【毕业学位论文】（Word原稿）转基因水稻基因漂流的研究生物化学与分子生物学硕士论文

i 密级（内部 5 年） 论文编号 中国农业科学院 学位论文 转基因水稻基因漂流的研究 on on i 目 录 摘 要 . I 第一章 绪论 . 1 一 转基因作物发展现状 . 1 （一）全球转基因作物 (业化应用情况 . 1 （二）我国转基因作物商业化应用情况 . 2 二 . 2 （一）基因漂流的概念 . 3 （二）基因漂流的途径 . 3 （三）影响基因漂流的因素 . 5 1. 花粉供体的面积 . 5 2. 传粉载体 . 6 3. 环境因素 . 6 4. 天气状况 . 6 5. 物理隔离 . 7 6. 花粉供体自身生物学特点 . 7 7. 作物远缘杂交水平 . 7 （四）基因漂流的影响 . 8 （五）转基因作物隔离距离的研究 . 9 （六）水稻的基因漂流 . 10 1. 水稻与野生稻之间的基因漂流 . 10 2. 水稻与杂草之间的基因漂流 . 12 3. 转基因水稻与栽培稻之间的基因漂流 . 12 三 本研究的主要内容 . 13 第二章 试验研究 . 14 一 材料与方法 . 14 （一）材料 . 14 2002、 2003） . 14 2003） . 14 亚， 2003） . 15 亚， 2003） . 15 亚， 2003） . 15 亚 2003） . 15 州， 2002） . 15 （二）方法 . 16 设计 . 16 . 21 . 水稻开花期风向风速的记录 . 22 算 . 22 籽粒数的计算 . 22 籽粒数的计算 . 22 体水稻的收获 . 22 . 22 . 23 . 23 . 23 二 结果与分析 . 23 （一） . 23 （二） . 24 （三）基因漂流试验结果 . 24 2002、 2003） . 24 2.2003） . 37 亚， 2003） . 49 亚， 2003） . 62 亚， 2003） . 67 6. 花粉供体面积影响基因漂流试验（三亚， 2003） . 70 因漂流试验（广州， 2002、 2003） . 74 . 76 第三章 讨论 . 78 （一）不同栽培稻受体的基因漂流频率 . 78 （二）不同方向上的基因漂流频率及漂流距离、拐点的比较 . 79 （三）大田 生产条件下影响水稻基因漂流的因素 . 79 （四）基因漂流最大距离 . 80 （五）转基因水稻向普通野生稻的基因漂流 . 81 （六）转基因水稻向稗草的基因漂流 . 81 （七）转基因水稻的环境风险分析 . 81 （八）水稻基因漂流研究中的花期调节 . 82 （九）三种基因漂流频率估算方法的比较 . 82 结论与创新点 . 85 附表 . 86 参考文献 . 108 致 谢 . 112 作者简介 . 113 i 摘 要 转基因作物通过基因漂流对相关物种及生物多样性可能造成的影响是生物安全研究的重要内容之一。鉴于我国是水稻，特别是杂交稻生产大国，又是水稻的起源中心之一，抗虫、抗病、品质改良等转基因水稻在技术上已经成熟，其产业化正蓄势待发，而转基因水稻的基因漂流国际上又缺乏系统详实的研究，因此本研究以转 因粳稻 除草剂 花粉供体，模拟大田生产实际，研究了向栽培稻、野生稻和稗草的基因漂流。 迄今有关水稻的基因漂流仅有少数几篇报道，且存在以下问题，（ 1）花粉供体和受 体的面积小，难以预测转基因水稻大规模商品化后的基因漂流频率、最大漂流距离及对环境的潜在影响。（ 2）花粉供体与受体之间往往不种植水稻，未提供花粉竞争。（ 3）受体材料仅一至数个，难以反映向不同受体类型的基因漂流。（ 4）对不育系和杂交稻品种的基因漂流尚未作过研究。 与以往试验相比，本试验有以下特点：（ 1）花粉供体、受体面积大。广州试验点的供体面积为 1 亩，整个试验占地 亚试验点的供体面积为 ，整个试验占地 2）不同距离受体之间种植了非转基因常规稻，既提供了花粉竞争又防止了稻田空气湍 流对基因漂流的影响。（ 3）所用的受体种类多，包括栽培稻、普通野生稻、稗草，栽培稻中有籼型三系不育系、粳型三系不育系、籼型两系不育系、籼型杂交稻、籼型常规稻以及粳型常规稻等。 一、 向栽培稻的基因漂流 试验所用的受体包括 3 大类 9 个品种，结果如下： 1. 不同受体材料的基因漂流频率有明显差异； 2. 基因漂流的最大距离随受体、风向、风速而异； 3. 基因漂流频率急剧下降的拐点决定于风向、风速； 4. 花期相遇程度是控制基因漂流的有效手段。 二、 向野生稻基因漂流 1. 在相间 种植时，在广州 2002、 2003 年的最高风速为 2.4 m/ 3.0 m/情况下，向O. 基因漂流频率分别为 和 高于 O. 2002）。 2. 在最高风速为 3.0 m/条件下，向 O. 基因漂流可达 50 米。 三 . 向稗草的基因漂流 稗草属于稗属（ 未见其与栽培稻天然异交及人工杂交成功的报道。试验从杭州中国水稻所已种植转基因水稻 5 年转基因水稻安全圃中采集了稗 草种子 229 g，育苗后得到50794 苗，三次喷施 ，未发现抗性苗，说明不存在水稻向稗草的基因漂流和渐渗。 本试验的创新点是：（ 1）首次在模拟大田生产的条件下，提出了 9 个水稻受体在不同距离上基因漂流频率的具体数据，其中不育系 常规稻，相差 2 4 个数量级。（ 2）向不育系的最大漂流距离可达 300 m 在以往文献中均未见报道。（ 3）基因漂流最大距离、拐点，随风向、风速、和不同材料的异交能力而异，在最大风速较小时，基因漂流频率急剧下降的拐点为 1 3 米，最大风速较高时，基因漂流频率与距离呈负线性指数关 系。（ 4）花期隔离是减少基因漂流的有效手段，花期相遇 6 7 天比相遇 1719 天可降低基因漂流频率 7080%。（ 5）试验检测到的向野生稻的最大漂流距离为 50 米，可作为普通野生稻原位保护中安全隔离距离的参考。（ 6）转基因水稻对稗草没有基因漂流的风险。 关键词：转基因水稻、基因漂流、生物安全 of to by is of is of of of of of So we to of of e. g , (1). (2). of is to of (3). of is to of of (4). No on ms of (1). of is 40 m2 800 m2 in a (2). We in (3). We ms ms 1. to in (1). of is (2). of of (3) by (4). is to 2. 1). In of 2002 ; 2003) is 2002) .4 m/002) .0 m/003) of (2). of 0 .0 m/of 3. no or we 29 No 00 0794 So we no or in (1). We of at of ms 3 (2). To of 00 is of no (3) of is by (4) is to (5)of to 0 (6) No 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 一 转基因作物发展现状 （一）全球转基因作物 (业化应用情况 1983 年第一例转基因植物 1994 年已经有延熟保鲜的转基因番茄批准进入商品化生产，此后转基因作物（ 种植面积迅速扩大， 1996 年到 2003年的 8 年间，转基因作物的全球种植面积由 170 万公顷增加到 6770 万公顷，增加了 40 倍。其中种植面积最广的是抗除草剂作物，约占总面积的一半，其次是抗 虫作物，约占总面积的五分之一。 尽管自 1999 年国际上引发了对转基因作物安全性的争论， 2000 年 2003 年转基因作物的全球种植面积仍以两位数的速度增加（表 2003 年的种植面积比 2002 年增长了 15%，净增 900 万公顷。其中发展中国家的种植面积有所提高，约占总面积的三分之一（ 30%），发展势头持续走强。从 1996 年到 2003 年，全球 21 个国家共种植了 3000 万公顷的转基因作物，面积几乎相当于中国或美国国土面积的三分之一。值得注意的是不仅转基因作物的种植面积增加，种植的国家也在增加， 1996 年为 6 个 ， 1998 年为 9 个， 2001 年和 2002 年分别为 13 和 16 个， 2003 年增加到了 18 个。 表 球转基因作物种植面积（ 1996 M 1996 003） 年份 面积（百万公顷） 比上年增幅（ %） 1996 1997 47 1998 53 1999 4 2000 1 2001 9 2002 2 2003 5 巴西和菲律宾是 2003第一次批准种植转基因作物的国家，巴西种植了大约 300万公顷的转基因抗除草剂大豆，菲律宾种植了大约 2万公顷的转基因抗虫玉米。与 2002年不同的是，转基因作物的主要种植国从 2002年的 4个增加到 6个，分别是美国、阿根廷、加拿大、巴西、中国和南非。 其中，美国种植了 4280 万公顷（占总面积的 63%），其次为阿根廷 1390万公顷（ 21%），加拿大 440 万公顷（ 6%），巴西 300 万公顷（ 4%），中国 280 万公顷（ 4%）和南非 40 万公顷（ 1%）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 转 基因作物的种类主要是大豆、玉米、棉花和油菜，占总面积的 99%以上。其中转基因大豆面积最大，约 4140万公顷。 2003 年，转基因大豆占全球大豆种植面积 7600 万公顷的55%，转基因棉花、欧洲油菜、玉米占全球各作物总面积的 21%、 16%和 11%（表 。 2003 年四种主要作物的全球种植总面积为 27200 万公顷，其中转基因作物占 25%。 表 2003年全球 4种主要的转基因作物面积与总面积的比例 of M to 2003) 主要作物 转基因面积（百万公顷） 总面积（百万公顷） 所占比例（ %） 大豆 6 55 玉米 40 11 棉花 4 21 油菜 2 16 转基因作物的广泛种植，取得了巨大的经济、环境和社会效益。 2003 年转基因作物的全球市场价值约为 45 亿到 美元，比 2002 年的 40 亿美元有所提高，预计 2005 年转基因作物的全球市场价值将超过 50 亿美元。 （二）我国转基因作物商业化应用情况 我国 是第一个 商品化种植抗花叶病毒（ 瓜和抗烟草花叶病毒（ 价转基因烟草的国家。到目前为止转基因植物种类已经超过 47 种，涉及的基因超过 100 种（ 2002）， 2001 年已获准环境释放的转基因植物有水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、番茄、马铃薯以及杨树等（ 2002.），其中进入商品化生产的有耐贮藏番茄、改变花颜色的矮牵牛花，抗黄瓜花叶病毒的甜椒和番茄各 1 例、抗虫棉 50 例，但目前生产上应用较大的只有棉花。 经过近十年的努力，抗虫棉在我国的种植面积已占相当的比例。 2003 年在我国的种植面积 达到 280 万公顷，占当年棉花种植面积（ 480 万公顷）的 58%，连续 5 年保持增长，产生了巨大的社会和经济效益。另外转基因抗病棉和纤维品质改良的棉花研究也取得了相应的进展。我国在转基因水稻的研究上也取得了重大进展，转基因抗除草剂水稻（ 、转基因抗虫水稻（ 转基因抗病水稻（ 产业化开发已经蓄势待发，其它转基因水稻如改善水稻品质、增强抗逆性等也取得了进展。转基因抗蚜虫大豆以及转 食心虫大豆也已获准进入环境释放阶段。抗病、抗虫的转基因马铃薯已经进入了环境释放阶段。转基因抗虫玉米和高赖氨酸玉米也进入了小规模田间试验。 二 随着现代生物技术产业的蓬勃发展以及转基因植物的大面积种植，在产生巨大的经济效益和社会效益的同时，与转基因植物相关的安全性问题也日渐成为社会关注的焦点（ 998； 001； 001）。 2001年的“墨西哥玉米事件”（ 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 2001），则将人们的视线和有关生物安全性争论的焦点转向 们开始关注 花粉漂移转移到相关的近缘野生种（ 其它作物（ 去以后可能引起的环境风险。 （一）基因漂流的概念 “基因漂流”来自于英文“ 主要指生物的个体和群体之间由于杂交而导致的基因之间的交流。 基因漂流又分为垂直基因漂流（ 水平基因漂流（ 垂直基因漂流是指转基因植物的外源基因通过植物的传统的遗传方式向其后代或近源种中转移。水平基因 漂流指植物和其它生物物种（如微生物）之间的基因漂流，这主要通过非杂交的其它方式得以发生，其发生概率很低，所以目前基因漂流主要指垂直基因漂流（ . 2002）。 在生物安全的文献中基因漂流指外源基因在转基因作物和与其有亲源关系的物种间的流动，它包括目的基因在转基因植物同一品种、不同品种以及在该作物和其野生近源种（包括其杂草类型）之间的移动（卢宝荣， 2003）。转基因基因在作物的不同品种之间或作物和野生近源种之间的漂流会带来生物安全的问题，在同一品种之间漂流则不会引起生物安全的问题。 （二） 基因漂流 的途径 植物中基因漂流主要通过两种途径得以实现，一是通过种子或无性繁殖体散落在环境中形成自生苗，开花后与野生近源种或其它品种杂交，形成携带优势性状并可自我繁育的个体来实现，如在远距离的运输过程中发生种子的散落，基因通过这种方式发生的逃逸的距离可能会很远，；第二种途径是通过携带转基因的花粉的传播，花粉一旦在环境中遇到可以发生有性亲和的受体，包括其它品种或野生近源种，产生杂种，从而完成转基因向环境中漂流的过程。通过花粉的漂流而实现的基因漂流距离比较远，但有时也可达数公里（ 993）。 大多数驯化 作物在自然条件下可与其野生近缘种杂交（ 998;； 999），驯化作物的基因经常可以在自然种群中出现（ 961；963； 970； &994； 1997； 995）。英国的一项报告指出，大约 1/3的驯化作物可与一至多种地方群体杂交 （ 993） ，新西兰的报告指出这一比例为 1/4。目前至少有 44种作物可以与其野生近缘种杂交（表 理论上讲，只要有大量的转基因作物，并且附近有可有性亲和的野生近源种或杂草，转基因植物的外源基因就会通过花粉传递给这些近源野生种产生杂种。在杂种当代的基因组中，有一半遗传物质来自于转基因作物，另一半来自于近源野生种或杂草，如果杂种具有育性就有可能通过连续的回交形成稳定的后代。 表 与 1种或 1种以上野生近缘种发生天然杂交的驯化作物 or 003） 中文俗名 英文俗名 学名 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 紫花苜蓿 苹果 鳄梨 香蕉 菜豆 甜菜 匍茎剪股颖 可可树 甘蔗 木薯 茄子 阿拉伯咖啡 海岛棉 陆地棉 榆树 高羊茅 西葫芦 葡萄 圆柏 莴苣 玉米 谷子 珍珠谷 双孢蘑菇 燕麦 马铃薯 马铃薯 昆诺亚藜 萝卜 甘蓝型油菜 白菜型油菜 悬钩子，覆盆子 杜鹃花 水稻，非洲栽培稻 水稻，亚洲栽培稻 黑麦，裸麦 黑麦草 婆罗门参 高梁 大豆 南瓜 草莓 向日葵 x ea x 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 核桃 西瓜 小麦，面 包小麦 小麦，硬粒小麦 三）影响基因漂流的因素 影响基因漂流的因素包括生物学因素和物理因素。生物学因素包括不同物种的地理分布是否重叠、生殖交配的方式和可交配性、产生杂种的生物学特性、花粉是否相遇、每天的开花节律是否重叠，花粉和柱头的生活力等；物理因素包括植物生存环境的地形地貌、气候条件、风向风速、是否有隔离障碍等。（表 表 响植物基因漂流的主要因素 in 2003） 1. 在花粉传播范围内是否存在与花粉供体作物杂交亲和的其它栽培品种、地方品种、野生种及相关杂草； 2. 上述花粉受体植物的开花物候学；花期是否与花粉供体作物相遇； 3. 花粉活力、传粉机制及由此决定的有效花粉传播距离； 4. 授粉模式：自花授粉或异花授粉； 5. 相关野生种及杂草种的授粉模式： a) 风媒传粉或虫媒传粉； b) 风媒传粉：风向与风速及由此决定的花粉传播距离； c) 虫媒传粉：花粉供体与花粉受体植物是否是同种传粉的昆虫；传粉昆虫的移动距离等； 6. 花粉特性，温度、湿度等环境因素及相应条件下 的花粉活力； 7. 花粉在受体柱头上的沉积数量、花粉管的萌发生长情况及花粉管长度；花粉管能否到达胚囊并与卵子完成受精过程； 8. 花粉供体与受体植物染色体的数目与大小；受精卵能否结实、杂种种子的活力及育性；不能进行有性繁殖的不育杂种能否进行无性繁殖。 9. 不育后代的多倍体化及重复回交可否自然选择出可育杂种。 1. 花粉供体的面积 作物间或作物和野生种之间的基因漂流与花粉供体的面积有关（ 1993），是影响基因漂流水平的重要因素，当然这与花粉供体的植株密度、花的密度、花粉量的多少、 植株分布有关。评估大面积转基因作物的基因漂流只做小面积的试验是远远不够的（ 用模型估算不同空间设计的玉米花粉传播模式，结果表明从一块玉米地向另一块玉米地传粉的频率取决于两块玉米地的大小。 （ 1999）对花中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 粉源大小对异交水平的影响进行了理论研究，结论是当花粉供体面积为 400 ，其扩散的有效花粉量是面积为 4 40,000 3/4。在转基因的油菜的研究中（ 995），当转基因油菜释放面积为 7547 米处的花粉漂流频率 为 面积为 400 00 米处的花粉漂流频率为 400 米处为 当转基因油菜释放面积达到 10360 米处花粉的密度只降到释放地花粉密度的 10%，在 15仍计数到 22 粒花粉 /要了解转基因作物向其它作物或近缘种的串粉情况，则必须模拟大田生产情况进行科学试验。 2. 传粉载体 花粉既可通过风力及空气流动进行传播，也可通过昆虫、鸟类和蜂类进行传播，或兼而有之。如油菜等作物的花粉，可以通过风媒或虫媒传播到很远的距离。由于天气可以影响传粉昆虫的习 性及风速风向的变化，因此不同作物、不同日期的花粉传播情况不同，进而基因漂流情况也可能显著不同（ et 1992）。不同的传粉昆虫对基因漂流的影响是不同的，如大黄蜂（ 仅在不同的花朵之间移动，因此其传播的花粉仅沉积于花粉源周围，传粉甲虫（ 在大范围作物之间移动，因而可能将花粉传播到很远的距离（ 1994）。 在研究虫媒型花粉植物的杂交中，还要考虑不同植物对昆虫的吸引力，如花粉的数量、类型、花的颜色、昆虫的偏爱等因素 （ 000）。由于转基因抗虫作物的应用，也可以导致花粉传播昆虫的改变，而 传粉昆虫类型的改变会影响虫媒作物受粉，从而潜在的影响这些作物杂交的水平。传播花粉的昆虫在不同的季节、不同的区域有明显的变化，另外由于人为引入昆虫也可以使得传播花粉的昆虫有较大变化，这些都是潜在的影响基因漂流的因素。 在传统育种中， 大多数风媒花粉传播的物种间隔距离为 200 米左右， 虫媒花粉传播平均间隔距离为 600 米左右。 3. 环境因素 环境条件如植物冠层、周围植被及地形、障碍物（ 000）等也会对花粉的漂移产生影响，例 如花粉可被水滴所吸收，或被吸附到植被、建筑、泥土或水体的表面，或可能撞到比较干的表面而反弹，从而继续漂移（ 000）。风速与空气流动受地形的影响，并可能进而影响花粉从花粉供体到受体植物的移动。环境对基因漂流的重要程度及潜在影响随花粉粒的移动速度、植被及地形等因素而变化（ 2000），这就强调了加强小环境下的研究。 4. 天气状况 花粉传播受温度、湿度、光照及风、雨等气候因素的影响。 1970）连续数年对花粉的传播模式进行了研究，发现某一年份某一日期油菜 主要原因是，头年当日的天气为大雨、高湿度，而次年当日的天气为晴朗低湿度。在加中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 利福尼亚对马铃薯不同品种的杂交水平的研究能够相差 10 倍（ 995） 。另一项对同一地点不同年份同一天油菜花粉密度的研究发现两者相差 70 倍，分析这可能与天气的变化有关（ 970）。 5. 物理隔离 树木和篱笆可以通过减少空气流动及对花粉的过滤作用，减少其两侧作物间的花粉流动。密集的灌木丛、草地和树木的叶子可以捕获各种随空气流动的粒子，包括花粉（ 2000； 1952），在相邻的玉米地之间种上树木，仅一排树木及树下草丛即可使树木两边玉米之间的异交率下降 50%，但对于较远距离的异交频率则影响甚微。 6. 花粉供体自身生物学特点 植物分为自花授粉、异花授粉、常异花授粉等（ 999），许多植物都有一定的机制来促进杂交的发生，例如有些植物的雌花和雄花的花期不一致、雌雄异株、同株异花等。评估植物基因漂流的可能性时，每种植物都要各案研究。同一种植物随生长季节的不同、生长的地理环境的不同其杂交的程度可 能有很大区别。植物本身的高度也会影响到花粉的扩散，一般来讲，较高的植物扩散花粉的能力较强（ 002），其原因也是显而易见的。另外花粉的数量、体积、形状、活力、维持花粉活力的的时间都综合影响花粉扩散的能力。 7. 作物远缘杂交水平 两个物种之间能否天然异交，决定于其有性亲和性（可交配性）及杂种的育性、繁殖和定居成为群落的能力，其中包括许多合子前和合子后的因子（表 所有这些因子均表现为累加效应，其中任何一步出现差错，都会影响基因间的渐渗。 995）认为研究传统育种作物和其野 生亲缘种之间的杂种的效应是研究转基因对杂种影响的基础。 表 物基因向相关物种渐渗的决定因子 of 003) 杂交的合子前障碍 1 亲本群体间的空间障碍 2 开花的同步性 3 交配方式（父母本） 4 特定的亲本基因型 5 花粉扩散方式及传播媒介 6 母本群体的花粉竞 争 7 环境条件 杂交的合子后障碍 中国