【毕业学位论文】（Word原稿）猪NRAMP1基因PCR-RFLP多态性与免疫指标及生产性状关系的研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 猪 因 o.: 录 摘要 . I . 一章 引言 . 1 1抗病育种研究概况 . 1 . 1 病力的遗传学基础 . 2 . 3 . 3 . 5 . 5 因的序列结构分析 . 6 控 . 7 . 7 . 8 . 9 . 10 计及基因相应片段的扩增 . 10 . 11 . 11 证 . 11 . 12 4主要的分子标记 . 12 5非特异性免疫细胞简介 . 14 . 14 . 14 6免疫指标测定方法简介 . 15 . 15 . 15 7本研究的目的和意义 . 16 第二章 材料与方法 . 17 1实验一：猪 因 . 17 . 17 . 17 料和方法 . 17 2实验二：单核细胞和中性粒细胞功能测定 . 24 来源 . 24 . 24 料和方法 . 24 . 24 . 27 基蓝四氮唑（ 原实验 . 28 . 29 3统计分析方法 . 29 . 29 2独立性检验） . 30 . 30 第三章 结果与分析 . 32 1猪 . 32 . 32 . 32 2猪 . 33 . 33 . 33 3 不同品种基因频率与基因型频率分析 . 34 4 2 独立性检验结果表明基因型和品种之间是独立的 . 34 5免疫指标测定结果分析： . 34 . 34 . 35 6对各生产性状进行最小二乘分析 . 37 . 37 . 37 7死亡率比较 . 39 第四章 讨论 . 41 1免疫性状测定指标的选择 . 41 2 . 41 3 . 42 4 基因多态性与免疫指标的关联分析 . 42 5 基因多态性、免疫指标与生产性状的关联分析 . 43 第五章 结论 . 45 参考文献： . 46 致谢 . 53 作者简历 . 54 图表索引 图 白结构示意图 6 图 因在动物抗病菌侵染中的可能作用机理模型 8 图 15号染色体的物理和连锁图谱 9 图 离液离心后外周血细胞示意图 26 图 血液基因组 32 图 耳组织基因组 32 图 因 483 物 33 图 切 483 物的琼脂糖凝胶 (2%)电泳图谱 33 图 种内基因型间中性粒细胞最小二乘比较 36 图 种内基因型间死亡率比较 40 表 一些疾病抗性的遗传力 3 表 织 取液配方 19 表 样裂解液配方 19 表 析的引物序列，产物大小及位置 20 表 应体系优化结果 22 表 同品种猪 因 基因型和等位基因频率 34 表 T 不同基因型的最小二乘均值及标准误 35 表 用最小二乘分析各变因对中性粒细胞 原力的影响 35 表 同品种 最小二乘均值及标准误 35 表 并基因型间 最小二乘均值及标准误 36 表 种内不同基因型间 最小二乘均值及标准误 36 表 小二乘分析各变因对生产性状的影响 37 表 同品种生产性状的最小二乘分析及标准误 38 表 并基因型间生产性状的最小二乘分析及标准误 38 表 种内不同基因型间生产性状的最小二乘比较 38 表 同品种间死亡率比较 39 表 并基因型间死亡率比较 39 表 种内不同基因型间死亡率比较 40 缩略语（ 英文缩写与中文名称对照表 缩略语 英 文 中文 天然抗性相关的巨噬蛋白 聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 扩增片段的长度多态性 单核苷酸多态性 标记辅助选择 随机引物扩增多态性 单链构型多态性 双链构型多态性 硝基蓝四氮唑 噻唑蓝 单核细胞 中性粒细胞 单核细胞细胞毒作用 中性粒细胞 磷酸盐缓冲液 最小二乘均值 标准误 摘 要 在动物育种上， 抗病性能正逐渐成为当前畜禽育种的重要目标性状。 畜禽机体抗病力影响较大。本研究以猪 析该基因作为抗病力的候选基因的可能性。 以饲养在相同条件下的国外引进品种大白 165头、地方杂交品种中畜黑猪 109头为实验动物，利用 定与 核细胞的细胞毒作用及中性粒细胞 生产性状进行全程观察，测定断奶重、下网重和 180日龄重并进行死亡记录 ,研究结果如下： 1、大白和中畜黑猪的 有三种基因型：两品种中都具有多态性，且基因频率和基因型频率分布趋近一致。 大白 品种 中 畜黑猪中 率为 位基因 的频率，大白 猪 中等位 基因 率为 等位基因 畜黑猪中 因频率为 2、 品种效应和基因型效应对中性粒细胞 (原力影响不显著，但品种和基因型的互作效应影响极显著（ 。 品种间 180龄重差异显著 ( 4. of no as as of in B B W, B B on be as a of 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 1 第一章 引 言 在动物育种 中 ，人们一直追求主要经济性状的提高，特别是运用先进的选择方法后，畜禽主要经济性状不断提高，但是，高产性状与某些适应性性状 (如健 康性状，繁殖性状等 )之间存在着一定程度的拮抗，表现负的遗传相关，如高产乳牛免疫系统抵抗外来刺激的抵抗力弱，猪瘦肉率达到 一 定程度会导致应激和肉品质下降等，在育种实践中，单纯追求高产目标通常会导致家畜抵抗力降低，引发一些疾病。 家畜疾病，尤其是传染性疾病是畜牧生产的大敌，严重制约着畜牧业的发展，由疾病造成的经济损失约占畜牧业产值的 12尽管预防接种发挥了重要防治作用 ,但未能完全控制和消灭传染病的流行 ,随着集约化程度的提高和饲养条件的改变 ,又相继发现新传染病的发生和流行。加上病毒抗原漂移、超强毒株的出现 及母源抗体的干扰 ,某些疫苗缺乏效力、过度使用药物造成食品污染 等都促使人们不断探索新的防治办法。这就需要发展一种平衡的策略，通过提高家畜抗性减少药物使用。 随着分子遗传学的飞速发展，畜禽遗传图谱的不断完善，遗传标记的不断补充使得一些与疾病抗性有关的基因或遗传标记相继被发现。采用遗传学方法从遗传本质上提高畜禽的抗病力，实施抗病育种，筛选出动物抗病系和培育出抗病动物可能成为解决该问题的有效途径。 1 抗病育种研究概况 病机理 疾病抗性通常由非特异性免疫和特异性免疫控制。除免疫基因外的非免疫基因对疾病的抗性也起 很大作用。 病原体在传染过程中，会遇到 3道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制。当个体受到病原体侵入时，会调动这 3方面的防御机制加以抵抗。猪是否发病取决于侵入和防御机能相互作用的结果，防御机能加强的猪便表现出自然的抗病力 1) 非特异免疫 非特异免疫是先天的无特殊针对性的天然抵抗力，与机体的组织结构和生理功能有密切关系 。 抗感染过程中，这种免疫发挥作用快，范围广，是抗感染的第一道防线。且该免疫 没有记忆，且一旦被触发总以同样的方式反应，对病原体的抵抗包括如下几种： 封闭的、生理屏障性的抵抗（皮肤、 肺和小肠黏膜上皮层） 缺乏适当的附着、渗透在细胞膜上的受体 抑制进入宿主的病原体的生存 抑制病原在宿主中的复制。 巨嗜细胞和中性粒细胞的吞噬、杀灭和排出作用 从分子水平上讲，有许多因素控制非特异性免疫，包括碳水化合物、脂多糖结合的外源凝集中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 2 素、吸附作用和急性期蛋白、干扰素以及其他细胞因子。这类免疫可连续表达，也可快速激发。种间对某一特定疾病易感性的差异反映出非特异免疫机制的重要性。在非特异免疫中研究得较多的是与天然抗性相关的巨噬蛋白 (它提供对细胞间病原菌的抗性。 2) 特异性免疫 特异性免疫在于识别特异抗原，识别“自我”与“非我”及免疫记忆。 抗原特异性免疫系统的作用是由所谓的“记忆细胞” 起作用的。这种记忆的结果导致同一抗原再次入侵时启动快速的特异性反应。 特异性免疫涉及 3种细胞：抗原递呈细胞 (T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞。 3 类细胞相互作用，产生抗体。特异性免疫的特异性由抗原处理和识别分子 T 配。 3) 细胞因子、非特异性免疫及特异性免疫间的关系 机体防御外来微生物，如病毒、细菌是由非特异性免疫和特异性免疫介导的，非特异性免疫和特异性免疫两种效应机制大部分是由细胞因子介导的。细胞因子是由免疫细胞分泌的，能影响其他细胞功能的多肽，产生于天然免疫和特异免疫的效应阶段，对免疫应答、炎症反应起介导和调节作用。根据细胞因子的特异性功能，可以将细胞因子归 纳为四大类：介导和调节天然免疫的细胞因子，主要由感染因子诱导的单核巨噬细胞产生；刺激或抑制炎症反应的细胞因子；介导和调节特异性免疫的细胞因子，通过 起到增强、聚集和限定炎症范围的作用；此外，还包括刺激造血的细胞因子及其他与生长、分化、胚胎发育等有关的细胞因子。现在已发现了 100 多种细胞因子。如干扰素 (肿瘤坏死因子 (集落刺激因子 (转化生长因子 (白细胞介素 (。 病力的遗传学基础 抗病力可分为特殊抗病力和一般抗病力 ,其遗传机制不同。一般抗病力不限于抗一种病原体 ,它受多基因及环境的综合影响 ,具体体现在机体对疾病的防御机能和对抗原的免疫应答能力（施启顺， 2001），较少受病原体来源、类型和入侵方式的影响。如鸡对马立克氏病的抵抗力受 因族、 其他微卫星标记等多基因控制（马吉飞， 1997）。 特殊抗病力是指畜禽对某种特定疾病或病原体的抗性 ,这种抗性或易感性主要是受一个主基因位点控制 ,也可能程度不同地受其它未知位点 (包括调控子 )及环境因素的影响。其内在机理是由于寄主体内存在或缺少某种分子或其受体（施启顺， 2002）。这种分子有以下作用 :决定异体识别及特异性异体反应 ;决定病原体的特殊附着力 ,即能否进入寄主 ;传染因子进入体内 ,在体内增殖时 ,决定是否导致寄主发病。如大肠杆菌 体基因控制对大肠杆菌 附与否， I 型兰尼定受体基因控制猪应激综合症（ 在抗病育种中一方面是针对特殊抗病力的 选择，另一方面是针对一般抗病力的选择，特殊抗病力的测定和一般抗病力的测定同等重要，特殊抗病力可通过特殊病原体直接攻毒试验而进行测定，一般抗病力比较复杂，如何衡量尚无统一规定。由于一般抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能，因此提高机体的一般抗病力亦是提高机体的免疫机能。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 3 病性的遗传性 大多数疾病的发生或多或少受遗传因素的控制或影响，即使由特定病原体侵袭所致的传染病或寄生虫病，在不同种群、不同个体中的易感性是不同的，这种易感性的高低决定于遗传素质或遗传与环境的共同影响。同理，不同种群、不同个体对疾病（这 里主要指传染病与寄生虫病）抗性的大小也同样受遗传和环境两个方面因素制约。个体对疾病的抗性体现在机体对疾病的防御功能和免疫应答能力，这种抗病能力的大小受遗传和环境的共同影响，其中受遗传因素影响的程度可用遗传力表示，这就是疾病抗性的遗传力。表 出猪对某些疾病抗性的遗传力资料。 表 一些疾病抗性的遗传力 性状 遗传力（ 资料来源 萎缩性鼻炎 地方性肺炎 胸膜炎 钧端螺旋体 肠功能紊乱 1979） 1979） 1979） 1979） 1988） 由表 此可以采用 遗传学方法从遗传本质上提高畜禽的抗病力 ， 实施抗病育种，筛选出动物抗病系和培育出抗病动物。 病育种的主要途径 抗病育种的途径很多，但一般可分为两大类，一类是直接选择方法，另一类是间接选择方法。 病力的直接选择 抗病力性状为阈性状，表现为非连续的一类性状。在相同的感染条件下，有的发病，有的不发病；发病的有的死亡，有的康复，不发病的个 体明显表明具有抗性的遗传基因， 通过观察和量化疾病抗性或敏感性基因型的变异而直接提高某一特定疾病的抗性是不实用的，因为不可能有足够的个体对所有可能的目标疾病都有抗性，而且，也有着明显的冒险性，那就是：可能导致对另一类相反疾病的敏感性，产生相反的病原菌；而且宿主抗病机制广义上说与细胞内和细胞外的寄生虫有关。要鉴别出很多或一些在经济上有重要意义的疾病主基因似乎也是不太可能的。因此，直接选择效果不好。 病力的间接选择 用免疫应答进行抗病育种 在攻击环境下进行抗病育种的选择有一定的难 度，因此可以利用免疫应答作为抗病力的间接选择指标（ 989）。 1980）利用小鼠的研究证实了抗体对绵羊红细胞反应中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 4 的遗传机制是中等遗传，而且选择某种抗原的体液免疫应答可以改善其他抗原的体液免疫应答。免疫应答的遗传机制已在家禽中得到了最广泛的研究（ 990）。猪许多免疫性状的加性遗传效应也都有报导，如抗体应答，单核细胞的增生和毒性效应，延迟性超过敏反应和白细胞总数和分类。很多免疫性状具有中等到高等（ 遗传力，即具有较大的遗传效应。 1974;1980)分别用绵羊红细胞和半抗原 (为抗病物质 ,揭示了在种间和品系间的重要差异。 (1984)用支气管败血巴氏杆菌商品疫苗和伪狂犬病毒疫苗进行接种 ,其结果在种间和品系间差异显著 ;其免疫应答呈低到中等遗传力 ( (1985)对 2种 过提高抗体和细胞免疫反应的育种方法来提高对传染性疾病总的抗性显然是可行的，因为有了要选性状的遗传力，能找到和或培育出高或低免疫应答的基因型。 记辅助选择 ( 标记辅助选择是通过与抗病性有关的已经定位的遗传标记或控制抗病性的基因来选择。典型例子是鸡的马立克氏病与 而 可间接通过选择 其实施简单 ,准确性较高 ,成本低 ,可进行早期选择 ,是当前育种中较实用的方法。采用标记辅助 可进一步提高准确性 ,加快遗传进展。目前 ,应用于猪 遗传标记主要有：（ 1） 可同时对多种疾病进行选择 ,对一般抗病力选择效果较好。另外 ,多 种生产性状均有连锁 ,可望在提高抗病力和免疫力的同时使生产性能得到提高。（ 2） 记 : 引起断奶仔猪腹泻及水肿病的主要病原菌。 (1997)对 并结合细菌肠粘附试验发现该基因的 307位点具多态性 ,且与 ,可作为 307 位点产生由 G 从而使 个 切位点 ,产生 3种不同的基因型 ,997)以 此标记 ,用 250头瑞士大约克、杜洛克、汉普夏、皮特兰等种猪进行基因型测定 ,依据测定结果通过适当的选配实施了抗性育种。美国 下此成果并大规模产业化 ,且于 1999 年 7 月宣布在大约克中育成该病的抗性猪。同理 ,因被证实为 8R 的一个候选基因 ,有可能作为 8R 的标记用于标记辅助选择。以上受主基因影响的某种已知疾病的抗性或简单的遗传缺陷 ,其标记物可能只有一个，大多数疾病是由多基因控制的 ,其标记物相当复杂 ,但利用数量性状位点 (分析方法 ,可以将影响数量性状的多基因剖分为几个不连 续的孟德尔因子 ,使其定位于特定的染色体上 ,确定它们与其它基因的关系 ,最终还可以分析出其 列。目前利用家系研究和连锁分析、原位杂交、 卫星片段或串连重复序列数 (态性等技术 ,人们可以方便而快捷地进行 位 ,从而进行畜禽重要经济性状 (包括抗病力 )的标记辅助选择。该方法具有比传统选育方案 (如后裔测定 )成本低、比单标记物的标记辅助选择全面可靠且选择的遗传进展快等优点。 行转基因工程抗病育种 从二十世纪 80 年代开始 ,人们尝试进行转基因工程抗病育种 ,依据抗性基因转移到动物体的中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 5 部位 ,可将其分为 2类 :（ 1）核酸免疫：将外源基因注射到动物体细胞内 ,使其在体细胞内表达并获得抗性 ,这种抗性不能通过世代交替而延续。（ 2）转基因动物：将部分内源基因或个体重组基因的克隆片段转移到动物体内得以整合表达 ,以产生有新的遗传特征或性状的动物。较有价值的侯选基因包括干扰素基因、干扰素受体基因、抗流感病毒基因、反义核酸、 因、核酶、病毒衣壳蛋白基因和病毒中和性单克隆抗体基因 ,这些基因的克隆片段可通过细胞显微注射、精子载体法、胚胎干细胞组建、体细胞克隆和逆转录病毒载体法等基因方法重组于猪的细胞内获得表达 ,使猪的抗病功能增强 ,培养特定的抗病猪群。现已培育成功流感病毒 (转基因猪。 病育种面临的困难与前景展望 虽然家畜抗病育种已在遗传机制和应用方面取得了进展，例如对遗传结构、基因表达规律、机体的防御系统以及病原体的遗传差异方面积累了丰富资料，但仍存在大量问题：（ 1）抗病性的遗传机制非常复杂且受环境影响较大；（ 2）病原微生物的遗传特性及与宿主动物的相互关系也十分复杂；（ 3）抗病性或易感性指标难以测定 ,且缺乏进行间接选择的可靠标记；（ 4）病原微生物变异迅速 ,易形成能克服抗病猪的变异品系；（ 5）抗性 与生产力性状之间存在负相关 ,不同疾病间也存在颉抗性；（ 6）世代间隔较长 ,必须经过长期选择。 目前，随着分子生物学技术的发展以及人们认识水平的不断提高，抗病育 种具有广阔的发展前景。 利用分子标记辅助选择进行抗病育种显示出很好的前景 。但是，抗病性状可能是多基因性状，并与环境互作效应大。因此，利用分子标记辅助选择的方法还需要进一步完善，其效果也需要进一步观察。总的说来， 提高畜禽的抵抗力是 提高畜禽的生产力 、 减少损失及降低饲养成本的重要保障。生产安全食品，对于促进养殖业的发展，提高畜牧业的整体效率及综合效益至关重要。因此 ， 随着分子生物学和基因工程技术的进一步发展，家畜抗病育种将成为家畜育种的 一 个热门领域。 研究进展 初发现小鼠 (细胞内病原微生物侵染所具有的抗性或敏感性是受 1 号染色体上显性基因 制的 ,由此将该类基因命名为 天然抗性相关的巨噬蛋白。 码具有完整膜的磷酸糖蛋白，含有 10推定的转膜区域，具有离子通道和转运功能的特征（ 996;996）。 因在网状内皮细胞器官的巨噬细胞中表达，如血液外周白细胞、脾脏、肺等，可抵抗多种胞内病原微生物（ 996）。在人或小鼠中发现 一些病原寄生物如分枝杆菌中的结核杆菌、沙门氏伤寒菌、利什曼菌等易感性和抗性有关，通过小鼠的基因敲除方法使 因失活和基因重组证实其功能（ 1995）。对其功能的分析表明 ,耗含有胞内病原微生物的吞噬体中二价金属离子，如镁离子、亚铁离子、锌离子等，使病原微生物缺乏增殖所必需的离子而达到抵抗胞内微生物的作用。这种依靠金属离子的多种细胞功能可以解释 括在传染性疾病和自动免疫疾病方面的复杂作用。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 6 因的序列结构分析 应用序列分析软件 ,发现 因家族编码一具有典型的膜整合蛋白特征的多肽分子 ,有10 12个跨膜区 (M),1 2个糖基化的胞质外环状结构和一个胞质内的转运蛋白特征结构域 ,具有高度的氨基酸序 列同源性和相似的二级结构。跨膜区 1 8 具有高度的同源性 ,推测这些跨膜区可能在 病原微生物侵染造成的疾病历来是动物抗病育种研究的焦点之一。随着病原微生物抗药性的增强及高效致病菌株的产生 ,这一问题更加尖锐。结核病菌的流行病学的研究表明 ,寄主对病原微生物侵染最初的敏感性是受遗传因素控制的。 1991 年在小鼠中发现 因家族之后 , （ 1995）又对小鼠 基因结构、启动子序列及其诱导表达进行了研究，获得整的 5端和基因全序列。不同的外显子分别编码 8转膜区域， 析表明 r 和脂多糖诱导并由 定位于染色体的 2 35位置。（ 1995）证实了 号染色体，含有 15 个外显子，包含在 区域内，其中 有几个外显子编码这种蛋白质可预见的结构区域，核苷酸序列和氨基酸序列预测分析得知人 码一个 550 个氨基酸残基、具有 10推定的转膜区域的多肽。对人和鼠 六个外显子分析表明，推定的第二个跨膜序列高度保守，暗示这个区域是重要的功能区域（ ， 1995）。 （ 1997）在研究猪的基因比较图谱过程中，在猪的脾脏 库中克隆猪 列，对其序列分析表明与人 序列编码 539个氨 基酸，与人的 2001）证实狗的 因位于染色体的 ，全长 9括 70015个外显子和一个包含微卫星多态的内含子 1，编码 547个氨基酸，与其它哺乳动物的 7的同源性。 图 白结构示意图 of 12 分别表示一个跨膜域 (灰色的第四跨膜域是在小鼠中发生突变造成功能丧失的部位 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 7 随后又证实鸡 于 7 号染色体 (995)，猪的位于 15 号染色体 (H S 998)，牛的位于第 2 号染色体 (1996)，绵羊 位与 2段（ ， 1995）。另外 ,在果蝇中也克隆了 源基因 ,该基因的突变导致果蝇的嗅觉敏感性降低。 进一步研究表明 , 该家族至少具有 2 3个成员。随后 基因定位于小鼠的 15号染色体 ,人类染色体的 12 13 位置。 （ 1995）对不同物种的 因序列进行了综合比较 ,结果表明 ,哺乳动物的 6%的一致性。 因的表达、调控 动物的 因主要在吞噬细胞如巨噬细胞和中性粒细胞中特异表达 ,而 在绝大多数