上海交大网络课程检验微生物讲义15.doc

第23章 病毒感染的实验诊断一、 教学大纲要求（1）标本的采集、处理与运送注意事项（2）病毒形态学检查方法（3）病毒的分离与鉴定程序及方法（4）病毒感染的快速诊断方法二、 教材内容精要（一）标本的采集、处理与运送根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70低温冰箱内保存。（二）病毒形态学检查1.光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。2.电子显微镜检查法（1）电镜直接检查法 某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。（2）免疫电镜检查法 将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。3.超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。4.超速离心法根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。5.X线晶体衍射法根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，可用于无包膜病毒的研究。（三）病毒的分离与鉴定1.病毒分离培养实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。2.病毒在培养细胞中增殖的指标 （1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。（2）红细胞吸附（3）干扰现象 （4）细胞代谢的改变 3.新分离病毒的鉴定（1）病毒核酸类型的测定 用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。（2）理化性状的检测 对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH35环境中很快被灭活，故可将两者相区别。（3）血清学鉴定 病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。（四）病毒的血清学检测血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。1.中和试验中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。2.补体结合试验特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较中和试验低，但补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。主要用于流行病学调查；病毒病的诊断；疫苗使用后人群抗体情况调查；检测病毒抗原；鉴定病毒属。3.血凝及血凝抑制试验血凝试验和血凝抑制试验为型特异性反应，其原理为某些病毒或病毒血凝素能选择性地引起个别种类的哺乳动物的红细胞发生凝集，当加入相应的特异性抗体时，这种凝集现象即被抑制。主要用途为发现与鉴定病毒；诊断病毒病；病毒分型；免疫机体后抗体效价的测定；浓缩病毒；病毒抗原分析（某些病毒可用交叉血凝抑制试验分析抗原成分）；病毒株变异相的测定等。4.凝胶免疫扩散试验以半固体琼脂糖为支架所进行的抗原、抗体的沉淀反应。本方法简便，特异性与敏感性均较高，而且衍生出对流免疫电泳和火箭电泳等更为敏感的检测技术。此法在病毒性疾病中主要用于诊断HBV与乙型脑炎病毒等感染。（五）病毒的分子生物学检测1.分子杂交技术分子杂交是利用放射性核素或非放射性核素标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有相同序列的目的核酸，常用的杂交方法：（1）斑点杂交 （2）固相杂交技术 （3）原位分子杂交 （4）Sorthern印迹 （5）Northern印迹 （6）分支DNA技术 2.聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）PCR是一种选择性体外酶促扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。 常用技术有：（1）巢式PCR （2）半巢式PCR （3）逆转录PCR（RT-PCR） （4）多重PCR （5）原位PCR （6）定量PCR(7)RNA捕获 (8)免疫PCR 3.凝胶电泳技术核酸和蛋白质等生物大分子的分子量大小、所带电荷等存在差异，使其在电场中表现为泳动速度的不同，在介质中形成各自不同的条带，而使其分离开。凝胶电泳技术是常用的分离鉴定核酸、蛋白质等生物大分子方法之一，可直接用于如轮状病毒、呼肠病毒等病毒的检测和病毒PCR产物检测等。凝胶电泳根据所用载体不同又可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，根据电泳槽不同可分为圆盘电泳、垂直板电泳和水平电泳，前者已很少被使用。（1）琼脂糖凝胶电泳 是以琼脂糖作载体，常采用水平电泳分离、鉴定核酸。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 用于蛋白质和分子量在1kb以下核酸分离鉴定，分连续和不连续电泳。（六）病毒感染的快速诊断1.形态学检查2.病毒抗原的检测（1）免疫荧光技术 直接对标本或接种的组织培养进行早期抗原检测，可用标记荧光素的特异抗体直接从标本中检查病毒抗原（直接法），也可用未经标记的特异抗体先与标本中可能存在的抗原结合，然后加入荧光素标记的抗特异性抗体的免疫血清（一般为IgG型的抗体），使荧光抗体与特异性抗体结合，以检测标本中已与特异抗体结合的病毒抗原（间接法）。此法检测迅速、特异性高，但需有荧光抗体及荧光显微镜等设备。（2）固相放射免疫测定 首先将特异性抗体吸附到微量反应板孔底部的塑胶小球或其他固相系统上，与待检的病毒抗原结合，洗涤后再加标记放射性同位素的特异性抗体，做成标记复合物，用-计算器检测。（3）酶免疫技术 此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法（ELISA）。前者又称免疫过氧化物酶染色，用酶标记的特异性抗体直接检测标本中的抗原，此法不仅能定性抗原，并能在显微镜下观察其定位和分布情况；ELISA是用酶标记的抗体或抗抗体来检测标本的病毒抗原或血清抗体。酶标抗体可被待检的抗原抗体固定在微孔反应板上，当加入的酶作用底物后则出现底物被酶分解的显色反应。此法克服了固相免疫法的缺点，其试剂安全、易保存、操作简便，而且其敏