全基因组范围内三个核心干性因子靶基因的预测分析

目录1. 引言31.1研究背景31.1.1 胚胎干细胞简介31.1.2 组蛋白修饰与ES细胞的多能性31.1.3 转录因子的调控41.1.4 胚胎干细胞分化的调控因子51.1.5 本论文的研究目的及其意义81.1.6 相关研究方法概述82. 实验过程92.1 实验数据的获取9 2.1.1 组蛋白修饰数据的获取9 2.1.2 转录因子位点数据的获取11 2.1.3 已分化的胚胎干细胞基因数据集9 2.1.4 基因及其靶位点数据集112.2 实验方法14 2.2.1 SVM概述14 2.2.2 GO分析15 2.2.2 ASPL分析152.3 实验步骤16 2.3.1 利用Chisq检验筛选有用特征17 2.3.2 通过SVM模型进行数据分类和筛选193. 结果与分析213.1 结果矩阵的特征分析21 3.2 Sox2、Oct4、Nanog靶基因在小鼠和人体内的比较223.3 Sox2、Oct4、Nanog靶基因的功能注释分析233.4 Sox2、Oct4、Nanog的KEGG信号通路的比较分析274. 参考文献 295. 附录33附录一: Fisher检验的R筛选43附录二: SVM的Matlab程序48附录三: GO分析程序43 附录四: ASPL分析程序436. 致谢5017全基因组范围内三个核心干性因子靶基因的预测分析摘 要：【目的】研究应用计算机技术对人类胚胎干细胞相关基因进行筛选、优化。【方法】通过收集已分化的胚胎干细胞基因序列、基因组序列、转录因子结合位点序列、组蛋白修饰序列4种数据集合，利用阳性数据集、通过SVM（支持向量机）模型，把整个基因组中组蛋白修饰数据和转录因子结合位点(TFBS)作为特征(Feature),三者的结合信息作为目标(Target)进行机器学习实验，并对靶基因做功能注释分析【结果】通过机器学习的方式，我们分别为Sox2、Oct4、Nanog找到了100、1013、110个靶基因,并且Sox2、Nanog靶基因的功能和当前研究所发现的功能基本吻合,只不过由于Oct4初始阳性数据量过少，靶基因寻找效果不太理想，还需要以后更多的实验提供充足的ChipSeq数据【结论】本论文的研究有力的说明了机器学习在生物信息领域不可替代的重要性,更为重要的是本论文肯定了当前一些对三个核心干性因子作用的预测研究，对该领域的发展起到了很好的促进作用。该方法具有较高的准确性，在保证对训练集合90以上的识别率的情况下。对测试集合的识别率达到80以上。关键词：转录因子；组蛋白修饰；SVM；靶基因1. 引言1.1研究背景1.1.1 胚胎干细胞简介 胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES细胞)是从附置前早期胚胎内细胞团(ICM)或附置后胚胎原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)隆出来的一种具无限增殖能力、保持正常的染色体核型和全向分化能力的干细胞1,2。ES细胞在体内、外正常分化的过程中, 能产生除滋养以的外胚层和原始内胚层外的内、中、外3个胚层的所有细胞类型。相比较其他多能成体干细胞而言, ES细胞是全能性细胞。胚泡注射后, ES细胞的衍生细胞分布到嵌合体动物的所有组织系统中, 包括生殖系。ES细胞衍生的生殖细胞能进行遗传物质的传递, 这一特性已被广泛应用于基因功能的研究。ES细胞进行对称性细胞分裂, 产生2个相同的多潜能性子代细胞, 这一特性称为ES细胞的自我复制或自我更新(self-renewal). ES细胞自我复制的同时伴随着细胞分化的抑制和多向发育潜能的维持, 这是ES细胞多潜能性的基础3。在体外，可以对ES细胞进行遗传操作选择，如导人异源基因、报告基因或标志基因，诱导某个基因突变，基因打靶或导人额外的原有基因使之过度表达(增加功能)等4。 自1998年人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)建系以来5-6，hESC迅速成为生命科学研究的热点，针对ESC分化相关的基因的研究成为核心问题之一。Es细胞在生命科学的各个领域都有着重要而深远的影响，尤其在克隆动物、生产转基因动物、细胞组织器官的修复和移植、细胞治疗、组织工程、发育生物学、药物的发现、筛选、动物和人类疾病模型上有着极其诱人的应用前景。科学家们已经开始对胚胎干细胞进行基因改造，将特殊改变的基因转导至胚胎干细胞中，体外选择后将胚胎干细胞导入机体，使胚胎干细胞中的遗传信息传达给子代7-9，这意味着将可以有针对性地改变人胚胎干细胞的遗传表型，可能有助于克服出生缺陷，纠正某些遗传性疾病，而且还可将胚胎干细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入，用于研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响等。如何应用计算机的方法来预测潜在的ES细胞分化相关基因，发现其中包含的信息，这对于功能基因的识别、基因工程等方面都具有非常重要的价值。1.1.2 组蛋白修饰与ES细胞的多能性表现遗传调控对于ES细胞的多能性维持以及无限增殖与自我更新具有重要意义，细胞通过染色质的结构修饰和改变对表观遗传进行调控，而染色质结构调控可以通过组蛋白的修饰来实现10。组蛋白有多种，大多数是由一球状区和突出于核小体外的组蛋白尾组成的碱性氨基酸组成。组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个分子形成一个八聚体，真核生物中的DNA缠绕于此八聚体上形成核小体。组蛋白H1结合于核小体之间的连接DNA上，使核小体一个挨一个，彼此靠拢。5种组蛋白(HI、H3、H2A、H2B和H4)中，除H1的N端富含疏水氨基酸，C端富含碱性氨基酸之外，其余4种都是N端富含碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)，C端富含疏水氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸)。在组蛋白中带有折叠基序(motif)的C端结构域与组蛋白分子间发生相互作用，并与DNA的缠绕有关。而N端可同其他调节蛋白和DNA作用，且富含赖氨酸，具有高度精细的可变区。组蛋白N端尾部的1538个氨基酸残基是翻译后修饰的主要位点，调节DNA的生物学功能11。 组蛋白的翻译后修饰不仅与染色体的重塑和功能状态紧密相关，而且在决定细胞命运、细胞生长以及致癌作用的过程中发挥着重要的作用12。组蛋白翻译后修饰包括甲基化与去甲基化、磷酸化与去磷酸化、乙酰化与去乙酰化、泛素化与去泛素化等13。 组蛋白甲基化表明染色质的失活而乙酰化则表明染色质的活化。ES细胞中的染色质常表现为基因转录活化的常染色质状态，乙酰化水平高；而与之相反，分化细胞，谱系不同乙酰化水平具有差异，但都表现出形成无转录活性的异染色质、乙酰化水平降低、甲基化水平升高等特点14。说明细胞的分化过程伴随着染色质状态的变化，细胞分化潜能的限制性标志是细胞基因组可塑性的降低，细胞特殊分化系谱的形成与新的可遗传基因表达程序的建立和染色质的重新定制有重要关系。 通过组蛋白修饰来改变染色质的活性影响和多能性相关的基因的表达从而影响ES细胞维持多能性是ES细胞保持多能性的关键机制之一。组蛋白H3是组蛋白的常见修饰位点，利用ChIP技术对ES细胞和多种不同的分化细胞进行分析，显示几乎所有具活性的基因其启动子都和多个组蛋白的修饰有关，比如：H3K4 me和H3K4Ac，而H3K36me3或者H3K9me3与失活的基因和其启动子相联系15。另外H3K27me作为一个染色质抑制的标记，经常和多种基因的启动子相联系并经常和染色质活性标记H3K4me一起出现，他们组成所谓的“双价体结构域 使基因保持处于“转录准备”状态。“双价体”模型典型地存在于发育调控基因中，在ES细胞等未分化状态的细胞中则处于沉默状态，分化过程中被激活16。 最近的实验证明不仅在ES细胞发育调控基因的启动子中存在“双价体”标记，也存在于分化的细胞中。启动子、增强子等处的组蛋白赖氨酸乙酰化使染色质激活而甲基化却会使染色质失活。通常H3K9me3和H4K20me3标记沉默的印迹基因、沉默的重复基因、非表达的假基因和着丝粒以及端粒等，H3K27me3标记组织特异性和发育调控的沉默基因17。在分化过程中双价体染色质的修饰平衡将发生改变，H3K4me修饰和H3K27me3修饰则大量沉默基因，而激活基因则很少被H3K4me修饰，这说明在分化过程中基因的失活和“双价体”染色质的修饰平衡有关18。Es细胞通过调控“双价体”的平衡实现对基因表达的调控，进而调控其多能性和自我更新。 此外，染色质的修饰还和转录因子表达激活与失活以及转录因子的结合相关。分化过程中，双价体允许重要的转录因子基因快速激活，表达分化调控相关的转录因子进而调节分化过程。基因组中的双价体结构域经常富含多能性相关转录因子的结合位点，比如，Oct4、Sox2、Nanog等重要的多能性相关转录因子。1.1.3 转录因子的调控 从病毒到人类，所有活的生物体都依靠转录机制表达基因组的特定部分，来应对环境或发育信号的改变，以此执行生命周期中的关键生物功能。因此，转录构成了一个调节生物过程的关键步骤，而且转录因子被认为是决定细胞命运的主开关。近年来，干细胞生物学的迅速发展，主要得益于若干转录因子功能的阐明，转录因子是干细胞多能性的主要调节者。转录因子Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和Myc已被证明具有将成体细胞重编程为具有多能性的细胞的神奇的力量转录因子往往与辅助因子和修饰分子采取一致行动来为响应发育或环境信号来打开或关闭下游基因的表达19。因此，大量的转录因子已被证明在发育过程中主要通过控制细胞类型特异性基因的表达，从而指定细胞的命运。ES细胞是研究细胞分化和相关转录因子生化分析的良好模型系统。1981年，埃文斯和考夫曼，以及马丁第一次从小鼠囊胚的内细胞团中分离出胚胎干细胞。他们设计出一些方法让这种细胞能无限增殖，使这些细胞具有多能性，因为它们可以在重新引入小鼠囊胚时形成嵌合体，并有助于形成包括生殖腺在内的所有组织。这项技术突破带来了利用同源重组的ES细胞产生基因敲除动物的基因打靶技术。1998年，homson等成功地分离出人类胚胎干细胞，这是一个具有划时代意义的突破，意味着干细胞技术可能最终造福于人类疾病的治疗。干细胞研究在过去十年内已经开始渗透到生物学和医学的许多学科中，这一趋势可能会继续，并冠以干细胞研究生物医学研究中心的称号。首先，包括胚胎干细胞和成体干细胞在内的干细胞，是再生医学的主角。再生科学被视为继药物治疗和外科手术后的第三代治疗方法。骨髓移植，通过更换病变的或有缺陷的造血干细胞，已经成功地治疗了多种疾病。第二，干细胞，尤其是胚胎干细胞，是基础研究领域如信号转导、发育和表观遗传学的理想模型。最后，干细胞可以成为药物筛选和安全评估的有用工具。尽管干细胞研究为我们带来了很多惊喜，但我们仍处于探索干细胞的早期阶段，包括干细胞在发育、疾病和再生等方面的分子水平机制我们仍然还不清楚。最新的关于调控胚胎干细胞多能性的分子机制的进展提供了一些关于转录因子如Oct-4和Nanog在维持胚胎干细胞的未分化状态方面的知识。1.1.4 胚胎干细胞分化的调控因子胚胎干细胞分化的调控是一个极其复杂的过程，是由多个因素组成的一个庞大的维持胚胎干细胞自我更新能力的调控网络，其中特异分子和各种转录因子的最终表达量是决定胚胎干细胞是否分化的关键因素。当各种因子分泌量达到相互平衡状态时，胚胎干细胞维持自我更新，但是如果其中一个或几个因子的表达量发生改变时，就会促使胚胎干细胞向某一特定方向分化20。目前研究主要集中在八聚体结合蛋白4、Nanog、SOX基因、白血病抑制因子等几条既平行又相互交错的通路所决定胚胎干细胞的自我更新。然而，近年来对一些多能性因子如Oct4、Sox2和Nanog的下游靶基因的研究表明，其可能正调控维持细胞全能、多能性状态所需基因的转录，或者可能负调控与体细胞分化有关基因的转录21。因此对多能性因子如Oct4调控下游靶基因的研究将有助于对其在分化发育中所起作用的进一步了解。除此以外，我们将转录因子的范围扩大到人类基因组的所有转录因子。1.1.5 本论文的研究目的及其意义 现阶段关于早期胚胎发育的分子机制的研究日趋白热化，调控早期胚胎干细胞分化的基因更是研究者重点关注的课题。而这些基因中的三个代表基因：OCT4、SOX2 和 NANOG在ESCs的多潜能性和自我更新能力方面发挥了重要作用。然而，已研究清楚的人类核心多潜能性因子(TFs)数量仍然十分有限。虽然通过统计我们知道核心多潜能性因子的总数达到了5000个，但这个数值仍小于人类核心多潜能性因子的理论值。本实验的目的在于筛选、优化出干细胞相关基因，发现其中包含的信息，其意义不仅在于此准确预测模型可应用到其他方面，还在于本实验为其他的相关生物领域研究提供了经可靠性打分的转录因子的靶基因，便于后续研究的进行。这对于功能基因的识别、基因工程等方面都具有非常重要的价值。1.1.6 相关研究方法概述本文研究了一种应用计算机技术对人类胚胎干细胞相关基因进行预测的方法。根据目的，我们把以转录起始位点(TSS)为中心，上下游-1000，+1000区间的范围作为转录因子靶基因的定义范围，以此为一个特征，组蛋白修饰是另外一个重要的特征。在不能确定阴性集的情况下，我们采用支持向量机(SVM)进行预测，此预测方法的特点是在阴性集缺失的情况下仍能够较准确地进行预测。其次分析了这些预测靶基因的功能相似性和接近度中心性。2. 实验过程2.1 实验数据的获取基于计算机的胚胎干细胞相关基因识别方法使用了3种数据集：已分化的胚胎干细胞基因数据集、基因及其靶位点数据集、转录因子结合位点数据集、组蛋白修饰数据集。 2.1.1 组蛋白修饰数据的获取数据集中的数据抽取自NCBI中GEO板块H9的组蛋白数据样本，网址为/geo/，得到Bed格式文件；也可以点击Web Link链接直接进入数据地图,在此地图中筛选H9的组蛋白修饰数据,以Bed文件的格式下载。2.1.2 TFBS数据的获取 打开UCSC,点击TableBrowser，按图1设置，点击下载(Group:regulation; track:TFBS Conserved) 图1.转录因子结合位点数据集搜集过程2.1.3 已分化的胚胎干细胞基因数据集打开/SyStemCell/other_browse.jsp网址，点击标题栏Browse，按图2设置，设置好筛选条件后点击mRNA and miRNA搜索目录的Browse，将出现图3页面，将页面内容存储到Excel中即可。 图2.胚胎干细胞基因数据集收集过程 图3.胚胎干细胞基因数据集2.1.4 基因及其靶位点数据集打开UCSC,点击TableBrowser，按图4设置，点击下载(Group:Genes and Gene Predictions;track:UCSC Genes) 图4.基因及其靶位点数据集搜集过程2.2 实验方法2.2.1 SVM概述由于本试验的阴性集确实，经过大量文献的查阅，基于SVM模型能够很好的解决生物数据中缺少阴性集而难以分类的问题，所以本论文采用基于M-C的SVM机器学习方法作为分类模型。利用组蛋白修饰数据和TFBS数据对目标靶基因进行分类。由于该方法需要有初始的阳性数据集和特征向量组成的特征矩阵,它的数据处理流程图如下: 图5 SVM模型的数据流程图首先，靶基因集合被称为POS。余下的所有基因除掉靶基因后构成MIX集合。其次，NEG集合是从MIX集合中随机抽取的，和POS集合元素数目相当的集合，以上为映射阶段。在收敛阶段,标签法运用了SVM核心，并且下载程序包LIBSVM(3.20, . w/cjlin/libsvm/)。在每一个循环开始前，我们从POS集合和NEG集合各抽取10%作为检验集合，从而检验模型的准确性。通过SVM模型可以直接对全部的MIX集合进行分类。然后被判断为阳性的元素标签加1，判断为阴性则标签没有变化。在一个实验中这个过程被循环10,000次。 2.3 实验步骤2.3.1 用Chisq检验筛选有用特征 首先利用Perl软件处理下载得到的转录因子位点数据，该文件包括285个转录因子结合位点序列，对文件中的数据进行如下相应的处理：只保留与基因相距1kb、2kb的转录因子结合位点。而不采用与其对应的转录因子名称来标识位点：删除具有相同定义的结合位点序列。处理后部分内容见如图6（行名是基因名称，列名是转录因子，数字代表两者在位点上的距离，将表中大于2的数字全部转化成0，构成一个新的只有0、1的矩阵）。再利用R语言中Chisq检验筛选有用特征。Chisq检验是一种利用在目标(Targrt)阴性数据集(neg)和阳性数据集(pos)中特征(Feature)分布情况(四联表格)，来衡量目标和参数是否存在非随机关系的一种算法。首先获取四联表，如图7.然后利用R语言内置的Chisq检验算法以p-value0.05为标准来筛选有用特征(Chisq检验筛选有用特征的程序R语言请参看程序一)。筛选出和ESC分化基因相关性显著的转录因子，由原始的258个筛选出来了91个（P值在0.05以下的为显著）,和ESC分化基因相关性显著的组蛋白修饰，由原始的26个筛选出来了17个。 图6转录因子位点数据集 图7.四联表数据 图8. Chisq检验后的数据2.3.2 GO分析Gene Ontology可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）三个部分。蛋白质或者基因可以通过ID对应或者序列注释的方法找到与之对应的GO号，而GO号可对于到Term，即功能类别或者细胞定位。 功能富集分析: 功能富集需要有一个参考数据集，通过该项分析可以找出在统计上显著富集的GO Term。GO分析根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同GO 分类中某（几）个特定的分支的超几何分布关系，GO 分析会对每个有差异基因存在的GO 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该GO 中出现了富集。 GO 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的GO 分析，可以找到富集差异基因的GO分类条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功能的改变有关。 2.3.3 ASPL分析2.3.2 通过SVM模型进行数据分类和筛选将筛选后的有用特征与其对应的特征数据集组成新的表格，导出数据为为TXT格式，供程序调用。运行程序后，最终会到处四个Excel表格，如图9.表一是依据靶基因4. 参考文献1华进联,窦忠英,李橙等胚胎干细胞研究进展,中国科学基金,2000,(2):67-712 Donovan P J, Gearhart J. The end of the beginning for pluripotent stem cells. Nature, 2001, 414(6859): 92973Burdon T, Smith A, Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. 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