干血片苯丙氨酸荧光测定及质控PPT课件

.,1,干血片苯丙氨酸荧光测定法,佛山市新生儿疾病筛查中心刘海平,.,2,一、苯丙酮尿症筛查的实验方法,自从1934年挪威Folling报告苯丙酮尿症（PKU）后，实验检测方法也越来越多，越来越先进，最早的是1961年美国的Guthrie建立的三氯化铁试验。,.,3,一、苯丙酮尿症筛查的实验方法,目前用于PKU筛查的方法主要有：1.细菌抑制法2.荧光分析法3.酶法4.高效液相色谱法5.氨基酸分析法6.高效毛细管电泳法目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是细菌抑制法和荧光分析法。我们省大都使用荧光分析法。,.,4,苯丙氨酸荧光测定法,.,5,一、原理,.,6,1、原理,苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和Robins在1962年建立的测定法，故又称McCaman和Robins法。四十年来不断改正和完善，现已有专门的荧光检测仪及相配套的试剂盒。它比细菌抑制法更灵敏、更快速、操作更方便。绝大多数国家和地区使用此方法，并延续至今。,.,7,1、原理,从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。,苯丙氨酸,茚三酮,荧光化合物,.,8,1、原理,加入二肽L亮氨酸L丙氨酸后可大大提高此荧光反应。,用琥珀酸盐缓冲液严格控制反应条件pH值在5.8土0.1，可保证理想的荧光值和最大的特异性。,荧光化合物,L亮氨酸L丙氨酸,荧光化合物,.,9,1、原理,加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应，在485nm波长处测定荧光强度。激发光波长390nm。其苯丙氨酸含与荧光强度成正比，即苯丙氨酸含量越高荧光强度则越强，通过检测已知浓度的标准血斑的荧光值并绘制曲线则可求得各样本的苯丙氨酸浓度。,.,10,2、特点,：荧光物质苯丙氨酸茚三酮复合物，吸收特定波长（390nm）的光能后，发生原子重排，同时发射出波长（485nm）更长的光。,激发光波长390nm,发射光波长485nm,荧光化合物,.,11,2、特点,荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠，批内和批间变异系数(CV)均小于10。商业试剂盒的苯丙氨酸检测低限为0.5mg/dl(30umol/L)。血胆红素浓度小于200umolL时对实验结果无干扰。,.,12,2、特点,通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨基酸的干扰。在pH5.8土0.1条件下，L甲硫氨酸、L半胱氨酸、L谷氨酸、L组氨酸、L亮氨酸和L甘氨酸对L苯丙氨酸含量的测定无影响。然而在高pH，例如pH6.5条件下，其他氨基酸均会产生干扰，荧光强度明显减低。,L甲硫氨酸L半胱氨酸L谷氨酸L组氨酸L亮氨酸L甘氨酸,茚三酮,无荧光反应,PH5.8土0.1,.,13,2、特点,各种改进后的荧光测定法（McCaman和Robins法）已广泛用于血清和干血滤纸标本中的苯丙氨酸定量测定。由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代微量反应板的荧光测定法（McCaman和Robins法）测定干血斑中苯丙氨酸含量的方法，适用于大规模新生儿疾病筛查。,.,14,二仪器和试剂,.,15,1、仪器,荧光读数仪,孵育振荡仪,自动洗板仪,3mm打孔器,单道加样器,八道加样器,电脑显示屏,.,16,1、仪器,、荧光读数仪；、孵育振荡仪；、3mm打孔器，或打孔钳；、加样器；八道加样器。以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。、3mm实验血片塑料支架；、电脑、打印机；、冰箱。,.,17,2、试剂,（1）琥珀酸缓冲液,（2）L-亮氨酸L丙氨酸溶液,（3）水合茚三酮,铜试剂（4）,标准品（5）,质控品（6）,白色酶标板（7）,酶标板覆盖物,芬兰Labsystems苯丙氨酸荧光测定法试剂盒，包含如下物品：,.,18,2、试剂,琥珀酸缓冲液（1）：pH5.8土0.1，加入0.05Bronidoxe(作为防腐剂)；,.,19,2、试剂,.L-亮氨酸L丙氨酸溶液（2）：加入0.05Bronidoxe(作为防腐剂)；,.,20,2、试剂,.水合茚三酮（3）：水合茚三酮溶液；,.,21,2、试剂,.铜试剂（4）：无水硫酸铜、酒石酸钠钾和碳酸钠溶液；,.,22,2、试剂,.标准品（5）：含5种不同苯丙氨酸浓度(mg/d1)的干滤纸标准血斑。存于装有干燥剂的铝箔袋中；,.,23,2、试剂,质控品（6）：含有2个质控品的l张滤纸，存于装有干燥剂的铝箔袋中；,.,24,2、试剂,白板（7）：白色板(12*8孔)。平底，聚苯乙烯；酶标板覆盖物：在保温和洗脱期间均使用塑料薄膜将板覆盖；,.,25,2、试剂,质控品和标准品的苯丙氨酸浓度数值的卡片及说明书；,.,26,标准品和质控物(品)具有批号特征性。确切值需参照每一试剂盒中校正品的记录单。校正品由血细胞比容为50一54的人血液制备。80%分析纯无水乙醇（自配）,2、试剂,.,27,三、实验操作,.,28,3实验操作步骤,(1)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、质控、复查标本、重查标本及常规标本的卡片号用不同的颜色写在操作卡，看上去一目了然，严防打孔时张冠李戴。,.,29,试剂批号：85ZE1B-1标准浓度：0.4、2.4、4.7、10.0、20.0。质控批号：85ZE1B-1范围：高值：4.7-8.7，中值6.7。低值：1.5-2.8，中值2.1。,佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡检测项目:PKU检测时间:2003年11月11日操作者：,.,30,3实验操作步骤,(2)对照实验操作卡用打孔器在滤纸上围绕血斑园心与边缘的中点打下直径3mm的标准品和质控物(双孔)、复查和标本(单孔)，并依次放置到洁净的白色板孔内。(3)每孔加入80ul的80乙醇溶液，用塑料粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转分)30分钟。,.,31,3实验操作步骤,(4)用多道加液器转移50ul洗涤液至另一块白色酶标板内。如果采用塑料血片支架打孔，则洗脱30分钟后将血片与支架一起去除即可，无须移液。,.,32,3实验操作步骤,(5)配制反应混合液，如下表：,（单位ml）,.,33,3实验操作步骤,(6)加50u1反应混合液，用塑料粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转分)1分钟在+60保温60分钟或+37保温120分钟,一定要密封好！,.,34,3实验操作步骤,(7)每孔加200ul冷的(直接从冰箱中拿出)铜试剂，用来冷却反应混合物至室温。(8)室温保温15分钟。(9)加入铜试剂后1530分钟内，检测每孔的荧光值。发射波长485nm，激发波长390nm。,.,35,PKU实验操作流程,检测,加铜试剂200l,65孵育1h,打孔,加80%乙醇,移液50l至另一白板内,加50l反应混合液,振荡30分钟,.,36,四、结果判断,.,37,4结果判断,(1)利用电脑酶标工作软件（荧光仪配有），自动处理绘制标准曲线(标准品)，计算标本的苯丙氨酸的浓度，判断结果。,.,38,4结果判断,(2)手工计算：在绘图纸上绘制标准曲线，纵坐标为荧光值，横坐标为标准品苯丙氨酸的浓度；从标准曲线上读取质控和标本的苯丙氨的浓度。质量控制值：每套试剂盒内都有一份质控的期望值；,.,39,4结果判断,临界值：正常人血苯丙氨酸浓度2mgdl。高于或接近临界值的标本需复测。建议每个实验室设定自己的临界值。,一定要质控在控才发报告！否则要查出原因重做实验！,.,40,5、注意事项,.,41,5操作注意事项,(1)仔细阅读试剂盒使用说明书。(2)标准品和质控物(品)包装一旦开启后，必须密封置28，干燥剂应是蓝色的。如变色应放烤箱烤干后再用。(3)建议每一块板都使用标准品和质控物(品)，因为标准品、质控物(品)和未知标本的荧光值可能是变化的。,.,42,5操作注意事项,(4)延长洗脱血斑中苯丙氨酸的时间，不影响检测结果，但应考虑80乙醇蒸发的可能性。(5)