【毕业学位论文】（Word原稿）彩色棉生物化学和分子生物学的初步研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 彩色棉生物化学和分子生物学的初步研究 on on I 摘 要 彩色棉是一种棉纤维天然就具有色泽的棉花类型。近年来，绿色环境标志已经受到全世界各国的普遍响应和关注。彩色棉由于其加工过程无须人工染色而博得了“绿色衣服”的美誉。 作为一种健康无害、生态效益高的特种棉，彩色棉具有非常广阔的市场前景，必将掀起纺织、服装等行业的一场革命。本研究以彩色棉为实验材料，在棉纤维分子生物学和生物化学等方面进行了初步探索。 1. 比较了提取 时比较了对棉花 叶片进行不同处理后提取 为彩色棉分子生物学研究奠定了基础 。结果表明：两种方法均获得了较高质量的 鲜的棉花叶片、在 4 黑暗中饥饿 1天的叶片和在室温条件下自然干燥 1天的叶片都可以提取到质量满意的 42 干燥 1至数天的叶片提取到的 能够满足 2. 利用 8个彩色棉品系的 110对 0对扩增效果较好的引物，应用其中的 4对构建了 18个彩色棉的分子检索模式图。同时用这 10对引物对 18个彩色棉进行了聚类分析，对它们 的亲缘关系作了初步探讨。 3. 以棕 263和 用 果表明： 216对 9对在亲本间出现差异，在基因池间进一步筛选又得到 2对差异性引物，但它们均不 与棕色纤维基因 紧密 连锁。 4. 比较了甲醇浸泡、乙醇浸泡后微波加热、乙醇蒸馏、 醇蒸馏法提取纤维色素的效果，发现乙醇提取液有明显的颜色。显色反应证明：绿色棉乙醇提取液含有黄酮类物质。另外， 醇法提取液的扫描光谱与前人报道的不完全吻合，有待于进一步验证。对 提取蜡质后发现，白色棉的蜡质含量明显低于绿色棉，四个绿色棉的蜡质含量差别较大， 间，并且纤维色泽的深浅与蜡质含量的大小无相关性。 5. 对棕、绿色棉织物进行酸、碱、水、肥皂液和洗衣粉浸洗，洗涤不同次数，采用不同晾晒方式。色系分析表明，酸能加深彩色棉的色泽，碱能加深棕色棉的色泽，却降低绿色棉的色泽；水和肥皂的洗涤效果优于洗衣粉；阴干效果明显优于晒干。 6. 在霜降之后，对 岛棉和 6个彩色棉品种进行了 活性测定，结果表明：有些彩色棉的保护酶活性甚至高于白色棉和 海岛棉，因此彩色棉在寒冷胁迫下，保护酶系统代谢旺盛，具备抗寒的潜在能力。另外，三种保护酶的活性在不同彩色棉品种间的变化参差不齐。 7. 以查耳酮合成酶 (查耳酮异构酶 (黄烷酮 3二氢黄酮醇 4苯丙氨酸解氨酶 (分析对象，通过 列比对、 、三级结构分析等步骤，对这些酶的分子结构和功能进行了初步探讨， 为进一步确定这些酶基因在棉花基因组中的拷贝数 , 明确这些酶基因在纤维发育不同阶段的表达情况 , 进而 克隆这些酶基因 作了铺垫。 关键词 : 棉花， 素，蜡质，保护酶 is a of in no by it is is It a in in as on 1. NA in DS on to NA NA be by of In NA if in 2 to NA in it no CR 2. SR 8 SR 10 SR we 0 of to a of 0 of we a on 3. 582 as F2 as we SR to 19 16 SR 2 9 of of 4. of in in in of by of of We no 5. by in . on of of of of of of of in 6. we of of OD of of of of in In of 7. 3H), as ST of of of of 略词 bp cM 3H S V 目 录 第一章 引言 . 1 彩色棉的种植简史及在各国的利用情况 . 1 彩色棉的传统遗传学研究 . 2 彩色棉的生物化学和分子生物学研究 . 4 彩色棉的指纹图谱研究 . 4 彩色棉纤维的生物化学研究 . 5 彩色棉织物的洗晒处理研究 . 6 第二章 棉花基因组 提取 . 8 材料与方法 . 8 实验材料 . 8 棉花基因组 提取 . 8 对提取的棉花 行检测 . 9 结果与分析 . 9 琼脂糖电泳检测 . 9 紫外分光光度计检测 . 10 测提取的 . 11 讨论 . 12 第三章 彩色棉品系的纤维性状比较和 纹分析 . 13 材料与方法 . 13 实验材料 . 13 棉纤维性状测定和分 析 . 14 棉花叶片 提取 . 14 增 . 14 数据统计与分析 . 14 结果与分析 . 14 不同彩色棉品系的纤维性状比较 . 14 增产物的多态性 . 16 18 个彩色棉品系的 纹鉴定 . 17 18 个彩色棉品系的亲缘关系分析 . 17 讨论 . 19 第四章 棕色纤维基因的 子标记初探 . 20 材料与方法 . 20 实验材料与化学试剂 . 20 田间棉花色泽分析 . 20 棉花 取和 建池 . 20 微卫星（ 物筛选 . 20 数据统计 . 21 结果与分析 . 21 棕色棉遗传的田间调查分析 . 21 增结果 . 21 连锁分析 . 22 讨论 . 22 第五章 彩色棉纤维色素和蜡质研究 . 23 材料与方法 . 23 实验材料 . 23 纤维色素的提取 . 23 色素提取液的光谱检测 . 23 色素提取液的显色反应 . 24 纤维蜡质的提取 . 24 结果与分析 . 24 色素提取液的光谱分析 . 24 色素提取液的显色分析 . 26 白、棕、绿色棉的纤维素含量比较 . 26 绿色棉的蜡质含量测定 . 27 讨论 . 27 第六章 彩色棉洗晒处理的色泽变化分析 . 28 材料与方法 . 28 材料 . 28 方法 . 28 结果与分析 . 28 不同处理彩色棉织物的色调变化 . 28 酸碱对彩色棉织物的影响 . 29 不同洗涤剂液对彩色棉织物的影响 . 30 洗涤次数对彩色棉织物的影响 . 31 洗涤液温度对彩色棉织物的影响 . 32 晾晒方式对彩色棉织物的影响 . 33 6. 3 讨论 . 33 第七章 不同彩色棉的保护酶活性比较 . 34 材料与方法 . 34 实验材料 . 34 的提取和酶活测定 . 34 的提取和酶活测定 . 34 的提取和酶活测定 . 35 结果与讨论 . 35 八章 色素合成酶的生物信息学浅析 . 37 分析步骤 . 37 结果与分析 . 38 讨论 . 40 第九章 结 论 . 41 参考文献 . 45 致 谢 . 47 作者简介 . 48 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 彩色棉的种植简史及在各国的利用情况 彩色棉即有色棉，是一种纤维中含有色素类物质的特殊类型的棉花。据考证，四千多年前的古印第安人已经开始种植彩色棉了。早在公元前，墨西哥的乌雅族和阿西德族人也开始栽培彩色棉花了，当西班牙人 16 世纪进入墨西哥南部和尤卡坦半岛时，当地的植棉业已经很发达，岛上的居民将彩色棉纺成土布，制成民族服装在集市上出售。据秘鲁史料记载，很久以前在 秘鲁莫奇卡地区北部就有人种植彩色棉了，后来由于天灾人祸，彩棉失传了。然而， 1988 年人们在一座古代莫奇卡人墓穴的殉葬品中又发现了彩棉种子，经过发芽试验，这些彩棉种子竟奇迹般地发芽、生长、吐絮，最终长成灰白、红黄和棕色三种颜色的彩棉。我国也堪称一个种植彩色棉的古国。在十八、十九世纪，江浙一带广泛种植着一种紫黄色絮的棉花品种，其纺织出来的布就是著名的“紫花布”，曾远销欧美，倍受青睐。在今天的英国伦敦博物馆里，我们还可以看到当年用紫花布制成的英国绅士的时髦服装。 十九世纪中叶，欧洲工业革命的到来带动了纺织工业和印 染工业的的飞速发展，与此同时，人们经过长期的选择育种，逐渐培育出了性状稳定的白色棉花。于是，运用先进的印染技术，由白色棉花纺成的布料也可以变得绮丽多彩。相比之下，天然彩色棉由于颜色单调且不稳定、纤维品质差和产量低等缺点而遭受人们的冷落。 二十世纪末，健康理念和环保理念逐渐深入人心，世界范围内掀起了一股绿色消费的热潮，这时，彩色棉的开发和利用才重现曙光。据报道，在白色原棉的加工过程中，运用了 300 多种化学物质，制成的衣服中可能残留着偶氮染料、甲醛、重金属等多种对人体有害的物质，另外，工业废水中含有 众多重金属，对自然环境造成了严重的污染。然而，彩色棉恰恰由于其加工过程无须人工染色而博得了“绿色衣服”的美誉。近年来，绿色环境标志已受到全世界各国的普遍响应和关注。西方发达国家首先制定了“绿色标准”、“环境价值含量”、“纺织有害化学物质限量指标”；国际标准化组织（ 1996 年已正式将 4000 认证体系作为国际标准，即纺织品和服装要通过环保认证，才允许进入国际市场。从 1996 年到 2000 年，全世界获得 4000 认证的企业数量以每年 2的速度递增。现在，彩棉衣服正紧 跟世界服装市场的潮流，已经成为消费的一个热点，具有非常广阔的前景，众多国家也不约而同地将目光汇聚于此。 目前，美国的彩棉生产和科研水平处于世界领先地位。 1988 年，得克萨斯州棉花研究中心的两位棉花育种专家，已经开始专门从事彩棉的育种工作； 1992 年，彩棉的规模生产和市场销售开始启动，并将培育出来的棕色棉和绿色棉进行了登记注册；到 1994 年，美国生产的彩棉、原棉已达 2 万吨，占全美国棉花产量的 1。虽然后来受到了种植白色棉花的棉农们的强烈抵制，并一度处于停滞状态，但美国彩棉产业在世界棉业的领先地位仍未动摇。 我 国是继美国之后世界上第二个彩棉生产大国， 1997 年，我国种植彩棉 6000 多亩，截止到 2001年，我国彩棉种植面积已超过 6 万亩。中国农业科学院棉花研究所自 1987 年以来，采用远缘杂交、系谱选择等综合育种技术，培育出了棕絮 1 号、绿絮 1 号、棕 2 1 3彩棉新材中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 料和新品系，它们促成了我国第一批彩棉纺织品的试纺成功。 在非洲大陆上，埃及彩棉独放异彩。埃及彩棉的育种和栽培始于二十世纪七十年代中期，据悉，现已培育出浅红色、浅绿色、浅黄色、浅灰色等彩棉品种。其特点是植株高大，株型松散，棉铃大，纤维 长，强度高，品质好。但存在的主要问题是遗传性状不稳定，彩棉色泽不达标。目前，埃及还没有推出稳定的彩棉品种，然而在国际棉花市场上保持着很高的声誉。 秘鲁在 5000 年前就有棕色棉纺织品，渔民还用来编织鱼网。但后来由于引种和生产白色棉花，停止了彩色棉的种植。如今 , 秘鲁彩色棉旧貌换新颜，秘鲁科学文化艺术协会（ 立了天然彩色棉研究课题，已经培育出了米色、棕黄色、棕色、红棕色、赭棕色和紫红色等 5 种彩棉品种。1992 年，秘鲁生产和纺织了约 300 吨有机彩色棉，并销往美国、欧洲、日本等地。 印度是彩棉生产和研究 的后起之国。彩色棉研究始于 1990 年，在印度中央棉花研究所（ 有关的地区试验站和农业大学进行。 1996 年，印度农业研究委员会（ 准了彩色棉专项基金，研究彩色棉纤维的遗传规律，选育高产、优质的彩色棉品种和杂交种，采用系选法育成 二倍体亚洲棉品种。 另外，巴基斯坦、澳大利亚等国的彩棉业也具有巨大的发展潜力。巴基斯坦全国拥有棉花品种资源 1700多份，包括了棕、黄、绿、紫等众多彩棉品种。澳大利亚勃罗依拉棉花研究中心 现保存着丰富的 彩色棉种质材料 ， 1994年，天然棕色和绿色棉织成的服装正式亮相市场，织品以天然棕色或绿色与白色棉混纺而成，无任何化学染色剂，被称为 “有机棉织品 ”或 “无公害织品 ”。 彩色棉的传统遗传学研究 在上世纪二十年代，中国的冯肇传（ 1926）、冯泽芳、孙逢吉（ 1928） 就 研究 了 亚洲棉有色纤维的 遗传， 并 指出棕色是显性，白色是隐性，为一对简单性状遗传。 六、七十年代，国内外已经有许多关于棉花棕褐色纤维和植株花青色素颜色的遗传研究，其中大多数认为这些性状受单基因控制，并以不完全显性方式遗传。前苏联学 者 等用棕褐色纤维品系 和白色纤维品系 7 杂交， 乳油色，即中间色； 离出 3 种颜色纤维：棕褐色、乳油色和白色，其比例接近 1 2 1，但它们之间并没有明显的界限，因此修饰基因对棕色基因有效应作用，另外，光照条件对纤维颜色也起作用。 等还研究了植株花青素颜色的遗传，他们用植株表面为深花青色的 和普通绿色的 7 杂交， 中间色， 离出 3 种颜色的植株：深花青色、中间色和绿色，其比例接近 1 2 1。 前苏联学者 报道了白色纤维棉花品种与褐 色纤维的墨西哥半野生棉品种杂交群体纤维色泽的分析。他的研究表明，棉花纤维色泽受 3 对等位基因（ 制， 2 个主要的互补基因，缺乏其中任 1 个显性等位基因，纤维色泽为白色； 3 个基因均为显性纯合状态或只有 杂合状态时，纤维色泽为棕褐色；当缺乏显性等位基因而具备 显性等位基因时，纤维色泽为浅乳黄色；其余基因型均表现为乳黄色纤维的性状。特定的基因型与所对应的表型如表 示。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 表 墨西哥半野生棉品种基因 型与表型 of 因型 表型 褐色 黄色 乳黄色 色 上世纪七、八十年代，美国学者 用传统的遗传学方法，对绿色棉和棕色棉进行了更为深入的研究。他在 1985 年 报道，对绿色纤维、绿色短绒品系 白色纤维、绿色短绒品系 研究表明，这 3 个品系控制绿色纤维或绿色短绒的基因，位于 D 基因组 15 号染色体的 点，在此位点上，控制绿色纤维、绿色短绒的基因被命名为 制白色纤维、绿色短绒的基因被命名为 在同一篇文章中， 对不同的棕色棉品系进行了研究，他深化了前人的研究成果指出，控制棕色纤维基因的位点涉及 7 个： 中， 于 1957 年将 别定位于 6号染色体和 号染色体上。 这 4 个品系中，控制深棕色纤维的基因位于 点上；在品系 制棕色纤维的基因被命名为 时还存在一个附加的控制浅棕色纤维的基因，被命名为 和 4 个品系中，控制浅棕色纤维的基因位于 6 号染色体的 点上；品系 控制浅棕色纤维的基因分别被命名为 在我国，九十年代末掀起了一个研究彩色棉的小 高潮。张雪林（ 1997）对培育出来的彩棉品系绿89、绿 104 和棕 20 进行了深入的研究，推断棕绒是由一对显性基因控制的，而绿绒则可能是由众多基因控制的。耿军义等（ 1998）对若干彩棉品种研究后指出，陆地棉棕色或绿色纤维性状受单基因控制，并表现为不完全显性。朱乾浩等（ 1998）的研究也表明，棕色纤维性状呈单基因不完全显性遗传。王留明等（ 1999）的研究结果显示，棕色棉 8890 的棕色纤维性状受单基因控制；然而，他们用白色棉徐 203 与绿色棉 8891 做正反交，又用徐 203 与绿色棉 8892（做父本）做杂交，在 3 个组合的 ，绿色植株与白色植株均不符合 3 1 比例，于是他们推测，品种徐 203 可能存在着对 因表达起抑制作用的隐性突变基因，并与 因独立遗传，只有在该基因呈显性状态时， 因才能表达。周雁声（ 2000）用白色棉与棕色棉杂交，无论正反交 纤维均为浅棕色， 离为棕色、浅棕色与白色，且符合 1 2 1 的比例，进一步说明棕色纤维性状由一对不完全显性的单基因控制。张秉贤（ 2000）对彩色棉研究后认为，纤维色泽主要受一对基因控制，尤其是棕色棉表现得更为明显；绿色棉的 中，有一部分植株表现为白色纤维、绿色短 绒，说明在一对主基因的控制下，还存在着一些微效基因。石玉真等（ 2001）研究认为，棕色纤维由一对主效基因控制，表现为不完全显性遗传，棕色纤维相对白色为显性，同时，棕色纤维显性性状的表现还受控制短绒色泽的隐性基因的抑制。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 迄今为止，人们通过对旧世界棉和新世界棉的遗传学研究，已经将彩色棉纤维色泽基因定位于特定的连锁群和染色体上，如表 示。 表 纤维色泽基因及对应连锁群和染色体 制的性状 基因符号 所在连锁群 所在染色体 深棕色纤维 7 浅棕色纤维 6 - 白色纤维 16 绿色纤维 彩色棉的生物化学和分子生物学研究 彩色棉的指纹图谱研究 生物指纹图谱是能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱，它具有多态性丰富，快速准确等优点，是鉴别品种、品系（含杂交亲本、自交系）的有力工具。目前， 子标记技术正迅速兴起，它是继形态学标记（ 细胞学标记（ 生化标记（ 后发展起来的一种新型遗传标记，已经被广泛应用于品种指纹图谱的构建和品种亲缘关系研究等领域。几种典型的分子标记有 。 制性片断长度多态性 ) 于 1974 年，是较早应用于基因标记的一项分子技术。由于不同基因型之中内切酶位点的碱基插入、 缺失、重组或突变，当利用限制内切酶消化基因组 ，会产生大小不同的 段，电泳后通过 迹杂交，将这些大小不同的 段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后用特异的探针进行杂交，最后通过放射性自显影或其他显色技术显示杂交结果，从而揭示出 优点是：无表型效应，其检测不受环境条件和发育阶段影响；共显性，可以区别纯合基因型和杂合基因型；可利用的探针很多，可以检测到很多遗传位点。缺点是：对 量要求高，需要量大，操作复杂，并且通常要接触放射性。 机扩增多态性 ) 于 1990 年建立的通常以 10 碱基的寡核昔酸序列为引物，对基因组 机扩增，从而得到多态性图谱作为遗传标记的方法。与 比，它对 量要求不高，需要量极少，操作简单易行，不需要接触放射性。但不足之处是，绝大部分 显性标记，不能区分基因型是纯合的还是杂合的，每个标记提供的信息量少，再者重复性差。 增片断长度 多态性 ) 统由 明，并已获欧洲专利局的发明专利。 基于 应的一种选择性扩增限制性片段的方法，其原理为基因组 限制内切酶消化，然后连上一个接头(利用两个选择性引物进行 增。它既有 可靠性，也有 灵敏性。在中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 遗传上 记为显性或共显性。它的最大优点是多态性丰富，重复性好，能用于构建高清晰度的遗传图谱。缺点是需要用同位素来检测，相对比较费时耗财。 单序列重复 ) 由几个核苷酸 (2 5 个 )为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，广泛分布于整个基因组上，由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点多态性。扩增出的 以检测出复等位基因的差异，常表现为共显性。 记是品种间系谱分析、指纹图谱构建和分子标记辅助选择育种等领域的有用工具，是应用较为广泛的遗传标记。但 析的缺点是必须针对