、安东黄、条花糯和加红早等 6 个玉米农家种田间农艺性状观察分析，结果 表明不同老化程度的亲本种子对玉米当代株高、穗位高、穗长、穗粗、穗行数、主茎叶片数、主茎粗等形态农艺性状变异没有产生 明显 影响。 2、 利用 子标记技术，对来自 国家种质库 高发芽率和 山西农科院风干室 低发芽率的 玉米小白酥种子 更新后代群体以及未更新 国家种质库 原种进行遗传分析。结果表明， 繁殖后代的群体和未更新原种群体，其多态性位点 数、多态位点百分率都为 45 和 但国家库和 山西农科院 更新后代群体 比未更新群体分别丢失了 8 个和 10 个等位基因，同时多出了 2 个等位基因。再结合等位基因频率 差异显著性测验以及遗传距离图的结果，表明 种子老化影响子代遗传变异远小于更新过程中繁殖群体量、种子老化以及田间选择压力等因素影响的作用。 3、 利用 叶鞘色 形态标记和 子标记方法，对 200株、 100株和 50株三个 不同繁殖群体量的条花糯玉米更新后代群体 及未更新原种 进行遗传分析。结果表明， 随着繁殖群体量的下降，更新后代群体籽粒颜色种类逐渐变少，叶鞘色的红色与 白色比率下降。 等位基因数、多态性位点数、多态位点百分率也 同样 随着繁殖群体量的减少和取样穗数的单一呈现降低的趋势。与未更新原种群体相比， 200 株、 100 株和 50 株 更新后代群体 分别丢失了 2 个、 5 个和 4 个等位基因， 200 株 更新后代 还多出 1 个等位基因。进一步进行等位基因频率差异的显著性测验、遗传距离树状图和计算机模拟分析 表明， 繁殖群体量为 200 株，其保持原种种质遗传完整性优于繁殖群体量为 100 株和 50 株 。 4、 对于 相同繁殖群体量的更新群体，从不同穗上获取等数量种子作为基因库种质保存材料，其群体的多样性要高于从同一个穗中 的取样。 5、 初步认为叶鞘色可作为研究种质群体子代与亲代之间的群体遗传组成形态变异的参考指标。 关键词：玉米，遗传完整性，繁殖群体大小，更新， 质保存 of to of in is It is of to of in of SR in to of on of so as to a as 1、 of by on of of 2、 of of 1 of in of It of of of of of 5 of in 1 of on of of of in 3、 of 00, 100 0 of 0 of of of of of of of 00, 100 0 , 5 00 00 00 0 4、 It of a of of a of 5、 in of 录 第一章 引言 1 质遗传完整性变化的研究意义 1 质种质材料遗传完整变化的影响因素 1 子老化 与休眠 1 殖群体的大小 2 择压力（繁种地点和种植密度） 3 种地点 3 植密度 3 粉方式和收获方式 4 子繁殖的世代数 4 质资源遗传完整性变化的分析评价方法 4 传完整性变化的类型 4 艺性状 5 色体畸变 5 活性、蛋白图谱变化 5 传物质 6 传完整性变化的检测方法 6 记 6 7 7 7 传完整性变化的统计分析方法 8 析方法 8 计方法 8 前的主要问题 9 究目的与技术路线 10 验目的 10 术路线 10 芽率下降对遗传完整性影响试验的技术路线 11 同繁殖群体及取样方式对遗传完整性影响试验的技术路线 12 第 二 章 种子老化对玉米种质农艺性状变异的影响 13 料与方法 13 料 13 法 14 验 地点和设计 14 V 间农艺性状调查 15 获方式 15 计方法 15 果与分析 17 间出苗率及茎色等性状调查 17 样性指数及其 t 测验 17 准差、变异系数检验 17 论与小结 18 第 三 章 种子老化影响玉米种质遗传完整性变化的研究 28 料与方法 28 验材料 28 栽实验和幼苗叶鞘色的观察记载 28 米 28 28 30 量的检测 31 度和纯度的检测 31 析 32 物 32 32 应程序 36 增产物的电泳 36 染显色 38 据处理与分析 38 论与分析 39 同处理样品群体的种子发芽率及叶鞘色比率 39 株取样与混样的效果比较 40 试群体的等位基因数与多态位点数比较 44 试群体的等位基因频率的 t 测验 46 代之间的“遗传漂变” 47 传距离树状图 49 论与小结 49 第四章 繁殖群体量和取样方式影响玉米种质遗传完整性变化的研究 51 料与方法 51 验材料 51 粒颜色的观察和记载 51 栽实验和幼苗叶鞘色的观察记载 51 米 51 析 52 物 52 应体系 55 应程序 55 扩增产物的电泳 55 数据处理与分 析 55 结论与分析 55 不同繁殖群体量、取样方式与籽粒色、叶鞘色比率的变化关系 55 供试群体的等位基因数与多态位点数比较 56 5个群体 60 试群体等位基因频率的 t 测验 61 代之间的遗传漂变 62 传距离树状图 64 论与小结 64 第五章 “瓶颈效应”的计算机模拟 66 料与方 法 66 结果与分析 66 论与小结 69 第六章 讨论与结论 70 子老化对玉米种质遗传完整性的影响 70 态性状变异 70 子水平上遗传完整性的变化 71 殖群体量对玉米种质遗传完整性的影响 72 样方式和繁殖世代数对玉米种质遗传完整性的影响 73 论 73 参考文献 75 致 谢 81 作者简历 82 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 1 第一章 引言 质遗传完整性变化的研究意义 遗传完整性 (广义上指种质原始遗传组成状态，即在繁殖保存过程中要使其群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率分布及等位基因频率分布和其原始群体一致。根据种质的遗传组成，作物种质资源可分为两大类：遗传上同质种质材料（ 和 遗传上异质种质 材料 （ 。遗传上同质种质 即意味着种质 材料 个体 之间 基本上具有相同的遗传结构，它包括自花授粉的现代品种、 异花授粉作物的 自交系。遗传上异质种质意味着 同一种质材料其个体之间在基因型上均是不同的，包括原始地方品种、异花授粉作物栽培品种、野生种质材料等。异花授粉作物如玉米、甜菜、向日葵等则是属于这一类。他们具有高度杂合性和异质性，没有基因型完全相同的个体，构成一个遗传基础复杂又保持遗传平衡的异质群体 (潘家驹， 1992；遗传学， 1987),其遗传结构符合 目前，大多数作物种质资源主要保存在低温种质库中，如世界上已收集到 610 万份植物种质资源，约 90%是以种子形式保存在上千座低温种质库中（ 1996）。 至 2002 年底， 我国 国家种质库贮存的种质数量已达到 33万余份，长期保存的种质数量处于世界第一 （卢新雄等， 2003） ，为我国作物育种和生产提供了雄厚的物质基础。 但随着时间的延长，科学工作者又陆续发现了一些新的问题，如在德国的 因库由于 1976 年才配置必要的制 冷设施， 1996年才有必要的干燥设施，有些种子贮存不到 15 年 ,其发芽率就降至 10%以下（ et 1997， 1998）；在对我国国家长期种质库贮存种子的生活力监测中，也发现 存种子发芽率出现明显下降（发芽率从 85%以上降至 70%以下）（卢新雄等， 2001）。此外，当种质库中的种子发芽率降低到一定程度，或由于生活力监测及对外供种的消耗使得贮藏样品的数量减少时，需要定期或不定期的对种质资源进行繁殖更新。有报道指出，多达 50%的原种质样品已丧失生活力或更新后发生了遗传漂变 (et 1984)，尤其是 遗传上异质种质 材料，更容易受种子老化、繁殖群体量和授粉方式等因素的影响而失去原有的遗传完整性 (989)。因此，保证基因库中种质资源的安全保存和科学更新，确保种质在贮藏及更新过程中维持其遗传完整性是种质安全保存研究的最核心课题 (卢新雄等， 2000； et 1997)，为此，开展基因库 异质种质 材料遗传完整性的研究具有非常重要的现实意义。 质种质材料遗传完整变化的影响因素 子老化 与休眠 种子老化的过程即是种子发芽率下降的过程 ， 尽管前人研究认为染色体畸变频率与种子生活力存在负相关性，到目前还没有找到种子生活力临界值水平。对于遗传上异质种质，低的更新发芽率标准会造成以下结果：因混合群体中存在着不同基因型，若更新发芽率标准低，不仅不同存活组分的遗传变化大，而且发生某些基因型丧失的危险性也大；低发芽率的种子活力低，因而得不到好的田间出苗率；在更新过程中，对于群体中存活基因型较差的种子，遭受遗传选择中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 2 的危险性也大 (984)。所以对遗传上异质种质选择较高的发芽率更新标准是必要的(et 1984)。 国内外作物基因库繁殖更新的发芽率标准一般在 65% 85%。 荐标准为发芽率 85%，认为活力下降 15%就应该进行繁殖更新，最低临界值为 65%；美国的标准较低，为原始发芽率的50%；英国则将发芽率降低到 70%作为繁殖更新标准。一般认为此标准发芽率过低会引起遗传漂移。 同一份保存样品不同发芽率，遗传组分会有变化。 研究了贮藏 10、 40 和 72 年及一直生产应用的两份大麦 地方 品种，发现随贮藏时间的延长，发芽率下降，等位基因酶的平均基因多样性、每一位点的等位基因和平均多态位点而显著下降，品 种间的遗传差异则明显增加。 休眠一般是受遗传控制的，但种子收获前和收获后的环境条件的影响也很大。最重要的是一份材料里也有相当的差异，因此需要注意这个问题，并采取措施打破休眠，以避免繁殖过程中出现偏差。而老化和发芽率降低是改变遗传结构的选择因素。当然寿命长短的差异可能是由不同的原因形成的。比如基因型成熟的时间不同，但却在同一天收获，种子成熟不同可以影响其贮藏力。除了这样间接的遗传影响外，还有一些已知的有关种子寿命直接的遗传差异。但几乎很少关于这些因素造成遗传漂移的性质和程度的试验数据。 殖群体的大 小 从一个大群体的一些植株取回小样本，已经造成了一个“瓶颈”（没有包括那些频率低于 而不断增加繁殖世代又继续扩大了这个“瓶颈”。等位基因频率的最初变化是由随机过程造成的。对于很小的群体来说，等位基因的随机丢失所造成的遗传丢失比选择所造成的遗传丢失更大（ 970）。 繁殖群体的有效大小（ 决于同等繁衍下一代的个体数。因此在随机交配群体无限大的情况下，其基因型频率取决于等位基因的频率。但在小群体中，后代数量的相对增加，将会发生自交， 造成等位基因频率的随机 波动，导致等位基因丢失。 在有限的随机交配群体中等位基因丢失比率为每次繁种的 1/2过 t 次繁殖（假设有效群体数不变）后保留的杂合性和遗传异质性就仅剩（ 1 1 2t （ 1981）。 984)从保留等位基因的角度重新考虑了这个问题。发现对于有限群体，等位基因在繁殖过程中逐步丢失的，但频率较低的稀有等位基因比普通等位基因丢失的快。因此，稀有等位基因保存起来更困难一些。 若在 t 次世代繁殖中分别用 么该群体在变异性丢失上的表现，就像每次繁殖用的有效繁育群体都为 N*一样。根据下列公式： 1/N*=1/t 1/ 1/ +1/ 不难看出，我们必须保证在多次的世代繁殖过程中要有一个临界的群体大小。如果在一次世代繁殖中群体数太小，那末在其它次的繁殖时增加植株数的努力也是徒劳的（ 1996）。 人认为取样 200 株适于人工同胞授粉保持异质群体（ 981） , 1995）等认为 172 株可保持群体中频率不低于 稀有类型 等位 基因。若考虑贮藏过程中基因 突变的累积作用，只有更新群体大于等于 75 株时，突变累积作用才可以忽略（ 998）。 章元明，盖钧镒（ 1995）提出大豆地方品种种质保持中适宜样本容量为 150 200。 冯祥运等中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 3 （ 1997）认为芝麻在非隔离区种植 40 50 株，非隔离区种植 25 株即可；段兴恒等（ 1998）和范传珠等 (1999)研究表明，多花菜豆在全封闭网棚内种 50 株以上；李雅华和崔平（ 2000）认为甜菜需繁殖 50 株以上才能维持其遗传完整性。马缘生等（ 2000）认为异花授粉作物荞麦最佳繁种措施为网罩内种 50 100株；而大白菜需种 50 100 株。徐重益等（ 2004）通过对 菜薹种质内不同大小群体间遗传多样性的 出至少 60 株的结论。 而对于玉米品种资源，高楷等（ 1991）认为 50 株可保持玉米异质群体， 则建议采用 20 100 株（ 983）；而罗峥峰（ 2004）则认为需 200株。据了解，在目前我国玉米农家种种质繁殖更新的实际操作中，采用 50 株繁殖群体量，其中很重要的考虑因素是工作量问题。 择压力（繁种地点和种植密度） 种地点 在异生境条件下不能模拟原生境环境的选择压力。因而 收获的种子其基因型较之以前会有所不同 (956)。玉米的生长和开花要求特殊的条件，因此它们能自然生长的地域有限。此外，当地的水肥条件以及病虫害对它也有一定的影响。即使在适应的地区即气候相似的地区种植，这些地区与原生境的差异也同样会使组成基因型的种子生产力产生差异。这种基因型与环境条件之间的相互作用也会带来漂移。因此，种质库繁种时选择在原产地繁种。 植密度 生命形式之间最重要的相互作用就是对有限资源（光、水和土壤中的营养物质）的竞争。很显然竞争与密度相关（ 1963）。而竞争可以：（ 1）促进了混合基因型群体的表现，得到的相对产量总值（ 1960）比单种植一个基因型的高，也就是超补偿；（ 2）作为一种不连续的选择力量，有利于遗传多样性；（ 3）作为一种稳定的力量通过竞争压力或消失使多样性减少。 生长拥挤就会导致真正的竞争，对所有个体都有不利的影响，但是对有些个体的情况比另一些的更大些。如果竞争发生在苗期，而且十分严重，就会有一些选择性的消亡。 1961和 1964）在研究草栽培品种混合种植的时候，注意到在开始 9个月 90%的幼苗都死了， 加上后来的变化，不仅影响栽培品种的比例，而且有的栽培品种也发生了漂移。这种漂移的方向和大小不仅取决于植株的密度，也取决于管理和环境。主要的影响可以归纳为以下几点： （ 1） 幼龄植株死亡（也就是不同的存活率）； （ 2） 所有的个体受到影响，植株变小，繁殖力降低； （ 3） 与相邻的大植株相比，竞争力不强的个体（较小的）植株大小和繁殖产量都会不同比例的变小和降低。 因此 ,基因库繁种时，要通过低密度种植减少竞争，使每株能产最多的种子，这在种植的植株较少是尤为重要。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章引言 4 粉方式和收获方式 特定的选择压力可以阻止等位基因 的迁移，这样就可以平衡在自然条件下由花粉造成的基因流动。如果选择压力达到 70%，那么群体即使在 50 60%花粉流动的情况下，仍能保持其区别。 （ ， 1982） 。但在登记材料繁种的时候就不存在这种特定的选择压力，则即使花粉的混杂率很低也会引起显著的掺杂（ ， 1982； 1984）。因此在繁殖时确保各份材料之间适当的隔离，阻止花粉交换，是保持遗传完整性最主要的步骤。一般说来，隔离的主要方法：（ 1）空间或时间隔离；（ 2）自然的或人为的屏障；（ 3）花序套袋人工杂交。但一般采 用花序套袋人工杂交的方法进行隔离。之后进行控制的多系天然杂交，每一个母本植株都套袋，用群体所有植株的混合花粉进行人工授粉。假设每一个植株供给的花粉数量相同，这样就使植株以所有组合的方式进行杂交。 种子繁殖更新的田间种子收获方式主要有两种：混合法和平衡法。混合法田间操作简单，还可降低保存过程中基因突变累积作用产生的负影响（ et 1995）。而 研究表明，平衡法 ,即从每一单株中收获相同数量的种子，这样就可以较好的降