【毕业学位论文】（Word原稿）菊粉内切酶基因克隆、表达及菊寡糖中试设计微生物学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 菊粉内切酶基因克隆、表达及菊寡糖中试设计 891 F 891 要 菊粉是一种天然果聚糖，菊粉内切酶能够水解菊粉生成低聚果糖，低聚果糖是一种功能性食品添加剂，其保健作用体现在能够降低血糖水平，促进人体和动物肠道的微生态平衡和提高免疫力等等。 利用微生物菊粉内切酶可以一步法水解菊粉获得 高达 80%的 低聚果糖 ，但是只有少数微生物产菊粉内切酶，并且产酶量极低，从而造成分离纯化困难，制约低聚果糖工业的发展。本研究的主要目的就是构建菊粉内切酶的工程酵母来高效表达菊粉内切酶，为解决目前低聚果糖生产中的问题提供有效的解决途径。 本研究以黑曲霉 9891 的基因组 模板进行 增获得了编码菊粉内切酶的基因，并将它克隆进表达载体 过酶切、 测序验证后，将重组表达载体 酶切线性化后电转化到 组子通过营养缺陷型培养基进行筛选。重组菊粉内切酶在 实现了表达并在 7L 发酵罐中对其进行了优化表达研究，蛋白分泌量达 达产物的 析表明，蛋白质分子量大小约为 59粉内切酶的活性测定结果为 1501U/蔗糖为底物 ）和 291U/菊粉为底物），同原始供体菌株相比，分别高 105 倍和 273 倍，通过酶学特性研究显示该酶反应最适 适温度是 55 。 同时还对菊粉内切酶的高级结构进行了模拟，得到了该蛋白的高级结构的初步信息。根据 泳和酶的功能性分析，证明目的蛋白已在 成功实现表达。且重组转化子 891(传稳定性良好。 同时完成了中试生产线建设设计方案，包括菊粉 内切 酶水解生产 菊粉 寡糖 的工艺设计；设备选型； 低聚 果糖工艺生产设备平面布置 初步方案等酶法生产 菊粉 寡糖 的生化工程的下游工作 。 键词： 菊粉内切酶， 黑曲霉 ， 巴斯德毕赤酵母， 菊粉 寡 糖， 中试工艺设计 is a of of is as a of It an in as to to of of in to to so It be at 0% in by it of of to it is to to of is to of in to an to in of In is CR of NA 891 it is by is on of in a 7 of of mg/of is 9of 501 U/as 91 U/ml as 105 73 of of it 5 . At of is to is in 891(In of is of of by of of by of of of of 录 第一部分 引 言 1 1 菊粉化学 1 2 菊粉内切酶的研究进展 3 3 菊粉内切酶的应用 5 4 达系统 7 5 问题的提出与解决方案 10 6 本研究的目的和意义 12 第二部分 菊粉内切酶的基因克隆及其在 的表达 13 1 材料 13 2 方法 16 粉内切酶基因的克隆 16 组酵母的构建 20 组酵母的产酶发酵 21 组酶的酶学性质研究 23 解产物的 23 3 结果分析与讨论 24 粉内切酶基因的克隆 24 25 粉内切酶的序列分析和高级结构模拟 28 选与验证 34 35 组酶的酶学性质研究 40 43 第三部分 菊粉寡糖中试生产工艺设计与产业化的前期研究 44 1 菊粉寡糖中试生产工艺设计方法 44 44 罐中发酵过程的模拟 45 45 46 2 产业化的前期研究方法 48 业化的原料 48 业化仪器设备选型 48 聚果糖工艺生产设备平面布置 50 第四部分 结 论 52 参考文献 54 V 致 谢 60 作者简介 61 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 1 第一部分 引 言 菊粉内切酶（ 以水解菊粉生成低聚果糖 （ 写 ，利用微生物菊粉 内切酶一步法水解菊粉可以获得高纯度的低聚果糖。低聚果糖除了有糖醇的功能外，其还具有 增殖 双歧杆菌 、调节肠道功能，抑制内 毒素 、 保护肝脏，调节脂肪代谢，不引起血糖波动， 提高免疫力 、抗肿瘤 等功能，目前已被国际公认为 具有 保健 功能的 甜味剂 。 1 菊粉化学 粉的分布 果聚糖（ 一类由果糖苷和果糖连接组成的长链碳水化合物，其分子结构和分子量各不相同，广泛分布的在单子叶、双子叶和绿色藻类中，有三种不同形式 （ 990; 993） ， 它们分别为：菊粉（ 左旋果聚糖（ 革兰明糖 （ 。其中菊 粉 是由呋喃果糖以 旋果聚糖以 革兰明糖则是 -(2,1)和 -(2,6)键两种连接方式都有。菊粉又称菊糖，它是一类天然果聚糖， 1804 年德国科学家 次从旋复花属 （ 土木香（ 茎中提取得到 一种 果聚糖 ， 1818年 其命名为菊粉。 菊粉在自然界中的分布十分广泛，其主要来源是植物。在双子叶植物中的菊科、龙胆 科、橘梗科等科和单子叶植物的百合科、禾本科中的很多植物都含有菊粉（见表 1 表 1要含菊粉的植物及其菊粉含量 he 源 组织分布 菊粉含量（湿重） /% 菊芋 (.) 块茎 15苣 (.) 根茎 15丽花（ 块茎 15马夏（ 球茎 12公英 (花瓣 12蒜 (球茎 9笋 (嫩芽 10罗门参 (根茎 4鲜蓟 (叶子 3葱 (球茎 2蒡 (根茎 国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 2 某些真菌和细菌中也含有菊粉，例如在假单胞菌类（ 肠细菌类（ 链状球菌类（ 放线菌类（ 芽孢杆菌类（ 乳酸杆菌类（ 中就发现有菊粉的存在。 粉的结构特征 菊粉是由呋喃果糖以 还原性末端连接一个葡萄糖残基 （ 1951） ，为线性直链结构。其 聚合度 及 平均 分子量大小与不同 的植物来源 、 收获季节 、气候、土壤以及生产加工过程 有关。 标准 菊粉 的 聚合度为 2 60，其平均聚合度为 10 12， 长链菊粉的平均聚合度为 25。 菊粉 分子式可以用 示，其中 G 为 菊粉 还原性末端连接 的 一个葡萄糖 分子 ， F 代表果糖分子， n 则代表果糖单位数。 在 20 世纪 60 年代，人们开始了对菊粉物理化学结构的研究， 1965 年提出菊粉分子物理化学结构为 1977 年 为菊粉分子的最佳结构为11980 年 通过 5 个折叠螺旋环，每两个螺旋环相隔 中 4 个折叠螺旋环 为 右手螺 旋，剩余的一个折叠螺旋环为左手螺旋。 在 1988 年利用小角度激光扫描并结合排阻色谱和动态光束扫描等技术研究发现菊糖晶体为杆状体，最小结构单元 为 平均直径）；同年 过计算机 序模拟了菊糖 为菊糖分子结构理论上为右手螺旋结构，但多数研究者认为实际存在形式可以是左手 螺旋 也可以是右手螺旋。 1996年 通过 糖溶液和乙醇按 1:4 比例在 55 制备单晶体，然后借助 透射电子显微镜和 3D 电子衍射证明：在室温下菊糖晶体呈半 水合状态，空间构造为正菱形结构，并结合 6 个水分子， 其 单元参数分别为 a=b=c=(认为菊糖链为 6折叠螺旋环而不是 在 1980 年 人报道的 5 折叠螺旋环结构； 其 由 2 个反 向 平行的 6折叠螺旋环围绕晶体单元的 2 个折叠螺旋轴组成，结构特征为 =660， =1540， =子衍射数据表明菊粉最佳的分子模型为 R= R= R 为晶体残余因子），而菊粉分子在水合状态下， a=b=c= R= R=并且结合的水分子数为 12个。 粉的 物化 性质 粉的水溶性 菊粉易溶于热水，微溶于冷水 ，其溶解度随温度升高而增加 。在 10 时其溶解度为 6%，加热可以促进菊粉溶解，在 80 时可以完全溶解。菊粉有 -,们的水溶性差异是由分子内和分子间氢键引起的，譬如 D. I. et 1996） 。 另外 ，菊粉溶于水时，可以使水的冰点下降、沸点升高。 粉的粘度 菊粉溶液粘度会随其浓度增加而增大，随着温度的升高而降低。菊粉分子相互交联成网状结构，当菊粉溶液浓度达到 10%， 经过高剪切作用或 加热 冷却过程，菊粉逐渐形成微粒凝中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 3 胶网格结构，具有脂肪的滑润口感，成为有效的模拟脂肪。 粉的稳定性 菊粉具有较强的热稳定性，在 100 加热也不易分解，在 3 且高温条件下可以被水解；凝胶状态下的菊粉因为缺乏可以结合的自由水而非常稳定。 粉的保湿性 菊粉吸湿性强而具有较好的保 湿性，可以降低水份活度，这种特性可以应用到食品加工中延缓食品水份的蒸发，防止食品变味，以此延长食品货架期和保质期。 2 菊粉内切酶的研究进展 菊粉的合成代谢依赖于果糖转移酶，菊粉的分解代谢依赖于菊粉酶。菊粉酶（ 能够水解 是一种 诱导 酶 ， 学名为 于 菊粉酶 不仅能催化蔗糖水解 ， 而且能快速将菊粉水解成果糖。根据菊粉酶来源不同的可以将其分为微生物来源菊粉酶和植物来源菊粉酶 ； 根据微生物来源菊粉酶分泌方 式不同又可分为胞内酶、胞外酶和胞壁结合酶 ； 根据菊粉酶酶切果聚糖链的方式分为菊粉内切酶（ 菊粉外切酶 （ ，其中菊粉内切酶催化水解菊粉的产物为低聚果糖，而菊粉外切酶则是催化从菊粉末端切下果糖基形成 粉内切酶的微生物来源 现已有文献报道产菊粉内切酶的微生物包括真菌、酵母菌、放线菌和细菌。 表 1粉内切酶的微生物来源 he 株 文献 真菌 黑曲霉 . et 1978 黑曲霉 . et 1989 青霉 . et 1977 青霉 . et 1988 酵母菌 10 王艳等， 2001 放线菌 娄彻氏链霉菌 87 et 1989 细菌 黄假单孢菌 et 1999 假单孢菌 et 1997 节杆菌 . et 1987 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 4 粉内切酶酶学性质 来源于 et 1997）的菊粉内切酶，其只作用于菊粉而不作用于蔗糖 和 棉子糖；纯化酶 为 ， I/S 值无穷大；酶蛋白分子量为 68最适酶反应温度为 50 ，最适 源于 菊粉内切酶分子量为64为 酶 I/S 值为 50，纯化酶 I/S 值高达 4140；其水解菊粉的特点是随着 低， 大， 降；最适反应 且在 范围内相当稳定，在 55以下稳定性很好，高于 55 稳定性很差。 C， 1990）来源的菊粉内切酶的分子量为 m 值为 1，不水解蔗糖。 et 1978）纯化菊粉内切酶分子量为 54水解菊粉，对蔗糖无作用，最适温度为 45 ， 50 以上酶开始失活， 80 时完全失活，最适 为 来源于 . et 1987） 的菊粉内切酶其粗酶液经硫酸铵沉淀和显示两个峰，其中一个峰用 l 脱，水 解菊粉为低聚果糖和果糖，另一个峰用 脱水解菊粉只产低聚果糖， 为 l。酶反应最适 为 适温度为 50 ；在 围内或 30的温度范围内该酶较稳定，最大酶活可 达 80%以上。 表 1属离子和其它化合物对酶活性的影响 he of on 源 激活作用 抑制作 用 文献 、对高氯汞苯甲酸、溴代琥珀酰胺、碳二亚胺 et 1997 、 C， 1990 . et 1987 87 et 1989 10 +、 王艳等， 2001 粉内切酶的基因克隆 菊粉内切酶通常具有 5 个保守序列，它们分别是： ， ， ， ， 。 青霉 菊粉 内切酶有两种类型，其中一种类型是来源于菊粉内切酶，其 N 端序列为 另 一种类型是来源于 菊粉内切酶，它的 N 端序列为上述两个 来源于 青霉 的菊粉 内切酶 N 端序列中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 5 中，都存在 酶活性中心功能基团。 C， 1990）的菊粉内切酶的酶活性中心有 端序列为 其它微生物菊粉内切酶的 N 端序列相比没有序列相似性。 粉内切酶的基因结构 粉内切酶基因 1548码 5151信号肽， G+ et 1988） 。 粉内切酶基因 24391A 为信号肽，成熟酶蛋白 759其它微生物来源的菊粉酶多 135y. et 1996） 。黑曲霉内切菊粉酶有两种基因 度均为 1548码 516 1 23信号肽，不含内含子，二者间有 8 个 同，二者 G+C 别为 54%和 无花果曲霉菊粉内切酶基因 1551码 4921信号肽，与 切酶之间序列同源性高达 粉内切酶的基因表达 解菊粉形成低聚糖产量达 78%，但是胞内表达的原核表达系统普遍存在 着 分离纯化困难 （ im et 1997） 。 (1998)将黑曲霉菊粉内切酶基因 宿主菌、构造表达载体 表达初步研究表明， 蛋白表达量很低，几乎检测不到。 （ 1999）将 4因工程菌，只产内切酶，不产外切酶 ， 但表达水平很低。 3 菊粉内切酶的应用 聚果糖的功能 菊粉内切酶可以水解菊粉生成低聚果糖，它可以 作为 功能性食品和饲料添加剂。它是理想的蔗糖替代品，除了有糖醇的功能外，其还具有以下几个方面的功能。 殖 双歧杆菌 、 调节肠 道 功能 测定了 双歧杆菌 、产气荚膜梭状芽孢杆菌和大肠杆菌的特定生长速率，他们发现即使在纯培养条件下， 低聚果糖 也比葡萄糖更能促进 双歧杆菌 的增殖。 低聚果糖对双歧杆菌具有增殖作用 （ R, R, , et 1995） 的 机理是低聚果糖优先被双歧杆菌利用，产生醋酸盐和乳酸盐，降低了肠道内的 ，从而抑制了有害菌如沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等的生长。通过促进乳酸菌的生长来维持人体和动物体肠道的微生态平衡，调节肠道功能，预防结肠癌 。 低聚果糖在肠道内可以自身发酵成丁酸盐能刺激结肠黏膜细胞的生长，提高肠黏膜的吸收能力 （ .， 1994） 。 节脂肪 代谢 低聚果糖在肠道内可以自身发酵成短链脂肪酸（醋酸盐和丙酸盐），抑制胆固醇的合成，还可降 低热量及血液中胆固醇和 甘油 三酯的含量 （ L, , A, et 1998） ，中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 6 可用来预防心 血 管病和高胆固醇病。 进矿物 元素的 吸收 低聚果糖能大大提高 对 矿物质的吸收 （ , , , et 1994） 。其在消化道 内 能结合金属离子 ， 形成的复合物在发酵 过程 中被降解，释放出矿物元素 ，因而使金属离子得到有效的吸收。另外，由发酵所产生的酸 类 可以 降低结肠的 1许多矿物质的溶解度 生物有效性（如磷酸钙）大大的提高 （ , R, A, et 1992） 。 低血糖 低聚果糖是一种不会导致血液和尿液中葡萄糖升高的碳水化合物。它在肠道的上部不会被水解成单糖，因而不会升高血糖水平和胰岛素含量 （ R.， 1999） ，适于糖尿病患者食用。最近研究表明，空腹血糖的降低是低聚果糖在结肠发酵产生短链脂肪酸的结果。 制内毒素、保护肝脏 双歧杆菌 发酵低聚果糖，产生短链脂肪酸（主要是醋酸和丁酸），从而抑制外源致病菌和肠道内腐败细菌的生长繁殖，减少这些细菌产生的毒胺、吲哚、氨、硫化氢等致癌物对机体的损害，延缓机体衰老过程。摄入低聚果糖减少有毒代谢产物的形成，这大大减轻了肝脏分解毒素的负担。 除上述功能以外， 低聚果糖可以激发免疫活性，促进杀死肿瘤细胞的巨噬 细 胞的产生， 增加人体免疫功能，有抗肿瘤作用 （ S, , V.， 1997； A, D, K.， 2003） 。 也可以将菊粉水解产物膨化作为功能性饲料添加剂，具有相同的增殖双岐杆菌作用， 具有 增加家禽的抗病能力 的 功效，被称为原生素（ 国内曾有在产蛋鸡饲料中添加低聚果糖生产无沙门氏杆菌鸡蛋的报道。 聚果糖的应用前景 功能性低聚糖产品于 1998 年在日本市场推出，欧洲在 90 年代初开始发展， 我国在 2000 年已有商品上市，包括低聚异麦芽糖、低聚果糖、大豆低聚糖等，低聚木糖和木苏糖也已完成中间试验。 低聚果糖由菊粉酶解或蔗糖酶转化制成。欧洲市场大量产品是菊粉酶解产品，日本则以蔗糖酶转化生产，我国也是蔗糖酶转化。欧盟将低聚果糖批准为食品配料，而不是食品添加剂。加拿大、澳大利亚、新西兰 、 以色列等国家均批准为食品配料，允许在食品标签上注明有双歧杆菌增殖作用。美 国 、英 国 、法 国 、德 国 、澳大利亚以及台湾都已生产含有菊糖及低聚果糖的食品。现已应用于乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、果冻和冷饮等多种食品， 特别是保健食品和老年食品中，约有 200 多个品种。并可作为填充剂，质构改良剂，风味掩盖剂和脂肪替代品应用于食品中。 目前用菊粉水解制备超高果糖浆或结晶果糖作为强力甜味剂，已越来越 受 到国内外的重视。日本、美国、法国、英国等工业发达国家已开发出用菊粉一步水解制备超高果糖的工艺技术并应用于工业化生产。目前合成技术在不断完善提高，其研究重点是寻找性能优良的产菊粉酶的菌种和 各种水解工艺技术等。 中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 7 目前世界上菊粉及以其为原料生产的低聚果糖超过 10 万吨，进口菊粉的售价约为 4 万元 /吨。我国菊粉及低聚果糖开发相对较晚，目前国内低 聚果糖的年生产能力约为 3000，据推算，我国目前低聚糖的市场容量约为 1吨 /年，预计 2008 年国内市场将达到 8 万吨。 4 达系统 酵母是一类种类繁多的生物资源，已知有 80 个属约 600 多种，数千个分离株。 1978 年将来自于一株酿酒酵母的 因导入到另一株酿酒酵母，用以来互补后一株酿酒酵母的 陷 ,这标志着酵母表达系统的建立。早在 20 世纪初人们已经开始认识甲基营养酵母， 1969年 现酵母可以利用甲醇的事实，此后人们发现几种可以 在甲醇上生长的酵母，其中包括：毕赤酵母属 )、 汉逊氏酵母属 )、 假丝酵母属 )和 球拟酵母属 )。 一种工业用甲醇营养型酵母，它是一种可以高效表达外源蛋白的宿主菌(et 1998；李艳等， 2001)。 达系统利用紧密控制的甲醇诱导启动子控制基因表达。葡萄糖和甘油抑制乙醇氧化酶和二羟丙酮合成酶的调节区域，碳源限制情况下，乙醇氧化酶抑制解除而二羟丙酮合成酶 受到抑制，在甲醇中两种酶均被充分诱导表达。重组 以在限制性基本培养基上进行外源蛋白的生产， 失型菌株通常以分批方式培养，因为这类菌株在甲醇上生长极其缓慢，在 点有插入表达体的菌株采用连续方式进行培养。 已经用 达了许多胞内及分泌型蛋白，对于不同的蛋白质，表达水平从 1%至35%各不相同，对于大多数蛋白质生产来说，随着发酵规模的放大，细胞的密度的增长呈线性放大，而发酵的时间则缩短。在一般情况下，胞内蛋白质溶于简单的缓冲液，并且具有较好的 生物活性。 达系统的研究 醇诱导调节序列 用 达外源蛋白的研究主要集中在建立以甲醇诱导启动子作乙醇氧化酶启动子的质粒的构建，同时也分离、克隆了一种编码分子量为 76 000 蛋白质的甲醇调节基因 。 研究发现这些基因的表达受转录调控，乙醇氧化酶的上游序列与面包酵母的转录和翻译启动子相似。 乙醇氧化酶的甲醇调控基因和二羟丙酮合成酶基因在表达载体上协调作用使外源蛋白在表达。 动子是从 因组中分离出的大小为 1 000 一个基因片段，该片段直接置于乙醇氧化酶结构基因之前。 种甲醇营养型酵母作为外源基因表达的宿主菌株 （戴秀玉， 1997） ，其兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，并且发酵条件简单，适宜高密度培养，是外源基因表达的理想宿主。 氨酸脱氢酶突变体，它是常用的表达宿主菌。该突变菌 株是以亚中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 8 硝基诱变后产生的。 研究了缺失甲醇代谢的 因被破坏后产生的 株在甲醇中生长缓慢；采用同样的方法得到一株突变菌 菌株的 时被破坏，不含乙醇氧化酶，其不能在甲醇上生长。 达载体 用于 达外源蛋白的载体包括来源于 用于筛选和维持的 母用于控制外源基因表达、选择及某些情况下染色体整合的 列。现已有两种基本的表达载体，一 种是 用于自动复 制，另一 种是 用于在酵母乙醇氧化酶位点整合。 这 两 种 载体均具青霉素抗性基因及来自质粒 复制起始区，另外，还有来自细菌的非编码区基因连接在 匹配序列中 ，其长度不超过 300 利用从乙醇氧化酶（ 因分离出的控制序列， 表达了很多外源蛋白；另外，研究表明 动子在甲醇诱导表达生产 从 构基因上游分离的 300因插入的 隆位点，它由一个合成的连接头提供的含有单一 点的多接头载体也已开发出来，方便了各种不同末端的基因的插入。 自主型载体，如， 从 P. 因中分离的自主复制序列，含 因的自主质粒经数代培养后可以自动存在，然后自发结合到 基因组中，这是一种在插入位点无 除的 入技术，是非常稳定的。另外，自主型载体的 因的 制位点可定点插入外源基因，该克隆株表现 出 很高的稳定性。例如链激酶基因在其自身的启动子作用下于 表达 ,基因表达不稳定 ， 而 存在链激酶分子的翻译后断裂 。 而将删除信号序列的链激酶基因插入自主型质粒 ， 转化后经甲醇诱导后 ,载体自主地整合到 P. 因组 ， 从而得以稳定保持 ,并且 产生的链激酶可以与抗体发生反应 ，迹及生化分析表明 ， 其特异活性与天然状态的蛋白相同 。 最常见的结合载体 P. 第 二代表达载体，这种载体以外源基因取代 et 1992;001)。它和自主载体的不同之处在于：在 点发生同源重组必须无 列，并且需要有大约 1000 3 列。用 消化环状载体后可得到含有 纵序列、外源基因、用于筛选的 因和一个较长的 3域的基因盒，可将该线性基因盒插入 P. 株，得到 转化体。 5% 转化 子 出 在 甲醇 为唯一碳源的培养基 上 表现出 低生长，表明表达体中外源表达基因取代了 因。其余转化 子 是 表 型 ( et 1989)，甲醇上可生长正常，表明外源表达体随意结合于基因组上。在 破坏的菌株中，由于存在第二种乙醇氧化酶（ 得菌株有 10%乙醇氧化能力，因而可在甲醇中维持低速生长。 择性标记 P. 母表达系统可以利用两类筛选标记，一类是营养缺陷选择标记，包括 中 常用的筛选标记，另一类是显性选择标记，如 。 从野生型 P. 株 分 离得到 因，将其插入表达载体，作为组氨酸 营养 缺陷型突变体 选择性标记， 酿 酒酵母的 因与 的组氨酸突变互补，可中国农业科学院硕士学位论文 第一部分 引言 9 作为这种菌株的最初特性，是第一代 P. 体的选择性标记。 研究发现 来源于 酿 酒酵母 的编码蔗糖酶的 因可作为 重要选择性标记。带有 蔗糖酶 基因的 母可在蔗糖上生长，而野生型的 却不能生长。 只有当染色体上结合了这种基因后，才能获得稳定的可以在蔗糖上生长的菌株 ，所以可以