【毕业学位论文】（Word原稿）动物源性食品中兽药多残留通用型检测技术体系研究-项目验收文档

I 浙江省公益性技术应用研究（分析测试）项目验收文档 项目 合同 编号： 2011目名称： 动物源性食品中兽药多残留通用型检测技术体系研究 项目承担单位： 宁波检验检疫科学技术研究院 项目负责人： 二一三年三月 录 第一部分 工作报告 .二部分 技术 报告 .要 .一章 文献综述 .言 .类别多残留分析方法的必须性和可行性 .处理方法部分 . 提取方法 . 净化方法 .器分析方法部分 . 液相色谱部分 . 质谱技术部分 .结与展望 .考文献 .二章 超高效液相色谱 用测定生鲜牛奶中的兽药和其他污染物 .言 .验部分 .果与讨论 .章结论 .论与展望 .考文献 .录 1.录 2（缩写） .谢 .究期间发表的主要论文与发明专利 .施总结报告 部分 动物源性食品中兽药多残留通用型检测技术体系研究 一、项目基本情况 近些年来，小分子有机物污染物（包括兽药、农药、生物毒素、环境污染物、非法添加物等）引发的大规模食品安全事故在我国频发，如： 2002 年，虾仁氯霉素事件； 2006 年，苏丹红事件； 2008 年，婴幼儿奶粉的三聚氰胺事件；2010 年，滥用瘦肉精的 健美猪 事件； 2011 年，多家乳企的牛奶中黄曲霉毒素标事件； 2012 年，洋快餐的 速生鸡 滥用抗生素、抗病毒药物事件等。一系列食品安全事故引发了全社会的高度关注，这些小分子有机污染物不仅对消费者健康构成了威胁，而且这些恶性事件影响了消费信心以及我国动物源性食品在国际上的声誉。欧盟美、日本对不同食品中各种小分子有机污染物残留设定了严格的法规要求。我国蜂产品、畜禽产品、水产品等动物源性食品由于化学残留超标屡次被进口国退货、销毁、索赔甚至终止贸易往 来，蒙受了巨大的经济损失，并遭受信誉危机，影响了食品国内消费与出口创汇。 种类繁多、来源广泛的小分子有机污染物无论给企业自检还是政府监管带来了高度的复杂性和不确定性。食品检测实验室的样品和待检测的项次越来越多，加上周期要求，面临的分析任务越来越艰巨。我国现阶段，兽药和其他污染物检测标准（除农药残留分析外）的基本设计思路是将化学结构相似或功效接近的一类目标物进行单类别 S 检测为主，虽然充分考虑了化合物之间的差异，相对于通用型方法，降低前处理的难度，但这样需要制订出一大堆的检测标准方法。截止 2010 年，仅关于动物源性食品中有关兽药残留和生物毒素的现行国家检测标准就已超过 100 个，且尚有很多种类药物并未覆盖，未来需要分析的类别还在不断增加，众多独立的标准检测方法无疑给全面质量把关带来巨大的麻烦。 006 年 表第一篇同时筛选牛肉、猪肉和鸡肉中 130 种兽药的S 方法。快速、通用的多类别多残留分析方法（ 速成为研究开发的热门之一。 和 S 技 术，分别相继开发出牛奶中 150 和 101 种化合物的多类别检测方法， （ 2008）最早提出来通用型提取方法（ 念，采用 奶、蜂蜜、肉类等基质中172种农药、生物毒素、植物毒素和兽药。 采用两种不同极性溶剂乙腈和 冲液分别提取不同肌肉中 100 种兽药。经过 柱可以除去蛋白、碳水化合物等，但不能避免强极性化合物的损失。 也指出由于受极性差异的影响，当前多类别分析方法存 在部分待测物线性不理想，影响其检测低限和定量等问题。他们预测将待测物分成极性组、中等极性到弱极性组两组处理将更为合理 82。这种按极性分组设计思路既考虑了化合物间的差异，又最大程度结合了化合物间的共性，分为 2极性组别，进行前处理和仪器分析理论上能胜任全面分析的要求，可组成一个严密的检测体系。即使是新出现的药物，只要了解其大致的极性范围，进行增补也十分方便。因此极性分组是打破 检不了、检不快 的检测瓶颈的好途径。 通过这些研究者的前期尝试可见， S 或 S 技术大大扩充了检测 范围，但其选择性和灵敏度并没有无限制降低对样品前处理的要求，动物组织中不同理化性质的兽药和其他污染物的同时分析具有高度的复杂性，并没有取代单类别多残留方法成为检测主流方法。一方面，对于多类别方法，必须兼顾各类别的回收率，一般采用通用性强、选择性小的提取方法。食品基质一般比较复杂，势必会因此带来较多共萃取物，基质效应干扰检测结果；另一方面，净化往往带有一定的选择性，尤其是处理步骤过多时容易导致某些待测化合物的损失，且可能降低了样品的通量。因此，开展用于分析动物源组织中的小分子有机污染物通用型较强的多类别 S 方法研究，对于提高检测效率，减少漏检以及降低分析成本具有十分现实的意义。 二、 项目执行情况 V 研究内容包括如下内容： 1. 相参数优化（色谱柱和流动相的比较与选择）、 S 参数的优化（毛细管电压、电离方式与离子对的比较与选择）； 2. 标准品的配置、共存稳定性（避免使用酸或碱溶剂，溶剂选择与有效期）； 3. 极性 取方法、净化的优化， 4. 强极性组的提取和净化、 5. 方法学参数评价 ; 6. 当地市场实际样品的抽样调 查，完成初步摸底； 7. 方法的验证、专利的申请。 起始年月 进度 2011 20111. 完成了所有标准品配制； 2. 建立了 S 的 行 相参数优化； 20112011. 比较水、乙腈、乙酸乙酯、乙醇和正己烷提取配方猪肉中小分子污染物的效率。 2011 20111. 比较超低温冷冻法、固相萃取法、水沉淀脂肪、 2. 发明专利申请； 2012 20121. 提取方法的确定：比较了单一溶剂、混合溶剂的提取效果。 2. 净化方法的确定： 化方法的确定： 3. 专利申请。 2012 2012论 文投稿 ； 2. 投稿到色谱（中文核心）。 6. 比较五氟丙酸和七氟丁酸两种离子对试剂对氨基糖苷类的保留。 2012 20121. 从特异性、检测限、回收率、精密度等方面进行方法学评价； 2. 完成方法的验证； 3. 专利申请。 2012 2013. 对猪肉、牛肉、鱼肉、鸡肉等实际样品进行检测分析，并对实 际样品的数据进行统计分析； 2. 发明专利申请：一种动物源性食品中小分子有毒有害物质的通用快速检测方法。 3. 方法验证。 2013 2012. 对研究项目进行国外查新； 2. 形成技术报告和工作报告； 3. 申请鉴定验收。 三、 技术创新点和技术解决方案 改变我国现阶段兽药和其他污染物检测标准的基本制订套路（单类别 S 检测），紧扣 相似相容 原理，创新地采用极性分组前处理技术思路，既考虑了化合物间的差异，又最大程度结合了化合物间的共性，将极性分组前处理技术与 S 技术两者结合 起来，开展主要动物性中小分子有机污染物的快速、通用筛查和确证方法的研究。 （ 1）分析仪器方法部分：根据不同目标化合物的峰形和离子化效率，仅选择 3种流动相，其中强极性组采用七氟丁酸作为离子对试剂（浓度为 50 ）。定容液主要由二甲亚砜（ 水组成，由 3次进样；选择耐100%水的色谱柱，可以实现极性和非极性化合物的同时较好保留。 不影响同分异构体的分离。 2）前处理部分：创新地采用极性分组前处理技术思路，既考虑了化合物间的差异，又最大程度结合了化合物间的 共性，实现多类别极性和非极性待测物的提取和净化。强极性组（氨基糖苷类）前处理采用乙腈 +乙醇 +水溶液（ 1+1+2）和正己烷一步法进行提取和净化；极性 解后，采用双相法提取，超低温冷冻法、分散固相萃取法、降低净化要求手段等三重组合净化，达到了降低背景干扰的目的。 及其特点 1. 极性分组前处理，保障检测项目覆盖全面 ： 首先，将目标化合物按极性分为强极性组（ 12 种待测物）和极性 284 种待测物），分别进行前处理和仪器分析，理论上保障检测项目覆盖全面。优于药物类别和酸碱性等方 式分组。 2. 极性组（氨基糖苷类）的提取和净化： 前处理十分简便：采用 50%乙腈乙醇水溶液（ 1+1+2）和正己烷一步法提取和净化，氮气吹去有机溶剂，聚醚砜微孔膜过滤后进样；比较了离子对试剂七氟丁酸和五氟丙酸对氨基糖苷类 合物在反相色谱柱上保留效果，采用七氟丁酸待测物不仅保留时间更长，而且响应强度更大。 3. 极性 包括了酶水解步骤： 在温和条件（ 温37 ）下作用 16 h，避免漏检轭合代谢物；采用两相提取法，通用性强：由上下两层互补相溶的溶剂组成，上层为正己烷，下层为乙腈乙醇水溶液（含正己烷对弱极性待测物具有极高的提取效率；乙腈乙醇水溶液对极性和中等极性化合物的提取效果好；另外， 为保护剂，防止四环素类、大环内酯类被金属离子螯合引起回收率降低；下层液体中有机相和水相的比例，恰好为下一步 4. 极性 分散固相萃取（ 利用氨基填料（ 料 (300 50 溶剂环境即为 7.5 腈 +乙醇 +水（ 60+15+25，体积比），结合脂肪在水中溶解度极低的特点（极性差异大），简便快捷实现样品的净化， 此方法重复性良好、回收率好、通用性强。与固相萃取法相比，大大提高处理效率，成本低廉。 5. 极性 超低温冷冻法：温度的降低在不影响低含量的目标化合物回收率的同时，使得提取液中含量较高的脂肪、碳水化合物杂质的溶解度减少而部分析出，通过离心或冷冻过滤达到分离，通用性强。 6. 降低前处理要求：利用流路切换避免污染质谱 （前 2.0 换至废液，去除盐分、糖分，弥补了不采用固相萃取小柱净化的缺陷）； 7. 流动相和定容液的选择，获得最少的进样次数。 不仅极性待测物具有好的峰形，而且又不影响非极性待测物的在溶剂中的溶 解度。对于 296 种化合物，在 3种不同流动相的条件下，仅需 3次进样。 综上所述，本方法除了检测覆盖面更广外，在前处理的通用性、净化效果和处理速度等方面有了较大的突破。降低漏检风险，加上前处理简便快速，与以往多个方法的检测方法，检测效率得到了根本性的提升，缩短检测周期；同时，与采用固相萃取小柱、 但保证极性强和极性弱的待测物 四、科技成果转化、产业化经费投入情况，包括总经费和科研经费投入情况 项目投入资金 4万元，全部为单位自筹 。 完成情况 见下方 对照表 。 项目 项目合同书 实际完成情况 主要技术指标（限200字） （ 1）技术指标： a） 一个方法同时完成兽药 150项以上（包含磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、硝基咪唑类、苯并咪唑类、阿维菌素类、糖皮质激素类、性激素、 2状腺抑制剂类、镇定剂类、大环内酯类、 内酰胺类、喹恶啉类，每类药物至少包含一种）的同时检测，包括定性和定量； b） 检测限满足目前国内外相关法规要求，回收率、精密度满足分析要求； c） 前处理方法通用性强，适合复杂生物样品基质的检测。 d） 采用超高效液相色谱和三重四极杆串联质谱，方法快速、灵敏。 a）通用性强 ：分析目标物达到 296项，包括了水溶性极强的氨基糖苷类、其中兽药超过 200项：包括所有项目合同书所述类别。 无论是从类别的数量和目标物的数量，都大大超过预期的检测范围。 b）从本方法来看，线性良好。本方法的定量限在 0 g/间。对于 80 %以上的待测物定量限低于 2 g/大部分待测物的检测低限能满足欧盟的限量。在牛肉、鸡肉和鱼肉中平均回收率范围分别在 相应的重复性分别范围为 三个水平的平均添加回收率在 其相应的 内精密度）在 日间精密度在 对于 80 %以上的待测物 回 收 率 在 70之 间 ， 精 密 度 . 潮霉素 B 3128220000 . 氢链霉素 12821000 . 霉素 5721000 . 卡那霉素 806318000 . 糖霉素 2554617000 114 . 龙霉素 754223000 . 普霉素 3732121000 . 布霉素 3298620000 0. e 1a 庆大霉素 609819000 1 庆大霉素 587621000 2 庆大霉素 975120000 60 11. 索米星 3238519000 2. 替米星 5639121000 .3 d of 1, 1a （庆大霉素包括 表 2在正离子模式下采集的 144种化合物中英文名称、化学分类号、分子式、分子量 、标准混合工作溶液浓度、保留时间、定量离子对、定性离子对和离子比例 he of 44 in C in 合物 化学分类号 子式 子量准液(保留时间 定量离子对 定性离子对 离子比例 ) 甲状腺抑制剂类 13. 巯咪唑 604000 88 57 4. 基硫脲嘧啶 19565000 43 43 84 5. 硫氧嘧啶 517000 154 ) 硝基咪唑类 16. 基甲硝唑 4812600 126 7. 936500 140 8. 硝唑 443600 82 9. 硝唑 7681600 01 55 201 140 0. 美唑 551500 96 81 61 21. 硝唑 19387800 48 121 248 2. 基异丙硝唑 35175700 122 3. 丙硝唑 14885700 2) 24. 克多巴胺 97825180 5. 美特罗 73573190 149 6. 代克伦特罗 暂无 0 7. 酸苯氧丙酚胺 579180 284 8. 布特罗 56341130 9. 布特罗 81732180 0. 喷特罗 95656140 202 1. 氟拉明 458120 109 159 2. 苯乙醇胺 A 暂无 0 3. 安得 3506160 4. 海拉明 58170 152 5. 他索洛尔 63659180 7) 苯并咪唑类 36. 2934700 7. 基丙基磺酰苯并咪唑 809831000 8. 基噻苯咪唑 9481000 62 39. 菌灵 10605900 0. 苯咪唑 1481000 175 131 1. 5523291400 77 2. 820501400 95 3. 基甲苯咪唑 602541600 4. 苯达唑砜 751841200 159 5. 吩达唑 537161500 159 6. 苯咪唑 314311600 7. 苯咪唑 142551300 8. 苯哒唑 549651200 9. 苯达唑亚砜 540291200 95 0. 苯咪唑 314301600 ) 同化激素类 51. 酸地塞米松 11772400 ) 抗病毒药 52. 刚烷胺 7681000 52 52 3. 刚烷乙胺 133921200 81 ) 喹恶啉类 54. 乙醇 236961200 102 143 5. 巴多 1791337 00 63 56. 氧基喹啉 911400 148 2) 57. 羟吡啶 2971700 101 87 8. 癸氧喹酯 185072400 ) 59. 莫西林 2678716000 114 3) 林可酰胺、大环内酯类 60. 可霉素 1541800 1. 旋霉素 80254300 2. 米考星 1080504600 3. 利霉素 795481700 4. 林霉素 183231800 5. 桃霉素 39223500 6. 妙菌素 552972800 119 7. 乐菌素 14014600 8. 它霉素 13924100 9. 霉素 1143700 83 0. 沙霉素 168464200 1. 红霉素 802144100 116 2. 尼妙林 1013123100 64 ) 非甾类消炎药类 73. 罗昔康 363221500 78 121 4. 林酸 381942000 248 5. 美汀 261711500 91 6. 基布洛芬 220711600 77 7. 普生 222041