【毕业学位论文】（Word原稿）增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关基因的差异表达蔬菜学博士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关 基因的差异表达 o. 录 中英文摘要 第一章 引言 1 2 茄果实颜色的遗传 2 茄果实颜色有关基因的功能机制 2 3 茄 究概况 5 茄果实颜色 究进展 5 6 7 析的目的及 析方法 8 析的目的 8 析方法 8 析群体 9 传图谱的建 9 6. 从转录角度研究基因及基因表达的方法 10 接分析 10 接分析基于核苷酸序列测定的方法 10 接分析：基于片段长度的方法 11 接分析 12 13 第二章 番茄第 4 染色体底端长 50色体片段的分子 遗传图谱构建 14 1. 材料与方法 15 验材料 15 记序列的获得及引物合成 16 析 16 析 16 据整理和连锁分析 19 2. 结果与分析 19 析结果 19 记的序列分析及 物设计 19 记的 化结果 20 用 记对 其近等基因系的分析结果 25 茄第 4 染色体底端长 50色体片段 记的建立以及对 其近等基因系的分析结果 30 锁图谱的构建 32 33 于 标记的转化 33 于制作番茄精密分子遗传图谱 33 于 析 34 三章 增强番茄果实颜色 精细定位 35 35 果实颜色的表现型分析 35 析 35 36 其近等基因系的果实颜色表现型分析 36 强果实颜色 精细定位 37 38 第四章 利用 析方法鉴定与果实颜色有关的基因 39 39 料 39 提取 40 1.3 合成 40 析 41 再扩增、纯化和序列分析 41 列同源性比较 41 2. 结果与分析 41 5 个番茄品种在不同生育阶段的 析结果 41 对特异 次 增结果 44 序列分析结果 45 同源序列比较 45 47 第五章 术及其在番茄遗传鉴定中的应 用 49 1. 材料与方法 49 料 49 测 49 实验步骤的优化 49 入 2 对引物和 3 对引物的 验及对 12 个近等基因系的 析 50 2. 结果与讨论 50 术的建立 50 术对番茄 其近等基因系的遗传鉴定 52 第六章 综合讨论和结论 55 1. 关于增强番茄果实颜色 精细定位 55 2. 关于增强果实颜色 功能 56 3. 其近等基因系的在番茄育种中的应用 57 4. 结论 58 参考文献 59 致谢 66 作者简介 67 表 目录 图 茄的类胡萝卜素合成途径 4 表 究的引物和接头序列 17 图 带 记的质粒用限制性内切酶消化后的电泳结果 19 表 据 记设计的 物序列 20 表 记转化为 结果 22 表 1 个 记转化为 记后的多态性 25 图 用引物 其近等基因系的 析结果 26 图 用引物 其近等基因系的 析结果 27 图 用引物 其近等基因系的 析结果 28 图 用引物 其近等基因系的 析结果 29 图 用引物对 析结果 29 表 用 11 个 记和 8 个 记对 其近等基因系的分析结果 30 图 用 8 个 记对 其近等基因系的分析结果 31 图 茄第 4 染色体底端长 50段的分子遗传图谱 32 表 实表面颜色和果实内部颜色的方差分析 36 图 强番茄果实颜色 精细定位 37 图 个番茄在果实不同发育阶段的 析结果（引物组合 59） 42 表 过 径获得的 5 个番茄在果实不同发育阶段特异表达的 43 图 用在 析中的相同引物组合对特异 再扩增结果 44 图 用在 析中的相同引物组合对特异 再扩增结果 45 表 60同源性比较结果 46 表 60同源性比较结果 47 图 物 增结果和利用限制性内切酶 消化后的结果 50 图 物 同时加入 2 个上述引物的 增结果 和利用限制性内切酶 消化后的结果 51 图 物 同时加入这 3 个引物的 增结果 和利用限制性内切酶 消化后的结果 52 图 用 12 个近等基因系的 析结果 53 图 用 其 12 个近等基因系的 析结果 53 图 用 其 12 个近等基因系的 析结果 54 V 摘 要 番茄果实颜色是重要的品质性状之一，利用野生番茄中增强果实颜色的 基因对于果实颜色品质改良具有重要意义。为此国内外研究者展开了广泛的研究，已从野生番茄中鉴定了 54 个与果实颜色有关的 建立了主效 等基因系 (亚近等基因系 (例如 是野生多毛番茄 (一个渐参系，以普通番茄 遗传背景含有 1 个长 50 4 染色体底端的片段， 析表明该片段含有 2 个明显增强果实颜色的 本研究在前人研究工作的基础上，以 其近等基因系为主要材料，对其中的 2 个增 强果实颜色的 行了精细定位，并利用 法研究了含有增强果实颜色 材料在果实不同发育阶段基因的差异性表达。目的在于：通过 细定位获得与之紧密连锁的分子标记，增强育种家操作 力，并为 进一步克隆提供理论依据；通过基因差异性表达鉴定和分离与果实颜色相关的基因，研究基因在果实不同发育阶段的表达，并初步探讨 响果实颜色的机制。主要结果如下： 1、 进行了能否将潘那利番茄图谱上的分子标记应用到多毛番茄进行遗传分析， 并将其转化为易于操作的 记以 克服 记的 操作复杂、耗时长、需要放射性步骤和成本高的缺点的尝试，通过对 21 个 记的 化分析，获得了 11 个可用于多毛番茄的 用 11 个 记对 其近等基因系进行遗传分析，获得了与预期结果一致的多态性，表明 记可以转化为易于操作、效率高成本低的 记。 2、利用 72 个 、 行了 析，结果每对引物可以扩增出 60100 条分子量为 20600谱带，一共发展了 8 个 记，其引物组合及其分子量分别为： 475948494738/59 60过连锁分析将 8 个标记定位于多毛番茄第 4 染色体底端长度为 50片段内。 3、利用 记构建了番茄 第 4 染色体底端长 50段的精密 分子遗传图谱， 该图谱由 26 个标记组成，其中包括新建立的 11 个 记和 8 个 记，是原有图谱上的 10 个标记的 。图 谱覆盖了番茄第 4 染色体底端长 50片段，两个标记之间的平均距离 图谱将为该染色体片段内的质量基因定位、基因组比较研究和重要农艺性状 精细定位奠定基础。 4、对多毛番茄第 4 染色体底端长 50段内的 2 个增强果实颜色的 行了精细定位，强果实表面颜色， 强果实内部颜色，结果将 位于标记 59间，遗传距离为 原有的距离 小了 位于标记 间，遗传 距离为 5、 研究番茄基因差异性表达较为理想的方法，利用该法检测到 162 个在果实 的膨大期、绿熟期、转色期和完全成熟期 特异表达的 利用在选择性扩增中相同的引物组合对分子量大于 180 90 个 行了再次扩增、 纯化、序列测定和同源性比较分析。 结果发现 2 个已克隆的基因序列相比同源性较高。 60自番茄 转色期，利用引物组合 60 进行选择性扩增后获得，分子量为 460序列与番茄属 (绿体 因序列的同源性高； 60序列与番茄的透性酶基因、生长素生 促进子蛋白质、蛋白质磷酸酶和 因的同源性高。其余 已知功能基因的序列相比同源性较差，只有 19碱基与已克隆的基因序列一致。在含有增强果实颜色 (和 ) 番茄 及 对照之间，同源性分析均未检测到含有 (和 )番茄材料在果实发育各个阶段特异表达的 类胡萝卜素合成途径有关的酶的基因有 较高的同源性，但与果实颜色密切相关的类胡萝卜素合成途径、乙烯代谢途径、富含亮氨酸的蛋白质合成途径等高度相关，表明 属于类胡萝卜素代谢途径有关的酶的基因，可能属于调节和控制因子。 6、在 验中，基于一些 记分享同一种限制性内切酶的事实，结合 用 理首次研究建立了 术。该技术能同时检测 2 个、 3 个或多个 记的多态性， 其效果等同于各个 记的多态性的叠加，具有重复性好、分析效率高、成本低等优点，可广泛用于番茄及其它作物快速的遗传鉴定和分子育种中。 关键词： 番茄 , 果实颜色、 细定位， is of in is to of 4 to in of to a a 50at of in it on to as of at of 1) TL 2)at as of by et)at of OS 11 1 in a 50 NA of is as by 1 OS be be 6203 2 . 0 00 of 04759484947625941/at 0at of by 6 1 0at of . a of TL of at of on 0at of of 41/ by 5. 162 at of at 90 is 80bp 60at 33/60 609of t of in it It be of in be on in at An by of in or in at of be in 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 第一章 引言 番茄 (世界人民喜爱的重要蔬菜，年种植面积 产量 吨 (002)。番茄在我国栽培历史虽短，但已经成为主要的蔬菜之一，目前栽培面积已达 1455 万亩，产值超过 200 亿元人民币 ,需求量和种植面积都在逐年增加 (杜永臣等， 1999)。 番茄果实颜色是重要的品质性状。无论对于鲜食用，还是加工用品种，果实颜色深和色素含量高的品质优良，受生产者和消费者欢迎。番茄红 素和胡萝卜素是构成果实颜色的主要色素，番茄红素是极好的抗氧化剂，可抑制前列腺癌、消化道疾病和心血管疾病等的发生， 的前体，在增强机体免疫力、抵抗疾病、抑制癌等方面起着重要作用（ et 1995;et 2000） ，因此培育果实颜色深、鲜艳、色素含量高的品种是番茄品质育种的重要目标之一。 番茄属于自花授粉植物，经过长期的高选择压的筛选，普通栽培番茄种群的遗传背景变得越来越狭窄，利用现有的遗传育种资源和常规育种手段很 难在果实颜色育种改良上取得突破性进展。因此利用野生番茄中增强果实颜色的基因对于果实颜色品质改良具有重要意义。 为此国内外研究者展开了广泛的研究，结果表明，多毛番茄（ 潘那利（ 醋栗番茄（ 小花番茄（ 奇美留斯基番茄（ 野生番茄中存在增强果实颜色、提高番茄红素和胡萝卜素含量的 从野生番茄中鉴定了 54 个与番茄果实颜色有关的 建立了主效 近等基因系(亚近等基因系 ( 目前存在的难题之一是增强果实颜色 等基因系或亚近等基因系中所含有的野生番茄的染色体片段长度在 550间，仍然比较长， 低产量、小果实等不良基因间连锁累赘的影响仍然较大，在育种实践中直接应用这些增强果实颜色、提高番茄红素和胡萝卜素的有很大的难度。 另一难题在于，果实颜色的深浅本身也是一个复杂性状，其主要决定于番茄红素、胡萝卜素等类胡萝卜素的种类、含量和比例，任何与类胡萝卜素合成途径有关的基因突变都影响其最终结果，而且影响果实颜 色深浅的 果实发育的不同阶段（幼苗期、开花期、果实膨大期、青熟期、绿熟期、白熟期以及完全成熟期）如何影响番茄红素、胡萝卜素等类胡萝卜素的合成、运输、积累等生理生化代谢过程具体机制尚不明确，因此急需进行与类胡萝卜素合成有关基因（包括 分离与克隆、基因的调节和控制、以及基因在不同阶段的表达等方面的深入研究。 最近几年随着 析方法的发展以及从转录角度分离和鉴定基因技术的建立和不断完善， 提供了解决上述两大难题的关键技术。 析方法将 析和品种选育相结合，能鉴定野生或未驯化种质中有用的 因），并将 入到现有栽培番茄的骨干系中 。从转录水平鉴定、分离、研究基因表达的技术（如 ）不仅能有效地发现新的基因，评价基因在不同组织、不同生长发育阶段的表达水平，还能进行基 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 因功能研究。 因此利用 析和基因表达研究技术的最新成果，将果实颜色 分离、精细定位和 种相结合，并从基因表达角度鉴定和分离影响果实颜色的基因、研究 响果实颜色、影响类胡萝卜素合成过程的具体步骤，对于利用分子标记辅助选择加速番茄果实颜色育种进程，对 于 进一步克隆以及深入研究 响果实颜色的生化合成过程的具体机制，均有重要意义。 茄果实颜色的遗传 番茄成熟果实颜色分红色、粉红色、黄色、绿色、紫红、橙红、白色等。 934); 953); 余诞年 (1957 967)等的研究表明果实颜色决定于果皮颜色和果肉颜色。果皮颜色分为黄色和透明两种，由 1 对等位基因控制，黄色果皮基因 Y 相对于透明果皮基因 y 为显性 。果肉颜色主要分为红、黄、橙三种，分别由 2对等位基 控制，其中“ R”基因导致红色果肉表型的产生，基因“ r”则产生黄色果肉，基因“ T”决定非橙黄色果肉，“ t”基因产生橙黄色果肉；橙黄色果肉基因“ 红色果肉基因“ “隐性”上位作用，因此当黄色亲本 橙色亲本 交后，基因型和表现型的比例为： 9 ： 3： 3： 1 红色 ： 3 黄色 ： 3 橙色 ： 1 橙色 这三对等位基因的不同组合使成熟番茄果实表现出不同颜色：红色果肉与黄 色果皮组合果实表现为“红色”；红色果肉与透明果皮组合果实表现为“粉红色”；黄皮黄果肉组合形成深黄色果实；黄皮橙黄果肉组合形成深橙黄色果实。基因 y,r,t 分别定位于第 1， 3 和 10染色体上。 茄果实颜色有关基因的功能机制 除 y,r,t 基因外，涉及果实颜色的基因还有 B， 些基因均属于单基因。基因作用机制在于控制类胡萝卜素生化合成过程的不同环节，从而影响类胡萝卜素的组成，最终使果实表现出不同颜色（图 R r 红色果肉基因 R 和黄色果肉基因 r 作用的实质在 于： r 是在 氢番茄红素合成酶）中丧失功能的突变，当隐性 r 基因表达时，由于阻止了牻牛儿牻牛儿二磷酸酯（ 八氢番茄红素转变，不能合成番茄红素，胡萝卜素和其它类胡萝卜素的含量减少，从而使果实表现为黄色 (图 该基因已被克隆，在基因库中的编号为 T t 异构酶基因 克隆阐明了长期以来困扰学术界的“类胡萝卜素异构化”难题 , 因编码类胡萝卜素异构酶，在野生型番茄中全部合成反式番茄红素(et 2002; et 2002; 002)。当 t 基因表达时，由于阻止了顺式番茄红素向反式番茄红素的异构作用，结果在突变体果实中积累7Z,9Z,7Z,9式番茄红素，从而使果肉表现出橙色，该基因已利用依图谱法克隆，在基因库的编号为 茄突变体 有一个显性基因 基因的表达导致 胡萝卜素的积累，使果实颜色由正常的红色变为橙黄色， 被定位于第 12 染色体上。已克隆了将番茄红素中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 转化为 胡萝卜素的番茄红素 （ 位点与 因共分离， 因的转录水平在果实的转色期增加到 30 倍，而在野生型番茄中降低到几乎检测不到的水平，据此推测 一个 基因库的编号为 et 1999)。 B 和 )突变含有一个增加果实 胡萝卜素的显性基因， 一个中止 胡萝卜素合成而增加番茄红素含量的隐性突变， B 和 通过依图谱法克隆 (et 2000)。 B 编 码番茄红素 环化酶，在果实的转色期，野生型番茄中 B 的表达水平极低，而在 变中其转录水平剧烈增加， 胡萝卜素占总类胡萝卜素的 45 50，如果该基因与修饰基因（ 合其含量可超过 90 (000)。两个隐性等位基因突变 的果实均为深红色， B 是等位基因，定位于第 6 染色体上 ,在基因库的编号为 具有 因 型的番茄在果实发育阶段番茄 红素和 叶片和绿色果实中叶绿素的含量很高， 在生长和发育过程中还表现出对光有调节反应，该基因被定位于第 2 染色体上，相应的 因被克隆 (et 1999;et 1997)。 在未成熟果实中该基因明显增加叶绿素含量，在成熟果实中番茄红素的含量比普通类型增加 100%， 50%，甚至比 高 50%(余诞年， 1999)。 上述基因的不同组合和基因间的相互作用使果实表现出不同颜色，并使果肉颜色 构成一个多层次的变异系列。这些克隆和即将克隆的基因将使人们更加透彻地理解类胡萝卜素生化合成途径及其调控机制，还为分子育种和通过遗传操作途径增强果实颜色、增加番茄红素、胡萝卜素及其它类胡萝卜素含量来改良番茄品质提供了理论基础。 育成果实颜色深、鲜艳、富含番茄红素和胡萝卜素的番茄品种是未来育种的重点，需要对控制果肉和果皮颜色的质量基因进行选择，但是其重点和难点在于如何采取行之有效的方法将增强果实颜色、提高番茄红素和胡萝卜素的多个基因聚合到栽培品种骨干系中，创造优良的育种种质 。 由于番茄果实颜色的深浅是数量性状，由数量性状位点 制，表现型与基因型之间没有明确的关系， 环境影响较大，因此在常规育种实践中很难对含有目的 单株材料进行准确的选择（例如不同育种者对同一单株果实颜色深浅的评价结果可能完全不同，同一育种者对同一材料在不同的年份和不同栽培环境下（保护地和露地）的评价结果也可能完全不一致）。 直到 析技术产生以后，育种家操纵 愿望才开始得以实现。借助于 析方法未驯化和野生种质中大量有益的 以鉴定和分离， 析方法的应用还实现了析和品种选育的有机结合。根据 究成果，育种家可以利用与 密连锁的分子标记对目的 行高效地选择，实现由常规育种对表现型的选择到直接地选择目的基因的巨大转变。因此 析技术一经产生就受到了极大的重视，人们深信该领域研究成果的运用将为作物育种带来重