【毕业学位论文】（Word原稿）油菜杂种优势形成过程中基因组DNA甲基化模式研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 油菜杂种优势 形成过程中 基因组 基化模式研究 o. 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第一章 引言 I 摘 要 杂种优势的机理一直是生命科学研究中一个尚未解释清楚的重大基础理论问题 。自杂种优势这一概念由 1914 年首次提出以后，许多学者进行了不懈的探索，相继提出了一些有关杂种优势形成 机理 的假说，其中最著名的有显性学说 和 超显性学说等。近些年来 ， 随着分子生物学及表观遗传学的发展，科学家们开始从基因表达调控和 基化 等 方面来揭示杂种优势 形成 的分子机理。 本实验的研究对象为油菜 本 )， 本 )， 2杂种 )， 2自于 。其中 ， 杂种 2株高、叶片数、最大叶宽等生理指标相对于亲本具有一定的优势， 与 母本更为相似，表现出一定的单亲优势。 基化修饰在基因表达调控 、 植物细胞分化 、 基因组印记以及系统发育中起着重要的调节作用。本研究 旨在探讨油菜杂种优势形成 过程中基因组 基化 模式的变化 。 首先，利用 技术 研究了杂种 油菜基因组 胞嘧啶的甲基化模式与其亲本基因组甲基化模式的差异。结果表明 ， 杂种油菜的基因组 基化 模式 与其亲本 之间 存在一定程度的差异，根据杂交种 及其亲本 的甲基化状态分为四类： A 型， B 型， C 型， D 型。 A 型，杂交种的甲基化模式与两个亲本均相同 ； B 型，杂交种的甲基化模式与其中一个亲本相同 ； C 为过或超甲基化类型， 即 杂交种在 点的甲 基化程度比两个亲本在此位点的甲基化程度都要高 ； D 为次甲基化类型， 即 杂交种基因组 点甲基化水平比其双亲都要低。 之后，对克隆的 38 条甲基化 模式 差异条带进行了序列测定，通过 析 ，其中的 18 条 甲基化多态性片段与 已知序列表现出不同程度的序列同源性。 利用甲基化敏感酶 基因组 行 迹 分析是鉴定其 甲基化 程度常用的方法。作者 采用这一技术对杂种油菜及其亲本的 5 着丝粒重复序列的甲基化 模式进行了比较 ， 发现这两种序列内的 点（即 识别位点）的甲基化程度在杂种油菜及其亲本之间并 没有明显差别。 亚硫氢酸盐测序也 是检测基因组 嘧啶核苷酸甲基化 常用 的方法，通过这种方法可以得到 所研究基因 中每一个胞嘧啶 甲基化状态的信息 。对5行 亚硫氢酸盐测序，发现 这段序列中含有的三个 点和一个 点甲基化程度很高，都在 50%以上 ， 其他位点的胞嘧啶都有不同程度的甲基化。虽然 个别位点 的胞嘧啶甲基化程度在杂种油菜与其亲本间有一定的高低变化， 但是 从整体上 来说，差别不大， 而且胞嘧啶甲基化程度 高低 变化趋势基本相同。 基化就是在 制后，甲基转移酶（甲基化酶）催化将 甲硫氨酸上的甲基基团连接到 子的胞嘧啶碱基上，进行 饰的过程。在这个过程中，甲基转移酶起着重要的作用。 果表明，两种可能的甲基转移酶（ 分别与 拟南芥中的 的表达在这杂种油菜与其亲本之间也没有什么明显变化。 以上结果表明，本实验中 所用 的杂种油菜与其亲本间的甲基化模式 在全基因组范围内 确实存在一定 程度 的差异，杂种优势的产生可能与杂种 基因组 某些位点 甲基化模式的改变有关。虽然重 序列的甲基化与基因表达密切相关，但 5着丝粒重复序列的甲基化模式却没有明显变化。胞嘧啶甲基化虽然是由甲基转移酶催化，但这两种可能的甲基转移酶的表达在杂种油菜与其亲本中没有明显变化。 以上结果表明，油菜 杂种优势 形成过程中的甲基化模式改变可能涉及到更为 复杂的 调控机制 ，其分子机理有待进一步探索。 关键词： 甘蓝型 油菜，杂种优势，表观遗传学， 基化 he a 914, a of in of to at of NA A 22H NA is to an in In we NA NA of by is of a of to of , B, C . In ， a in in of In , in in of in an or in of in to we 8 NA 8 of to be to is NA In we to NA a 805no CR is to NA to by we CG 0%. in of to of in NA of -5 in of In is of we to to be a of a 805of in NA of is an NA in of of V 目 录 第一章 引 言 . 1 种优势的概念及其表现特点 . 1 种优势的遗传学解释 . 1 种优势的分子生物学研究 . 3 菜杂种优势的研究目的和意义 . 7 第二章 杂种油菜 2 性状表现 . 8 料 . 8 法 . 8 果与分析 . 8 第三章 杂种油菜基因组 基化位点的鉴定 . 11 料 . 11 法 . 11 果与分析 . 17 第四章 杂种油菜基因组重复序列区的甲基化 . 23 料 . 23 法 . 23 果与分析 . 28 第五章 杂种油菜 基转移酶基因的表达 . 31 料 . 31 法 . 31 果与分析 . 33 讨 论 . 34 参考文献 . 36 致 谢 . 39 作者简历 . 40 文缩略表 英文缩写 英文全称 SA B: 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 种优势的概念及其表现特点 杂种优势是指两 个遗传组成不同的亲本杂交产生的 长势、适应性、抗逆性和丰产性等表现的现象 （ 郭予琦等 ， 2001） 。杂种优势是生物界的一种普遍现象，凡是能够进行有性繁殖的生物，从真菌直到高低等动物，无论是远缘杂交还是近缘杂交，无论是异花授粉作物还是自花授粉作物，都可以观察到这种现象。杂种优势的表现是多方面的，它涉及到种子 萌发、 根系生长 、 植株形态建成以及产量水平等各个性状，还涉及到从光合生理到呼吸生理，从酶活性到激素含量变化等各种生理、生化过程及基因表达调控等一系列过程 （ et 1996） 。 人们对杂种优势现象的认识可以追溯到 1500年前 。 那时，我国就有关于马和驴杂交产生骡的记载 (蔡旭， 1988)。 而杂种优势在作物上的利用在十八 世纪 中期首先 从 烟草开始。孟德尔在他的豌豆杂交实验中也观察到了杂种优势现象，并首先提出杂种活力 (概念。达尔文在玉米中观察到了杂种优势现象，并 进行了 论述。 玉米的 生物学表现的影响中 发现，自交 容易导致 衰退 ，而 杂交有利 于优势产生 ，并首次提出了杂种优势（ 概念来代替当时流行的各种关于杂种优势的名词， 对推动杂种优势的研究起了重要作用（蔡旭，1988）。 杂种优势 主要 有以下 5个特点 （郑志强， 2005） ：（ 1） 杂种优势不只是一、二个性状单独表现出优势，而是多个性状间的综合表现 ； （ 2）杂种优势强弱取决于双亲性状间的互相补充，在一定范围内，双亲的基因差异越大，亲缘关系越远，杂种优势就越强 ； （ 3）杂种优势与双亲的基因型纯合度有关，若双亲的基因型纯合度高， 优势就强 ； （ 4）杂种只在 2、 后代由于基因分离而表现衰退 ； （ 5）杂种优势的大小与环境有关， 子只有在适宜环境下才能表现出杂种 优势。 种优势的遗传学解释 自 20世纪 30年代美国在生产上率先推广杂交玉米以来，主要农作物和许多园艺作物的杂种优势在生产上得到了广泛利用并获得巨大成功，成为推动农业生产发展的重大技术创新。但是由于杂种优势遗传基础的复杂性，以及在研究方法与手段方面的局限性，自 20世纪初至 90年代，对杂中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 种优势遗传基础的认识基本上是围绕 显性假说 (1910; 1917; et 1995; 1996)和 超显性假说 (908, 908)为核心的单基因理论而展开的。 性基因互补假说 科学家在 1910年提出了显性基因互补假说， 1917年琼斯（ 1890对这一假说进行了补充完善。该假说认为，多数显性基因是有利基因，而隐性基因多是不利基因，当两个遗传组成不同的亲本交配时，来自一个亲本的显性有利基因就会将来自另一个亲本的隐性有 害基因遮盖住，从而使杂种个体表现出优势。支持这一假说的有利证据是豌豆多节品种和长节品种的杂交试验：两个 1.8 个表现多节，但节 间短，另一个品种节数少，但节间长。将这两个品种杂交，杂种一代结合了两个亲本节多、节间长的特性，株高 et 1991)。按照显性互补假说的理论，假定上述性状是由位于同一对染色体上的 5对基因决定的，并且双亲之间这 5对基因互为显隐性关系，即如果一个亲本的基因型是 么另一个亲本的基因型就是 一假说的本质就是杂种可集合双亲的有利基因而产生杂种优势。按照这一假说，根据分离定律和自由组合定律，应该能从杂种后代中选出把全部纯合显性基因聚合起来，表现同样优势的个体。但在 实际上几乎是不可能的。显性基因互补假说虽然得到一些试验的证据（如上文中所提到的利用豌豆所做的实验），但它只考虑等位基因的显性作用，没有考虑非等位基因的相互作用。也没有考虑杂种优势的性状大多属于数量性状，并不表现典型的显隐性关系。 显性假说 伊斯特（ 1879 1938） 1936 年提出，异质性本身就是杂种优势形成的根本原因。两个自交系基因型差异程度越大，杂种优势就越大。杂种的这种差异发生于同一基因位点上，这一位点具有众多的复等位微效基因，它们有着不同的遗传组成和不同的生理功能 。复等位微效基因间并没有显隐性关系，但它们集合在一起时却能相互作用显示出超出显性基因的效果。假定一对纯合等位基因 支配一种代谢功能，生长量 1 个单位，另一对纯合等位基因 配另一种代谢功能，生长量为 2 个单位。那么，杂种的等位基因 能同时支配 种代谢功能，于是可使杂种的生长量超过最优亲本而达 3 个单位以上。这说明异质等位基因优于同质等位基因的作用，即杂合态优于纯合态，所以称为超显 性假 说。一对异质等位基因表现超亲优势的试验是超显性假说的有力证据。某些植物的花色遗传是由一对等位基因决定 的，但它们的杂种植株的花色往往比任何一株纯合亲本的花色都深。例如，粉红色 白色，获得的 现为红色；淡红色 蓝色，获得的 现紫色。这些试验结果说明，异质等位基因的存在常可导致来源于双亲新陈代谢功能的互补，或生理生化反应能力的加强等。越来越多的试验支持超显性假说。例如支持玉米色素的基因，杂和体比显性纯合体更浓 (et 1994)。在小麦纯系叶绿体突变中，至少有两个例子是，杂和体的叶绿体比纯合体大，而且数目多。这可能是因为在杂和体中一个座位的不同等位基因有不同的作用，比纯合体中的单独 作用对生活力或生产性能有利得多。但这一假说也存在某些片面性，它完全排除了事实上存在的、决定性状的等位基因之间的差别，不承认显中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 性效应在杂种优势中的作用，而且在自花授粉植物中，一些杂种并不一定比其亲本表现优势，也就是异质结合不一定就有优势，这种现象与超显性假说是背离的。 种假说的不足 显性假说和超显性假说都有大量的实验依据，都在一定程度上解释了杂种优势产生的原理。显性假说部分地解释了各类作物杂种优势的强弱，在一定程度上受有利显性基因的互补效应，即显性基因的加性效应所决定。超显性假说也在一定程度 上解释了各类作物杂种优势的强弱。两种假说的共同点是 ， 都承认杂种优势的产生是来源于杂种等位基因和非等位基因间的互作 ， 都认为互作效应的大小和方向是不相同的，从而表现出正向或负向的中亲优势或超亲优势 ， 但认为基因互作的方式是不同的。 显性假说认为杂合的等位基因间是显隐性关系，非等位基因间也是显性基因的互补或累加关系，就一对杂合等位基因讲，只能表现出完全显性和部分显性效应，而不能出现超亲优势，超亲优势只能由双亲显性基因的累加效应而产生。超显性假说则认为杂合性本身就是产生杂种优势的原因，一对杂合性的等位基因，不是显隐性 关系，而是各自产生效应并互作，因此，也可能产生超亲优势。如果再考虑到非等位基因间的互作，即上位性效应 (et 1994) ， 则 出现超亲优势的可能性就更大了。由此可见，两种假说是互相补充的，而不是对立的。 但是，这 两种假说都忽视了细胞质基因和核质互作对杂种优势的作用，这显然是两种假说的不足之处。 种优势的分子生物学研究 随着现代分子生物 学 技术的发展， 科学家 开始采用 异显示技术和 基化分析动植物杂种优势 产生的机理 ，并取得了一定进展。 因表达调控与杂种优势的 相关研究 数量性状受多基因控制， 其中， 可能会存在一个或者几个主效基因，它们控制基因的表达速度 或 表达 强度 ，从而使性状的表型值发生改变 。 如果这类基因在纯种和杂种间发生了表达差异， 它们会单独或共同影响到杂种优势的产生。杂种的遗传物质来自两个不同纯种，但其表达并不是这两个纯种遗传物质的简单相加，两套不同的遗传物质及胞质相互作用形成了一个新的遗传背景，杂合子的生长发育实际上就是在这一新的遗传背景下进行的 。 因此，杂种优势现象实际上是杂合子内基因表达调控的外在表现形式。大量研究结果表明，杂种和纯种间存在大量差异表达的基因，而性状的表型值是基因表达的结果 。 很多学者从基因表达的角度研究了杂种优势产生的分子遗传机理。 （ 1987）对玉米亲本和杂交种进行蛋白质数量多态性分析结果表明，蛋白质在表达种类上的差异（反映了结构基因表达的差异）与杂种优势不相关，而蛋白质在表达数中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 量上的差异与杂种优势显著相关，并推测杂种优势上的差异主要与基因表达的调控过程有关。（ 1990）首先明确提出并研究了基因表达与玉米杂种优势的关系，认为杂种优势产生与杂交种中许多基因的差异表达有关，因为有 33% 的差异表达产物在杂交 种中更丰富或特异表达。后来， （ 1995）也发现玉米杂种与亲本相比，杂种中 含量和种类均发生了变化。 （ 1999）对种间和品种间不同优势小麦杂交种和亲本进行了 异显示，结果表明，小麦杂交种与亲本之间基因表达发生了显著改变，但差异表达的程度与发育时期和器官有关。 （ 1999）利用 异显示方法分析了杂种和亲本幼苗叶片基因表达差异。结果表明，杂种与双亲间基因表达存在数量和质量水平的差异，但以量的差异为主。 （ 1999） 利用差异显示技术发现了 亲本和杂种在表达上有差异，杂种相对于亲本的基因差异表达以抑制为主，并 且这些差异表达 对杂种优势有利。孟凡荣等（ 2002）也采用 异显示技术分析了 蛋白激酶两个基因家族在不同优势组合的杂交和自交种子发育前期的基因表达差异，发现所有 6 个时期杂交和自交种子之间存在明显的基因表达差异，强优势组合差异表达比例较弱优势组合高。谢晓东等（ 2003）也研究了小麦杂交当代种子与亲本自交种子基因的表达差异，表明杂种优势是由某些表达差异的基因造成。此外，王泽立等（ 2004）研究了 6 个基因在玉米叶片组织中的表 达情况， 发现 有些基因通过增强或减弱表达在杂种优势现象中起一定作用。可见，杂种性状的表现与某些基因的差异表达是显著相关的。 表观遗传学是与遗传学相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变 所致基因表达水平变化，如 基化和染色质构象变化等。 此类遗传改变主要指染色体结构的改变和 基化状态的改变。 基化就是在 制后，甲基转移酶 （ 甲基化酶 ） 催化将 甲硫氨酸（ S 上的甲基基团连接到 子的腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行 饰的过程 (是活体细胞中最常见的一种 价修饰现象（ et 1985）。甲基化改变主要有 基化丢失， 基转移酶升高，以及区域性 基化增加，尤其在 的甲基化。原核生物，如细菌通过在自身 限制修饰系统内切核酸酶识别位点中特定碱基的甲基化来保护自身 受内切核酸酶的降解。在真核生物细胞中， 生修饰的碱 图 1 1：胞嘧啶甲基化去甲基化以及转变成 5甲基胞嘧啶的生化过程（ et 1999 ） of 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 中一般只有 55并可能是仅有的程序化 修饰。 5常在真菌和无脊椎动物中含量较少，在脊椎动物中有一定的含量（ 10%的胞嘧啶残基会发生甲基化），而在高等植物中，约有 30%左右的胞嘧啶残基发生甲基化，而约有 90%的甲基化位于 核苷酸和 核苷酸对中 (et 1981)，常常是二重对称性的，但也有非对称序列甲基化的报道 (et 1996)。 基化是生物体的一种表观遗传现象。甲基化并不改变 碱基排列顺序，但是阻断了遗传信息的传递，从而引起 形态性状的变化（ et 1987）。 去甲基化可以引起表型性状的巨大变异（ et 1996）。 图 1 2：甲基转移酶的修饰过程 of 甲基化方式有两种 (et 1985)，如图 1一种是维持甲基化 ，即 在新复制的 ， 基化酶识别半甲基化的核苷酸对，催化将甲基从 移到未甲基化的 C 碱基的嘧啶环上，使其完全甲基化，这称为维持甲基化 （ ，如拟南 芥中的 族和 族 ； 另一种是新（ de 甲基化 ，即 甲基化酶催化母链未甲基化的 C 位点在子链进行甲基化， 如 动物中的 南芥中的 图 1 3：胞嘧啶甲基化抑制转录可能的机制 of by 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 基化修饰 可以导致基因特异表达、 细胞分化 、和染色体失活等（ et 1997）。 如 基化与基因的转录失活，尤其是转基因的失活 和 转座子的转移失活等 现象有密切关系， 也 与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。 大量研究表明，在生物体的发育分化过程中， 基化能关闭某些基因的活性 (去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。许多研究工作证实，基因表达活性同 就是说 因的表达活性越高，反之 因的表达活性越低。 直到 1975年 ， 基化在发育中发挥重要基因调节功能才被 认识到 （ 同时也可能在杂合体形成过程中发挥重要作用 （ et 2000； et 2000；et 2004）。这些发现 促使人们从 平去探索杂种优势的遗传机理。在番茄（ et 1991）、玉米（ et 1995）、水稻（ et 1990）等植物中，不同组织间的甲基化水平存在明显差异，说明甲基化在细胞分化和器官发育过程中可能起着重要作用。陆光远 (2005)等利用 现 子萌发过程中同时发生甲基化和去甲基化，其中去甲基化占主导地位，不同器官的甲基化水平存在一定差异。 究结果表明，基因组 度 显著相关 （ et 1981） 。其对 基化与基因的抑制表达进行了分析，认为自交能导致甲基化逐渐积累，而杂交能使甲基化得以解除或重排 （ et 1991） 。 5总胞嘧啶（ 5G）的比例进行了分析，发现两个亲本胞嘧啶甲基化比例分别为 ，而杂种为 ，基因组 表达活性与 基化存在显著负相关（ r= - （ et 1998） 。由此认为 : 杂交种 能与杂种优势表达有关。以后又对玉米自交系、改良系和杂交种的基因组 织和发育时期特异性，且与环境显著互作；杂交种 良系 密植条件下自交系 （ et 1996） 。 果表明 ， 两个亲本具有相同的甲基化 程度 （均为 ，而在杂交种中甲基化比例为 18%，结论与 et 1999） 。 果显示，幼苗中的甲基化水平更高，而且证明 et 1998） 。 多倍体拟南芥进行研究，发现异 源 多倍体具有表现型 上的不稳定性，胚胎的高致死率 和 高频 率 的基因沉默等 （ et 2000） 。他们推测 这些表型 可能与 杂种 异 源 多倍体基因组的甲基化模式 有关 ，但是 亲代 的甲基化水平 与异 源 多倍体 的 甲基化水平 相比 没有明显变化。他们认为，总体甲基化水平没有明显变化并不意味着异 源 多倍体中甲基化的 具体 位点没有发生变化。用去甲基化试剂 对亲代与异 源 多倍体进行处理，结果显示，与亲本相比，异 源 多倍体更容易产生 et 2003） 。 仪治本等（ 2005）利用 现 杂种的甲基化模式相对于其双亲发生了较大的改变。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 菜 杂种优势的研究目的和意义 油菜是重要的油料作物，是 食用 植物油和植物蛋白的最主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白源。我国 是 世界上最大的油菜生产国， 2000年以来种植面积已经突破 积和总产均占世界的三分之一。但目前杂种优势的利用超前 于 对其理论的研究水平。尽管关于杂种优势的遗传基础已经争论了近百年，但是至今尚无定论 。 杂种优势的分子机理研究 将 对进一步提高杂种优势在农业生产上的应用 具有 重要意义。 虽然 975年就提出 基化 在 杂合体形成过程中发挥重要作用，但由于研究手段 的限制而 不能找到二者之间的直接证据， 故而 始终没有 取得 突破性进展。 目前， 有关 域 ，且集中于某些特定基因，植物上的研究报道很少，而且不同人的研究往往得出不同的结论。 油菜 检测油菜在重铬酸钾毒害下 et 2004），研究植物逆转录转座子 et 1999），但关于油菜杂种优势与 本研究的目的是通过对油菜杂种优势与其基因组 解杂种是否在过 现杂种油菜基因组 而 探索杂种优势形成的分子机理， 为 深入开展杂种优势的利用，及与杂种优势 形成相关 的影响重要农艺形状的基因的克隆 提供理论基础 。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 杂种油菜 2性状表现 8 第二章 杂种油菜 性状表现 料 油菜种子 本 )， 本 )， 2杂种 ), 由华中农业大学涂金星老师提供。 法 油菜种子的播种 种子春化：取一定数量得种子，避光